Protocol
Animal brug og velfærd bør holde sig til NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr følgende protokoller anmeldt og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Mus vævsprøver blev leveret af samarbejdspartner Dr. Chuanbin Mao.
1. Mus vævssnit Fremstilling
- Placer en hel mus organ af interesse (hjerne, nyre, lever, etc.) ind i centrum af en lille plastbrønd (f.eks 12 cellekulturplade plade), og nedsænkes i væv indlejring forbindelse op til ca. 10 mm højde. Kontroller, at der ikke er nogen boble dannes i vævet indlejring forbindelse og at organet er placeret i den ønskede orientering (dvs. sagittal, coronal, etc.).
- Umiddelbart placere væv i flydende nitrogen i flash frysning. For langtidsopbevaring, opbevare frosne prøver i en -80 ° C fryser.
- Tag den frosne mus orgel og tø til -15 ° C i en tempere kontrolleret cryomicrotome.
- Sikker væv på en stål base med omkring 500 pi væv indlejring sammensatte og placere på en cryomicrotome sektionering montere, så den ønskede sektionering orientering præsenteres for kniven.
- Afsnittet vævet til en 12 um tykkelse. Placer sektionerede vævssnit på polycarbonat objektglas og lad det tørre i 30 minutter ved stuetemperatur. For langtidsopbevaring, gemme den frosne dias i en -80 ° C fryser.
2. Celledyrkning
Bemærk: Celledyrkning blev udført i biologisk sikkerhedsskab (Biosafety Level II) under sterile betingelser. HeLa-cellelinien blev anvendt som et modelsystem, og cellerne blev dyrket i komplet dyrkningsmedium med følgende konventionelle protokoller:
- Varm reagenser (dvs. trypsin, phosphatbufret saltvand (PBS), og celledyrkningsmedium) til 37 ° C.
Bemærk: Celledyrkningsmediet indeholder uorganisk salts, aminosyrer, vitaminer og andre. For en komplet liste over bestanddele, henvises til formuleringen fra producenten. - Opnå celleprøve (fx 1 ml HeLa cellesuspension) og tilføje den til 9 ml komplet celledyrkningsmedium i en standard 10-cm cellekultur plade. Det oprindelige celletal er omkring 0,5 x 10 6 celler / ml. Holde celler i kultur ved 37 ° C med 5% CO2 i 2-3 dage, indtil den voksende overflade er dækket ved 70-80% på celledyrkningspladen. Optag celle passage nummer for hver efterfølgende runde.
- Udfør celle passage (dvs. celle opsplitning) i celledyrkningspladen.
- Aspirer vækstmedium og anvende 5 ml 1x PBS til skylning af cellerne. Fjern PBS under anvendelse af en steril aspiration tip, og inkubere cellerne med 2,5 ml trypsin (0,25%) for ~ 5 min ved 37 ° C for at løsne cellerne fra kulturen pladen.
Bemærk: Den egentlige trypsin behandlingstid skal optimeres i henhold til den specifikke trypsin product købt fra fabrikanten. Utilstrækkelig behandlingstid efterlader cellerne fastgjort til pladen, hvorimod overdreven behandling fører til celledød. - Stop trypsinaktivitet ved tilsætning 7,5 ml komplet celledyrkningsmedium, og derefter ensartet resuspender cellerne (totalt volumen 10 ml). Brug cellesuspensionen for kultur (trin 2.2) eller tilberedning af SCMS prøver (trin 2.4).
- Aspirer vækstmedium og anvende 5 ml 1x PBS til skylning af cellerne. Fjern PBS under anvendelse af en steril aspiration tip, og inkubere cellerne med 2,5 ml trypsin (0,25%) for ~ 5 min ved 37 ° C for at løsne cellerne fra kulturen pladen.
- Forbered celleprøver for SCMS eksperimenter.
- Placere individuelle mikro dæksel vipper i en plade med 12 brønde, og der tilsættes 1,8 ml celledyrkningsmedium og 0,2 ml cellesuspension i brønden.
- Bland forsigtigt celler med mild omrøring af pladen, og inkuber i et 5% CO2 miljø ved 37 ° C i ~ 24 timer. For at udføre medicinsk behandling til de dyrkede celler, tilføje en lægemiddelforbindelse opløsning (fx i DMSO (dimethylsulfoxid)) i 12-brønds celledyrkningsplade.
Bemærk: Koncentrationen endelige lægemiddel (fx 10 nM, 100 nM, 1 uM og 10 uM) og tEHANDLING tid (fx 4 timer) er forskellig alt efter det specifikke formål undersøgelser. Celler er knyttet til mikro dækslides og klar til de fælles sikkerhedsmetoder eksperimenter (trin 6).
3. Single-sonde Fabrication
- Placer dobbelt boring kvarts rør (indre diameter (ID) 127 um, ydre diameter (OD) 500 um) i en laser mikropipette aftrækker og træk en dobbelt boring kvarts nål. Brug følgende parametre som udgangspunkter: Heat = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150, og Pul = 250 (alle enheder er producentens enheder). Sørg for trukket dobbelt boring kvarts nål har en tilspidset spids for optimale probe egenskaber. Skær løftes spidsen, så der er ~ 5 mm lang af unpulled dobbelt boring kvarts kapillær venstre ved den anden ende.
Bemærk: Den egentlige parametre for laser aftrækker bør optimeres i henhold til de særlige forhold i instrumentet. - Skær en sektion af smeltet silica kapillær ~ 80 mm (ID 40 um, OD. 105 um) som opløsningsmiddel giver kapillær, og sæt det i en boring ved den flade ende af dual-boring kvarts nål.
- Skær en ~ 40 afsnit af kvartsglas kapillar (ID 40 um, OD 105 um) mm og bruge en barbermaskine til barbering ~ 5 mm af polyimid belægning fra midtpunktet. Brug en propan flamme til hurtigt at varme og træk smeltet kapillær ind i et nano-elektrospray (ESI) emitter med en fin tilspidsning. Skær et nano-ESI emitter (~ 7-10 mm lang), og sæt den ind i den anden boring på den flade ende af dual-boring kvarts nål. Alternativt kan du bruge laser aftrækker til at producere en fin tilspidsning.
- Påfør en minimal mængde (~ 1-2 pi) UV hærdende harpiks på den flade ende af den dobbelte boring kvarts nål, og størkne harpiksen under anvendelse af et LED-UV-lampe for ~ 20 sec at fastgøre opløsningsmidlet tilvejebringe kapillar og nano- ESI emitter. Procedurerne til at samle de enkelte dele i en enkeltstrenget probe er vist i figur 1a.
- Skær en standard mikroskop glass slide (1 "x 3") i halve på langs. Placer single-probe på den ene ende af objektglasset, således at nano-ESI emitter peger udad. Anvender den normale epoxy til kroppen af den enkeltstrengede probe, således at den bliver fastgjort på objektglasset (figur 1b). Lad natten til hærdning. Par den fremstillede enkelt-probe med den integrerede single-probe opsætningen (figur 1c), som er fastgjort til et massespektrometer som illustreret i figur 1d.
4. Byg den integrerede Single-sonde MS Setup
- Modificere ionkilden grænsefladen flange af massespektrometer og fabrikere standeren (med justerbar position og højde) af digitale stereoskop (figurerne 1e og 1f).
- Bor en ion kilde grænseflade flange med to huller giver mulighed for fastgørelse af en aluminium optisk bord. Foretag en glideskinne enhed og en højdejustering stang (knyttet tilen XY-scene for fine position tuning), således at det digitale stereoskop systemet kan fastgøres til aluminium optiske plade (figur 1e).
- Fastgør det modificerede digital stereo mikroskop, en USB digital mikroskop, en miniature manual XYZ oversættelse scenen med en fleksibel klemme holder, den motoriserede XYZ oversættelse fase-system til aluminium optisk bord, som er monteret på den tilpassede ion kilde grænseflade flange af massespektrometer (figurerne 1c og 1f). Brug den fleksible klemme indehaveren til at fastsætte objektglasset fastgjort med en enkelt-sonde.
- Fastgør single-sonde setup til massespektrometer (figur 1f). Juster fleksible klemme indehaveren og miniature XYZ stadium at placere emitter af den enkeltstrengede sonde foran indløbet af massespektrometeret. Brug det digitale USB mikroskop (med justerbar synsvinklen) på siden af single-sonde til at levere en zoomet-in billede af single-probe tip eller nano-ESI emitter, og den digitale stereoscope (med justerbar højde) over den single-sonde for at se cellerne og sondens spids.
Bemærk: Brug af tilsvarende ion kilde flange, kan denne integrerede single-sonde systemet være koblet til andre typer massespektrometre udstyret med omgivende ionisering kilder.
5. Ambient MSI
- Optø afsnittet prøven ved stuetemperatur og lægges på den motoriserede XYZ oversættelse trins system under single-probe. Juster prøven position ved at ændre koordinaterne i styresoftware.
- Brug af sprøjten at pumpe prøveudtagning opløsningsmiddel ved en passende hastighed (fx 0,2 pl / min), og anvende ionisering spænding (f.eks 5 kV). Udvælgelsen af prøveudtagningen opløsningsmiddel er fleksibel, og de fælles dem omfatte MeOH: vand (9: 1) og acetonitril. De døde volumen af nano-ESI emitter blev anslået til at være ~ 3 nl, og tiden mellem sonden-Surface kontakt og ionsignal observation er sædvanligvis mindre end 1 sek 15.
Bemærk: Den tilpassede ionkilde grænseflade flange tillader ionisering spænding, der skal afgives fra massespektrometeret til et ledende union gennem et krokodillenæb. Den ionisering spænding overføres derefter gennem en ledende union til opløsningsmidlet inde i kapillære og enkelt probe kanaler, og anvendes på nano-ESI emitter at ionisere de analytter stikprøven. Sørg for, at ionisering spændingen er slukket, når du tilslutter krokodille klip med den ledende union. - Justere højden af den enkeltstrengede probe, således at den hviler lige over overfladen af prøven og i stand til at udføre overflade-ekstraktion af metabolitter. Løft forsigtigt Z-scenen, og derefter bruge den digitale USB mikroskop (på siden af enkelt-probe) til at overvåge afstanden skift mellem enkelt-sonden og vævet overflade. Overvåge ændringer i massespektret under denne højdejustering, og stoppe elevatorening Z omgange ved observeres en ændring af ionen signalet fra opløsningsmiddel baggrund til væv metabolitter.
- Gentag trin 5.3 tre gange for at indstille tre forskellige punkter inden scenen styreprogram til automatiseret overflade udfladning justering. Placér spidsen af den enkeltstrengede sonde ved tre punkter på prøveoverfladen i en afstand på ca. 10 mm fra hinanden. Udfør højdejustering ved at trykke på op og ned ikoner, og lås de tre punkter i position under "Plan metoden".
- Indstil andre parametre for rastering hele afsnit af interesse i prøven ved hjælp af dette program. For mus nyre sektioner præsenteres her, bruge en 10,0 um / sek rastering hastighed og 20 um afstand mellem linjerne. Den motoriserede trin system har en 0,1 um minimum tilvækst bevægelse. Afstanden mellem den enkeltstrengede probe spids og væv opnået fra trin 5.3.
- Opsætning af en fremgangsmåde til automatiseret erhvervelse af MS-spektre fra massespektrometeret. for høj masse opløsning MSI på mus nyre prøve, bruge følgende parametre: masse opløsning 60.000 (m / AM), ~ 5 kV positiv tilstand, 1 Microscan, 150 ms max injektion tid, og AGC på. Alle erhvervede MS spektre repræsenterer individuelle linjer af MS billedet havde samme antal scanninger med ensartet tid afstand mellem hver scanning, hvilket indikerer, at pixel størrelser for de billeder, som frembringes ensartet fordelte.
- Indled købet MSI data. Indlede MS erhvervelse sekvens for massespektrometret, og derefter indlede rastering sekvens for XYZ kontrolprogram.
- For eksempel i MS datafangst program anvendes her, gå til "Sequence setup", vælg "Ny sekvens", generere et sæt filer til en ny sekvens nummereret fra 01 til X, hvor X er antallet af linjer, der anvendes til ønskede MS billede, der skal træffes, og tryk derefter på "Kør sekvens".
- Brug en hjemmelavet elektronisk anordning, så softwaren til frembringelse af et contact lukning signal til massespektrometer til at indsamle data. Kredsløbsdiagram den er vist i den supplerende figur (fig S1) som reference.
- Construct MS billeder fra rå MS filer ved hjælp passende MSI visualisering software. For eksempel, når du bruger softwarepakken udviklet af Laskin gruppe på PNNL 17, udføre følgende trin.
- Klik på "Brows File". Vælge den første fil opnået fra MSI eksperimentet. Angiv hvor filen starter og slutter under "Antal Lines." Vælg en række m / z-værdier for MS billedet rækkevidde under "Enter MZ Range".
- Tryk på "Start" knappen for at starte oprettelsen billedet processen. Når MS billedet er lavet, klik på "Gem billede" under "Toolbar" for at gemme billeder i computeren.
6. In situ Levende SCMS
- Opsætning single-sonde system pr instruereioner til MSI. Juster opløsningsmiddel (f.eks, MeOH / H2O eller acetonitril) strømningshastighed (f.eks ~ 25 nl / min).
- Vask de dyrkede celler, som er knyttet til de mikro dækning objektglas, med PBS for at fjerne kulturelle medier og ekstracellulære narkotika komponenter. Placer celle indeholdende objektglas på det motoriserede XYZ oversættelse trins system for eksperimentet.
Bemærk: Alternativt kan du bruge frisk celledyrkningsmedium (uden at indeholde føtalt bovint serum) at skylle dyrkede celler. Mindre ion undertrykkelse er blevet observeret. Derudover kan cellen overlever i længere tid i løbet af eksperimentet, hvor omgivelsestemperaturen (~ 20 ° C) er signifikant lavere end kulturen temperatur (37 ° C). Det stof type, løsning koncentration, og behandlingstiden varierer i forskellige undersøgelser. - Fokuser digital stereo mikroskop (over prøven) på spidsen af single-sonde til at overvåge celle penetration under analysen. Brug det digitale USB mikroskop (på side af en enkelt probe) at overvåge arbejdsvilkårene for den nano-ESI emitter på single-sonde.
- Brug det motoriserede XYZ fase kontrolprogrammet og digital stereomikroskop (ovenfor celler) for at finde en celle af interesse og præcist at placere single-sondespidsen over prøven. Start MS datafangst før den enkeltstrengede probe spids indsættes i cellen.
- Brug følgende parametre som referencer for MS-analyse ved hjælp af en høj opløsning massespektrometer: masse resolution 100.000 (m / AM), ~ 3 kV positive og negative tilstand, 1 Microscan, 150 ms max injektion tid, AGC tilstand på. Automatiseret køb af MS spektre gøres ved at klikke på "Start" i MS datafangst program.
- Løft motoriseret Z-trin ved at klikke på ikonet for at trænge ind i cellemembranen og holde optagelse MS signal genereret fra cellen. En tidsforsinkelse på 1-2 sek sædvanligvis observeres mellem proben indføring og signal detektion MS. Som den anden bekræftelse afcellepenetration, en dramatisk ændring af MS-signaler kan observeres ved indtrængningen af cellemembranen. De MS signaler af intracellulære forbindelser normalt kan vare i ~ 15-20 sekunder før et signifikant fald.
- Lavere ned cellen med pladen for at trække den enkeltstrengede probe spids ud fra cellen. Det tager normalt <15 sek for ion signaler af de cellulære forbindelser at nærme støjniveauet. Lad opløsningsmidlet flow for ~ 3 min til helt skylle single-sonde. I mellemtiden placere motoriserede XYZ trins system til at finde den næste celle, der skal analyseres. Hver celle eksperiment kræver ~ 3 min skal udføres.
Representative Results
Den fælles-sonde med succes anvendt til den omgivende MSI analyse af sektioneret mus nyrevæv 15. Enheden anvender mekanismen i overfladen flydende mikro-ekstraktion (figur 1a), som giver meget effektiv analyt ekstraktion fra et lille område, hvilket fører til rigelige ion signaler intensiteter i MSI resultater. For eksempel har de signalintensiteter på mere end 10 7 opnået for nogle rigelige metabolitter (figur 2A). Blev påvist Et stort antal metabolitter på denne måde, herunder en række sphingomyelin (SM) og phosphatidylcholin (PC) arter såsom [SM (34: 1) + Na] + (725,5575 m / z), [PC (32: 0) + H] + (734,5700 m / z), [PC (34: 1) + Na] + (782,5696 m / z), og [PC (38: 5 + Na)] + (814,5726 m / z). Disse forbindelser blev identificeret med høj masse opløsning og masse nøjagtighed, når koblet toa høj opløsning massespektrometer. For eksempel blev identifikationen opnås med mindre end 4 ppm m / z masse nøjagtighed (dvs. forskellen mellem de observerede og teoretiske værdier) for hver metabolit (figur 2b) i resultaterne præsenteret her. Derudover tandem MS-analyser (dvs. MS / MS) blev også udført for mere sikker identifikation af arter af interesse. 15
På grund af evnen til at udføre en effektiv flydende mikro-udtræk på et lille område, kan den enkelt-sonde enhed bruges til at udføre høj rumlig opløsning MSI eksperimenter under omgivende forhold 15. For eksempel har detaljerede MS billeder af muse nyresektioner blevet opnået illustrere udbredelsen af udvalgte metabolitter (figur 2C). Den rumlige opløsning af MS billede blev bestemt til at være 8,5 um, efter udbredte metriske for at have transiti. på punkt af en skarp funktion bestemmes inden for en 20-80% intensitetsændringsområde af MS-signalet 18 I tilfælde af phospholipid [PC (38: 5 + Na)] + på musen nyre afsnittet funktionen overgangen mellem den indre medulla og den ydre medulla sker på tværs én scanning cyklus i chronogram, der viser en intensitet er ændret med mere end 20-80% interval. Baseret på prøven bevægelseshastigheden (10,0 um / sek) og MS erhvervelse datahastighed (0,85 sek / spektrum), prøven bevæger afstand i en MS scanning cyklus (8,5 um), dvs. MSI rumlige opløsning, kan beregnes (figur 2d). Denne rumlige opløsning er blandt de højeste endnu opnået for omgivende MSI teknikker udført på biologiske prøver.
For SCMS single-sonden var i stand til at opnå den analyse af de enkelte levende HeLa celler 16. Spidsen størrelse af en enkelt probe er typisk mindre end 10 um (figure 3a), som er lille nok til at blive direkte indført i mange typer eukaryote celler, hvoraf diameteren er ~ 10 um, til ekstraktion og MS-analyse. Indsættelsen Fremgangsmåden ifølge den enkeltstrengede probe spids ind i en celle kan visuelt overvåges ved hjælp af en digital stereomikroskop (figur 3b), og cellemembran penetration den kan bekræftes ved en hurtig og væsentlig ændring af massespektre fra PBS (eller frisk cellekultur medium) til intracellulære forbindelser (fig 3c og 3d). kan udføres Forsøgene i både positive og negative ion modes at opdage bredere typer af molekylære arter. For eksempel blev 18 forskellige lipidarter identificeret i positiv modus, herunder sphingomyeliner (SM) og phosphatidylcholiner (PC), hvorimod adenosin phosphater (AMP, ADP, og ATP) blev påvist i den negative ion-mode (fig 3c og d). Den tidsforsinkelse mellem single-sonde indsættelse into en celle og detekteringssignalet var typisk mindre end to sekunder, hvilket tillader en næsten tidstro detektion af cellulære metabolitter. SCMS blev også anvendt på forsøg, hvor celler blev behandlet med lægemidler mod cancer (f.eks OSW-1, paclitaxel, og doxorubicin) 19]. De tilsvarende lægemidler kan detekteres inden HeLa-celler efter 4 timers behandling ved en række koncentrationer (dvs. 10 nM, 100 nM, 1 uM og 10 uM) i DMSO (dimethylsulfoxid), ved anvendelse af de ubehandlede celler (tilføj DMSO kun ) som kontrollerne. De MS signaler af narkotika ikke var til stede i det ekstracellulære PBS eller kontrol (figur 3e), men blev påvist inden for de enkelte celler under anvendelse af enkelt-probe MS-teknikken (kun 100 nM behandlingsresultater er vist i figur 3f). Fordi celler blev skyllet med PBS (eller frisk celledyrkningsmedium) for at fjerne ekstracellulære forbindelser og forureninger, påvisning af endogene metabolitter (f.eks celle lipider and adenosin fosfater) og eksogene forbindelser (f.eks anticancer lægemidler) indikerer, at Single-sonde MS teknik kan bruges til at analysere intracellulære forbindelser.
Figur 1. Fabrikation og opsætning af single-sonde til omgivende MSI og SCMS analyse. A) Fabrication procedurer single-sonde. B) fotografi af en fabrikeret enkelt sonde fastgjort til en glasplade. C) fotografi af den enkelt- probe setup fastgjort til et massespektrometer. d) Diagram af opsætningen single-probe koblet med et massespektrometer. Under et eksperiment, er prøvetagning opløsningsmiddel kontinuerligt billede fra sprøjten, er ioniseringen spænding til ledende union fra massespektrometeret, er to digitale mikroskoper anvendes til at overvåge prøve placering, det motoriserede XYZ stadiumSystemet anvendes til at styre prøve bevægelse, og et massespektrometer anvendes til analyse. e) Fotografi af den tilpassede digitale stereoscope system. f) fotografi, der viser den digitale stereoskop fastgjort til ionkilden grænsefladen flange gennem et optisk bord. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Resultater fra en omgivende MSI undersøgelse af en mus nyre sektion med høj rumlig og masse opløsning. A) En repræsentant massespektrum fra enkelt-sonde MSI. Den maksimale intensitet påviste metabolitter kan nå 3,39 x 10 7 (arbitrære enheder). B) Et udvalg af de påviste metabolitter præsenteret med deres masse nøjagtighed. C)MS billeder af [PC (32: 0) + H] + og [PC (34: 1) + Na] + taget fra en mus nyre sektion på 8,5 um rumlig opløsning. PC: phosphatidylcholin. Målestok: 2 mm; 0,20 mm (indsat) d) Fastsættelse af rumlig opløsning på MS billedet for. [PC (38: 5) + Na] + (tilpasset med tilladelse fra henvisning 15). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Resultater fra en omgivende SCMS analyse af lægemiddelbehandlede HeLa-celler med høj masse opløsning. A) Zoomede-i fotografi af den enkeltstrengede probe tip viser en typisk størrelse på <10 um i diameter. B) fotografi taget på det sted single-sonde indsættelse i en HeLa-celle. Scale bar: 50 pm.c) En typisk positiv ion-mode massespektrum med identifikationerne af en række PC (phosphatidylcholin) arter. d) En repræsentativ liste af metabolitter detekteret fra SCMS-analyse af HeLa-celler i både de positive og negative ion modes. ef) Massespektre for kontrol og behandlet (100 nM OSW-1) celler (tilpasset med tilladelse fra henvisning 16). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1. Kredsløbsdiagram af den elektroniske enhed, der bruges til at producere kontakt lukning signal til massespektrometer til at indsamle data. Klik her for at se eller downloade dette tal.
Discussion
Den fælles-sonde er en multifunktionel enhed, der kan bruges til både MSI og SCMS eksperimenter. Opsætningen single-sonde (herunder oversættelse fase systemer, mikroskoper, ionkilde grænseflade flange, osv) er udformet som et add-on komponent, der kan fleksibelt tilpasses den eksisterende massespektrometer. En hurtig udveksling mellem single-sonde setup og den konventionelle ESI ion kilde kan opnås inden for et minut. I princippet anvendelse af det passende ionkilde grænseflade flange, single-probe setup kan tilpasses de andre massespektrometre. Endvidere kan sampling opløsningsmiddel indeholdende forskellige reagenser anvendes med den enkeltstrengede probe setup for reaktive MSI og SCMS eksperimenter, hvilket i høj grad forøger påvisning af bredere intervaller af biomolekyler. Foruden dyrevæv og cellelinjer, single-proben er også i stand til at analysere andre biologiske systemer, såsom planter. Derfor, med den samme forsøgsopstilling oglignende bruger uddannelse, kan en række undersøgelser udføres ved hjælp af et enkelt instrument og af de samme brugere, der giver mulighed for effektive og alsidige eksperimenter skal udføres med et minimum træningstid og instrumentering omkostninger.
Det centrale element i den single-sonde MS teknik er sonden selv. Kvaliteten af single-sonde har en væsentlig indflydelse på sine resultater, som i vid udstrækning bestemmer kvaliteten af både MSI og SCMS eksperimenter. Når opdigte single-sonder, sørge for, at kapillærerne indersiden af dual-boring slanger er forsvarligt limet for at eliminere risikoen for opløsningsmiddel lækage under forsøgene. Det er afgørende at anvende et minimum af UV hærdbar epoxy, således at åbningerne og kapillærer er tilstoppet under sonden fabrikation.
Den fælles-probe er blevet anvendt til at udføre høj rumlig og masse beslutning omgivende MSI på biologiske prøver 15. Den største fordel ved omgivelsernes MSI løbetikke-ambient metoder er, at prøvefremstilling holdes på et minimum uden behov for et vakuum prøveudtagning miljø, der tillader den prøve, der skal analyseres i en nær native tilstand 8. En af de store forhindringer for de fleste andre omgivende MSI teknik har været en mangel på rumlig opløsning 1. Sammenlignet med den desorption baseret MSI teknikker (såsom DESI og LAESI), den lille spids størrelse single-sonde giver et mere robust og effektivt overflade flydende mikro-ekstraktion, der skal udføres i løbet af et lille område, hvilket fører til en høj rumlig opløsning på 8,5 um, som er blandt de højeste opnået ved hjælp af omgivende MSI teknikker 15. Desuden tilpasning af komponenterne af prøveudtagningen opløsningsmiddel giver ekstra fleksibilitet til udførelse af forsøgene. For eksempel prøveudtagning opløsningsmidler indeholdende reagenser (f.eks dikationisk forbindelser) er blevet anvendt til at udføre reaktive MSI eksperimenter, der giver mulighed for en betydelig stigning i antallet af identificerede metabolitter per eksperiment 20. Den anden fordel af det indre-sonden er integreret design, som giver nem betjening under hele datafangst processen. Fordi afstanden mellem spidsen og vævet overflade er meget følsom for ion signalintensitet og stabilitet, opnåelse af et fladt vævssnit og ledende overflade udfladning justering at minimere afstanden varians er en nøgle til høj kvalitet MSI eksperimenter. Heraf følger, at single-probe MSI teknikker er ikke egnede til at opnå høje rumlige MS billeder af ujævne overflader.
Foruden fremstilling af en høj kvalitet probe, omhyggeligt tuning instrumentet er afgørende for en vellykket MSI eksperiment. Blandt alle tuning trin, at justere højden på den enkeltstrengede probe tip over vævssnit overflade er den mest kritiske. Ved justering af probehøjden, pumpe prøveudtagning opløsningsmiddel og tænd for ionisering spænding, således at kun de opløsningsmidler baggrund ion signaler kan være observed. overvåge derefter ændringen af massespektret mens omhyggeligt reducere probe-overflade afstand ved at løfte det motoriserede Z-etape indtil stærke og stabile ion signaler fra vævssnit kan observeres; denne probehøjden vil blive anvendt til MSI dataindsamling under eksperimentet. Derudover en optimeret opløsningsmiddel strømningshastighed er afgørende for MSI eksperimenter. Justér flowet med den optimerede sonde højde. Sikre, at der ikke er noget opløsningsmiddel spredes på vævsoverfladen (dvs. strømningshastighed er for høj) eller bobledannelse inde i nano-ESI emitter (dvs. strømningshastighed er for lav).
Den fælles-sonde er en multifunktionel enhed til bioanalyse. Ud over de MSI eksperimenterne, det er i stand til at lede næsten tidstro in situ SCMS at belyse nøjagtig kemisk information fra levende eukaryote celler 16, hvilket er en stor fordel i forhold til andre vakuum baserede SCMS teknikker (såsom MALDI 10 og SIMS 21 (f.eks dikationisk forbindelser) anvendes i SCMS eksperimenter, og kan påvises en bredere vifte af cellulære bestanddele i en live enkelt celle end nogensinde før (igangværende forskning, data ikke vist). Selv om den real-time analyse vil give de kemiske profiler af levende enkeltceller, på grund af cellens gennemtrængning af membranen og udvinding af celleindhold, vil cellen under undersøgelse aflives efter eksperimentet, hvilket indebærer, at single-probe SCMS teknik er stadig en destruktiv fremgangsmåde. Desuden kan probespidsen og nano-ESI emitter i single-sonden let tilstoppet for uerfarne brugere. For at reducere risikoen for enhedens tilstopning, sikre at undgå at røre kernen, når du indsætter den single-sonden i en cell. Hvis der opstår tilstopning, kan enheden regenereres ved opvarmning af tilstoppet sonde spids eller nano-ESI emitter bruge en hjemmebygget varmespiral 16. En anden begrænsning af den enkeltstrengede probe SCMS teknik er, at kun de klæbende celler (dvs. celler fæstnet til overflader) kan analyseres ved hjælp af aktuelle opsætning. Men ved at indarbejde cellen manipulation system i single-sonde MS apparat, bredere typer celle kan studeres i fremtiden.
Svarende til MSI eksperimentet, opnå en høj kvalitet sonde og en optimeret opløsningsmiddel strømningshastighed er kritisk for SCMS studier. Når tuning opløsningsmidlet strømningshastighed, er det enkelt-sondens spids er placeret oven på prøven (dvs. ingen kontakt med cellen eller dyrkningsmediet), og sikre, at der er noget opløsningsmiddel drypper fra probespidsen eller bobledannelse inde i nano-ESI emitter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Single-probe fabrication | |||
| Dual bore quartz tubing, 1.120’’ × 0.005” × 12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
| Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
| Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 110 µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
| UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
| LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
| Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
| Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
| Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
| Microscope slide (glass) | C & A Scientific - Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
| Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
| Mass spectrometer | |||
| LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
| Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
| Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| Contact closure device | |||
| USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
| Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
| Single-probe setup | |||
| Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
| Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
| Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
| Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
| Digital stereo microscope, 250X - 2,000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
| USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
| Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
| Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
| Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
| Solvents | |||
| Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
| Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
| 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
| 10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
| 12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
| T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
| Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
| Tissue imaging | |||
| Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
| Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
| Microscope slide (polycarbonate) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P | |
References
- Vickerman, J. C. Molecular imaging and depth profiling by mass spectrometry-SIMS, MALDI or DESI? Analyst. 136 (11), 2199-2217 (2011).
- Schwamborn, K. Imaging mass spectrometry in biomarker discovery and validation. J. Proteomics. 75 (16), 4990-4998 (2012).
- Schwamborn, K., Caprioli, R. M. MALDI Imaging Mass Spectrometry - Painting Molecular Pictures. Mol Oncol. 4 (6), 529-538 (2010).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18120-18125 (2008).
- Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. Simultaneous imaging of small metabolites and lipids in rat brain tissues at atmospheric pressure by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 82 (3), 982-988 (2010).
- Laskin, J., Heath, B. S., Roach, P. J., Cazares, L., Semmes, O. J. Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84 (1), 141-148 (2012).
- Wu, C., Dill, A. L., Eberlin, L. S., Cooks, R. G., Ifa, D. R. Mass spectrometry imaging under ambient conditions. Mass. Spectrom. Rev. 32 (3), 218-243 (2013).
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-Cell MALDI-MS as an Analytical Tool for Studying Intrapopulation Metabolic Heterogeneity of Unicellular Organisms. Anal. Chem. 82 (17), 7394-7400 (2010).
- Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-cell lipidomics: characterizing and imaging lipids on the surface of individual Aplysia californica neurons with cluster secondary ion mass spectrometry. Anal. Chem. 85 (4), 2231-2238 (2013).
- Shrestha, B., et al. Subcellular metabolite and lipid analysis of Xenopus laevis eggs by LAESI mass spectrometry. PLoS One. 9 (12), e115173 (2014).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass. Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 26 (6), 986-993 (2015).
- Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Thomas, M., et al. Visualization of High Resolution Spatial Mass Spectrometric Data during Acquisition. 2012 Annual International Conference of the Ieee Engineering in Medicine and Biology Society (Embc). , 5545-5548 (2012).
- Luxembourg, S. L., Mize, T. H., McDonnell, L. A., Heeren, R. M. High-spatial resolution mass spectrometric imaging of peptide and protein distributions on a surface. Anal. Chem. 76 (18), 5339-5344 (2004).
- Zhou, Y., et al. OSW-1: a natural compound with potent anticancer activity and a novel mechanism of action. J Natl Cancer Inst. 97 (23), 1781-1785 (2005).
- Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).
- Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary ion MS imaging to relatively quantify cholesterol in the membranes of individual cells from differentially treated populations. Anal. Chem. 79 (10), 3554-3560 (2007).
