Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.
Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 µm) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (< 10 µm), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a relatively new molecular imaging technique to provide the spatial distribution of the compounds of interest on surfaces. During the MSI analysis, mass spectrometry (MS) measurements are recorded across the surface on an individual pixel basis to create a 2D image of the species of interest 1. MSI techniques have the ability to provide a spatially resolved feature distribution for a large range of metabolites, allowing a much greater amount of information to be obtained from a sample than from using traditional molecular imaging techniques, and they have the potential to greatly improve the analysis of biological samples for biological and pharmacology studies 2. MSI can be broadly separated into non-ambient and ambient approaches. The non-ambient MSI analysis techniques, such as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) MS 3 and time of flight secondary ion MS (ToF SIMS) 4, are capable of high spatial resolution (around 5 µm and 100 nm, respectively) and high sensitivity. However, these methods require extensive sample preparation, such as the application of matrix molecules to the sample surface, and a vacuum sampling environment, which could introduce artifacts to the data obtained. Ambient techniques such as desorption electrospray ionization (DESI) MS 5, laser ablation electrospray ionization (LAESI) MS 6, and nano-DESI MS 7 are capable of MSI of samples with little to no prior preparation under the ambient environment, which is able to produce MS images that potentially reflect the sample in its most native state. However, most of these techniques generally lack the high spatial resolution and detection sensitivity compared with the non-ambient techniques, with experiments typically conducted at around 150 µm per pixel 8.
Single cell analysis (SCA) is a growing field that has the ability to characterize the chemical composition of biological samples at the cellular level. SCA enables the analysis of biological systems at a more fundamental level than traditional cell analysis techniques, which produce an averaged result of a population of cells, potentially providing insights that are previously intractable 9. MS techniques have recently been applied to SCA (termed single cell mass spectrometry or SCMS) using non-ambient techniques such as MALDI MS 10 and ToF SIMS 11 in which cells are pretreated before analysis, and with ambient techniques such as LAESI MS 12 and direct extraction methods, such as live single-cell video-MS 13, 14, to analyze a wide variety of cell types such as egg, plant, and cancer. Ambient techniques have the advantage of being applied to live cells, which again minimizes the artifacts, leading to a better representation of the metabolites in the live cells. The direct extraction based methods described above, however, perform the sample extraction and analysis process at two different steps, which result in a time gap during the analysis that could potentially alter the metabolites present within the sample.
The single-probe, a miniaturized multifunctional device that is capable of conducting high spatial resolution ambient MSI on biological tissue sections 15 and near real-time in-situ SCMS on live single cells 16. The single-probe has an integrated construction that is made up of a pulled dual-bore quartz capillary coupled with a solvent providing inlet and a nano-ESI emitter made from fused silica capillaries, enabling solvent delivery and analyte extraction to be performed from a single device. In the ambient MSI mode, the single-probe is placed over the sample tissue and surface micro-extraction occurs, allowing a rastered MS image to be made at high spatial resolution. Particularly, the tapered tip of the single-probe is small enough to be inserted into live eukaryotic cells for in-situ SCMS analysis, where the metabolite detection takes less than two seconds between probe insertion and MS detection, allowing chemical information to be taken in near real-time. Here are the protocols to fabricate the single-probe device and to conduct both the ambient MSI and SCMS modes using the single-probe MS techniques.
単一プローブはMSIとSCMS両方の実験のために使用することができる多機能装置です。 (並進ステージシステム、顕微鏡、イオン源インタフェースフランジ、 等を含む)単一のプローブの設定を柔軟に既存の質量分析計に適合させることができるアドオンコンポーネントとして設計されています。単一プローブセットアップと従来のESIイオン源間の迅速な交換は、1分以内に達成することができます。原理的には、適切なイオン源インタフェースフランジを使用して、単一のプローブの設定は、他の質量分析計に適合させることができます。さらに、種々の試薬を含むサンプリング溶媒が大きく生体分子のより広い範囲の検出を増強反応MSI及びSCMS実験のために単一のプローブの設定で使用することができます。動物組織および細胞株に加えて、単一のプローブはまた、植物などの他の生物学的システムを分析することが可能です。そのため、同じ実験のセットアップとと同様のユーザのトレーニングは、研究の様々な単一機器を使用して行うことができ、同一のユーザが、最小のトレーニング時間及び計装コストで実現することが効率的で多用途の実験を可能にします。
シングルプローブMS技術の重要な要素は、プローブそのものです。シングルプローブの品質が大幅に両方のMSIとSCMS実験の品質を決定し、その性能、に大きな影響を与えています。単一のプローブを作製する場合、デュアルボアチューブの内側の毛細血管が確実に実験中の溶剤漏れの可能性を排除するために接着されていることを確認します。オリフィスおよび毛細血管をプローブ製造中に目詰まりしないように、UV硬化性エポキシ樹脂の最小量を使用することが重要です。
単一プローブを生体試料15の高空間分解能質量周囲MSIを実施するために使用されています。周囲MSIの上の主な利点非周囲方法サンプル調製は、サンプルが近く天然状態8で分析することを可能にする真空サンプリング環境を必要とせず、最小に保たれることです。他のほとんどの周囲MSI技術のための主要な障害の1つは、空間分解能1の欠如となっています。 (このようなDESIとLAESIなど)脱着ベースMSI技術と比較して、単一のプローブの小さなチップサイズは、高空間分解能につながる、小領域の上、実行するより堅牢かつ効率的な表面の液マイクロ抽出を可能にします周囲MSI技術15を使用して達成された最高のものの中で8.5μmで、。また、サンプリング溶媒の成分を調整する実験を行うために余分な柔軟性を提供します。例えば、試薬( 例えば 、ジカチオン性化合物)を含有する溶媒をサンプリングすると、識別された代謝物のPEの数の大幅な増加を可能にする、反応性MSI実験を行うために使用されていますrの実験20。単一プローブの他の利点は、全データの取得処理時の動作の容易さを提供する統合された設計です。先端と組織表面との間の距離は、イオン信号強度と安定性のために非常に敏感であるので、平坦な組織切片を取得し、距離の分散を最小にするように表面平坦化調整を実施することは、高品質MSI実験のためのキーです。単一のプローブMSI技術が凹凸面の高空間MS画像を得るのに適していないということになります。
高品質のプローブを作製することに加えて、慎重に機器のチューニングが成功MSI実験のために不可欠です。すべてのチューニング・ステップの中で、組織切片表面上の単一プローブ先端の高さを調整することは最も重要なものです。プローブの高さを調整する場合、サンプリング溶媒ポンプおよび溶媒のみ背景イオン信号をobservできるように、イオン化電圧をオンにしますエド。慎重に組織切片からの強力かつ安定したイオンシグナルが観察されるまで電動Zステージを持ち上げてプローブ表面の距離を低減しつつ、その後の質量スペクトルの変化を監視します。このプローブの高さは、実験中にMSIのデータ収集のために使用されます。また、最適化された溶媒の流量は、MSIの実験のために不可欠です。最適化されたプローブの高さで流量を調整します。ナノESIエミッタの内部には、溶剤組織表面上のスプレッド( すなわち 、流量が高すぎる)または気泡形成( すなわち 、流量が低すぎる)がないことを確認してください。
シングルプローブは、生物分析のための多機能デバイスです。 MSIの実験に加えて、SCMSは、MALDI 10やSIMSなどの他の真空ベースのSCMS技術(と比べて大きな利点である、生きた真核細胞16から詳細な化学情報を解明するために、その場でリアルタイムに近く行うことができ、 21 </SUP>)。プローブ先端のサイズが小さい生真核細胞に挿入されると即座MS分析のための細胞内化合物を抽出し、イオン化する能力を提供します。同様に、試薬( 例えば 、ジカチオン性化合物)を含有するサンプル溶媒はSCMS実験に使用することができ、細胞成分のより広い範囲がこれまで以上にライブ単一細胞で検出することができる(進行中の研究は、データは示していません)。リアルタイム分析は、膜と細胞内容の抽出の細胞透過に、生きた単一細胞の化学的特性を提供しますが、調査中の細胞は、単一のプローブSCMS技術はまだであることを暗示している、実験後に殺されます破壊的な方法。また、単一のプローブでプローブチップとナノESIエミッターを容易に不慣れなユーザのために目詰まりすることができます。セルにシングルプローブ先端を挿入するときに、デバイスの目詰まりの可能性を減らすために、核を触れないように確認してくださいリットル。目詰まりが発生した場合、デバイスは、手製の加熱コイル16を用いて、詰まったプローブチップまたはナノESIエミッタを加熱することによって再生することができます。単一プローブSCMS技術の他の制限は、接着性細胞( すなわち 、細胞が表面に付着している)現在の設定を使用して分析することができることです。しかしながら、単一プローブMS装置に細胞操作システムを組み込むことにより、細胞の広範な種類が将来的に研究することができます。
MSIの実験と同様に、高品質のプローブと最適化された溶媒の流量を得ることがSCMS研究にとって重要です。溶媒の流量を調整するときは、シングルプローブ先端( すなわち 、細胞または培養培地と接触無し)サンプルの上に配置され、ナノESI内部のプローブ・チップやバブル形成からの溶剤滴下がないことを確認され、エミッタ。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Laskin (the Pacific Northwest National Laboratory) for sharing the motorized stage control software and MSI visualization program. We also thank Dr. Mao (the University of Oklahoma) for providing mouse organ samples and Mr. Chad E. Cunningham (the University of Oklahoma) for the assistance in machining and electronics work. This research was supported by grants from the Research Council of the University of Oklahoma Norman Campus, the American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsored by Waters Corporation), Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152), and National Institutes of Health (R01GM116116).
Single-probe fabrication | |||
Dual bore quartz tubing, 1.120’’×0.005”×12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
Fused silica capillary, ID: 40µm, OD: 110µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
Microscope slide (glass) | C & A Scientific – Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass spectrometer | |||
LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Contact closure device | |||
USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Single-probe setup | |||
Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
Digital stereo microscope, 250X-2000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solvents | |||
Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue imaging | |||
Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
Microscope slide (polycarbonate ) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P |