Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.
Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 µm) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (< 10 µm), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a relatively new molecular imaging technique to provide the spatial distribution of the compounds of interest on surfaces. During the MSI analysis, mass spectrometry (MS) measurements are recorded across the surface on an individual pixel basis to create a 2D image of the species of interest 1. MSI techniques have the ability to provide a spatially resolved feature distribution for a large range of metabolites, allowing a much greater amount of information to be obtained from a sample than from using traditional molecular imaging techniques, and they have the potential to greatly improve the analysis of biological samples for biological and pharmacology studies 2. MSI can be broadly separated into non-ambient and ambient approaches. The non-ambient MSI analysis techniques, such as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) MS 3 and time of flight secondary ion MS (ToF SIMS) 4, are capable of high spatial resolution (around 5 µm and 100 nm, respectively) and high sensitivity. However, these methods require extensive sample preparation, such as the application of matrix molecules to the sample surface, and a vacuum sampling environment, which could introduce artifacts to the data obtained. Ambient techniques such as desorption electrospray ionization (DESI) MS 5, laser ablation electrospray ionization (LAESI) MS 6, and nano-DESI MS 7 are capable of MSI of samples with little to no prior preparation under the ambient environment, which is able to produce MS images that potentially reflect the sample in its most native state. However, most of these techniques generally lack the high spatial resolution and detection sensitivity compared with the non-ambient techniques, with experiments typically conducted at around 150 µm per pixel 8.
Single cell analysis (SCA) is a growing field that has the ability to characterize the chemical composition of biological samples at the cellular level. SCA enables the analysis of biological systems at a more fundamental level than traditional cell analysis techniques, which produce an averaged result of a population of cells, potentially providing insights that are previously intractable 9. MS techniques have recently been applied to SCA (termed single cell mass spectrometry or SCMS) using non-ambient techniques such as MALDI MS 10 and ToF SIMS 11 in which cells are pretreated before analysis, and with ambient techniques such as LAESI MS 12 and direct extraction methods, such as live single-cell video-MS 13, 14, to analyze a wide variety of cell types such as egg, plant, and cancer. Ambient techniques have the advantage of being applied to live cells, which again minimizes the artifacts, leading to a better representation of the metabolites in the live cells. The direct extraction based methods described above, however, perform the sample extraction and analysis process at two different steps, which result in a time gap during the analysis that could potentially alter the metabolites present within the sample.
The single-probe, a miniaturized multifunctional device that is capable of conducting high spatial resolution ambient MSI on biological tissue sections 15 and near real-time in-situ SCMS on live single cells 16. The single-probe has an integrated construction that is made up of a pulled dual-bore quartz capillary coupled with a solvent providing inlet and a nano-ESI emitter made from fused silica capillaries, enabling solvent delivery and analyte extraction to be performed from a single device. In the ambient MSI mode, the single-probe is placed over the sample tissue and surface micro-extraction occurs, allowing a rastered MS image to be made at high spatial resolution. Particularly, the tapered tip of the single-probe is small enough to be inserted into live eukaryotic cells for in-situ SCMS analysis, where the metabolite detection takes less than two seconds between probe insertion and MS detection, allowing chemical information to be taken in near real-time. Here are the protocols to fabricate the single-probe device and to conduct both the ambient MSI and SCMS modes using the single-probe MS techniques.
단일 프로브 모두 MSI 및 SCMS 실험에 사용할 수있는 다기능 장치이다. (변환 스테이지 시스템, 현미경, 이온 소스 인터페이스 플랜지 등)를 단일 프로브 설정 유연 기존 질량 분석계에 적용 할 수있는 부가 구성 요소로 설계된다. 단일 프로브 설정 종래 ESI 이온 소스 사이의 신속한 교환이 1 분 이내에 달성 될 수있다. 원칙적으로, 적절한 이온 소스 인터페이스 플랜지를 사용하여 단일 프로브 설정은 다른 질량 분광기에 적용 할 수있다. 또한, 다양한 시약을 포함하는 샘플 용매 크게 생체의 넓은 범위의 검출을 향상 반응성 MSI 및 SCMS 실험 단일 프로브 설정으로 사용될 수있다. 동물 조직 및 세포주뿐만 아니라, 단일 프로브는 또한 식물과 같은 다른 생물학적 시스템을 분석 할 수있다. 따라서 동일한 실험 장치와유사한 사용자 교육은 다양한 연구가 하나의 기기를 사용하여 수행 될 수 있고, 동일한 사용자가 최소 트레이닝 시간 및 장비 비용이 달성 될 효과적인 다목적 실험 수.
단일 프로브 MS 기술의 핵심 요소는 프로브 자체이다. 단일 프로브의 품질은 크게 두 MSI 및 SCMS 실험의 품질을 결정 성능에 상당한 영향을 미친다. 단일 프로브를 제조 할 때, 듀얼 보어 튜브의 내부의 모세 혈관이 안전하게 실험 중 용매 누출의 가능성을 제거하기 위해 접착되어 있는지 확인합니다. 오리피스가 모세관 프로브 제조 동안에 폐색되지 않도록 UV 경화성 에폭시 최소량을 사용하는 것이 중요하다.
단일 프로브를 생물학적 시료 (15) 상에 높은 공간 분해능 및 질량 주위 MSI를 수행하는 데 사용되었다. 주변 MSI의 가장 큰 장점 이상비 주변 방법 시료 제제 샘플 가까운 고유 상태 (8)에서 분석 될 수있는 진공 샘플링 환경에 대한 필요성과 함께 최소로 유지된다는 것이다. 대부분의 다른 주변 MSI 기술의 주요 장애물 중 하나는 공간 해상도 1의 부족이었다. 기초 탈착과 비교 MSI, 단일 프로브의 작은 팁 크기는 더욱 강력하고 효율적인 표면 액체 미세 추출의 높은 공간 해상도로 이어지는 작은 영역에 걸쳐 수행 될 수 있도록 (예 DESI 및 LAESI 등) 기법 주변 MSI 기술 (15)를 사용하여 달성 가장 높은 사람 사이에 8.5 μm의. 또한, 샘플링 용매의 성분을 조정하는 실험을 실시 추가적인 유연성을 제공한다. 예를 들어, 시약 (예 dicationic 화합물)을 함유하는 용매를 샘플링 대사 식별 PE의 개수의 상당한 증가를 허용 MSI 반응성 실험을 수행하는데 사용되어왔다연구 실험 20. 단일 프로브의 다른 장점은 전체 데이터 수집 프로세스 동안 동작의 용이성을 제공하는 통합 설계된다. 팁과 조직 표면 사이의 거리가 이온 신호 강도 및 안정성 평면 조직 절편을 구하고 상기 거리의 분산을 최소화하도록 조정 평탄화 표면 전도에 매우 민감하기 때문에 고품질 MSI 실험하기위한 키이다. 단일 프로브 MSI 기술 요철 표면의 높은 공간 MS 이미지를 획득하기에 적합하지 것을 따른다.
고품질의 프로브를 제조하는 것 외에도, 조심기구를 조정하는 것은 성공적인 MSI 실험을 위해 필수적이다. 모든 동조 단계 중에서, 조직 절편 표면 위의 단일 프로브 팁의 높이를 조정하는 것이 가장 중요한 일이다. 프로브의 높이를 조정할 때는, 샘플링 펌프 및 용매만을 용매 배경 이온 신호 observ 될 수 있도록 이온화 전압 켜에디션. 신중 조직 절편에서 강하고 안정된 이온 신호를 관찰 할 수있을 때까지 전동식 Z 단계 올려서 프로브 표면 거리를 감소시키면서 질량 스펙트럼의 변화를 모니터링; 이 프로브의 높이가 실험 기간 동안 MSI 데이터 수집을 위해 사용될 것이다. 또한, 최적화 된 용매 유량은 MSI 실험을 위해 필수적이다. 최적의 탐침 높이의 유량을 조정한다. 조직 표면에 용제 확산이 없도록 (즉, 유속이 너무 높은 경우) 또는 나노 ESI 터 (즉, 속도가 너무 낮은 흐름) 내부에 기포 형성.
단일 프로브는 bioanalysis을위한 다기능 장치입니다. MSI는 실험을 또한, SCMS 다른 진공에 비해 큰 장점이다 라이브 진핵 세포 (16)으로부터 상세한 화학적 정보를 밝히기 원위치 거의 실시간으로 수행 할 수있는 이러한 MALDI 10 SIMS 등 기초 SCMS 기술 ( (21) </SUP>). 프로브 팁의 작은 크기는 능력 라이브 진핵 세포에 삽입하고 추출 즉각적인 MS 분석을위한 세포를 이온화하는 화합물을 제공한다. 유사하게, 시약 (예 dicationic 화합물)를 포함하는 샘플링 용매는 SCMS 실험에 사용될 수 있으며, 세포 성분의 넓은 범위가 전보다 라이브 단일 셀에서 검출 될 수있다 (진행중인 연구의 데이터는 도시되지 않음). 실시간 분석에 의한 세포막 및 세포 내용물의 추출의 세포 침투 라이브 단일 세포 화학적 정보를 제공하지만, 조사중인 셀은 단일 프로브 SCMS 기술은 여전히 암시 실험 후에 사망한다 파괴적인 방법. 또한, 단일 프로브 탐침 나노 ESI 에미 쉽게 경험이없는 사용자 막히게 할 수있다. 장치의 막힘의 가능성을 줄이기 위해, CEL에 단일 프로브 팁을 삽입 할 때 핵에 손이 닿지 않도록 보장엘. 막힘이 발생하면, 장치가 막힌 프로브 팁 및 자작 또는 가열 코일 (16)을 사용하여 방출기 나노 ESI를 가열함으로써 재생 될 수있다. 단일 프로브 SCMS 기술의 다른 제한 사항은 접착 세포 (즉, 세포 표면에 부착 된) 현재 설정을 사용하여 분석 할 수 있다는 것이다. 그러나, 단일 프로브 MS 장치로 세포 조작 시스템을 도입함으로써, 전지의 광범위한 종류 향후 연구 될 수있다.
고품질 프로브 최적화 용매 유량을 얻는다 MSI 실험 마찬가지로 SCMS 연구에 중요하다. 용매 유량을 조정하는 경우, 단일 프로브 팁은 (즉, 세포 또는 배양 배지와 접촉없이) 샘플 위에 배치하고, 나노 ESI 내부 프로브 팁 또는 기포 형성로부터 용매 떨어지는이 없도록한다 이미 터.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Laskin (the Pacific Northwest National Laboratory) for sharing the motorized stage control software and MSI visualization program. We also thank Dr. Mao (the University of Oklahoma) for providing mouse organ samples and Mr. Chad E. Cunningham (the University of Oklahoma) for the assistance in machining and electronics work. This research was supported by grants from the Research Council of the University of Oklahoma Norman Campus, the American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsored by Waters Corporation), Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152), and National Institutes of Health (R01GM116116).
Single-probe fabrication | |||
Dual bore quartz tubing, 1.120’’×0.005”×12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
Fused silica capillary, ID: 40µm, OD: 110µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
Microscope slide (glass) | C & A Scientific – Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass spectrometer | |||
LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Contact closure device | |||
USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Single-probe setup | |||
Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
Digital stereo microscope, 250X-2000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solvents | |||
Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue imaging | |||
Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
Microscope slide (polycarbonate ) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P |