Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.
Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 µm) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (< 10 µm), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a relatively new molecular imaging technique to provide the spatial distribution of the compounds of interest on surfaces. During the MSI analysis, mass spectrometry (MS) measurements are recorded across the surface on an individual pixel basis to create a 2D image of the species of interest 1. MSI techniques have the ability to provide a spatially resolved feature distribution for a large range of metabolites, allowing a much greater amount of information to be obtained from a sample than from using traditional molecular imaging techniques, and they have the potential to greatly improve the analysis of biological samples for biological and pharmacology studies 2. MSI can be broadly separated into non-ambient and ambient approaches. The non-ambient MSI analysis techniques, such as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) MS 3 and time of flight secondary ion MS (ToF SIMS) 4, are capable of high spatial resolution (around 5 µm and 100 nm, respectively) and high sensitivity. However, these methods require extensive sample preparation, such as the application of matrix molecules to the sample surface, and a vacuum sampling environment, which could introduce artifacts to the data obtained. Ambient techniques such as desorption electrospray ionization (DESI) MS 5, laser ablation electrospray ionization (LAESI) MS 6, and nano-DESI MS 7 are capable of MSI of samples with little to no prior preparation under the ambient environment, which is able to produce MS images that potentially reflect the sample in its most native state. However, most of these techniques generally lack the high spatial resolution and detection sensitivity compared with the non-ambient techniques, with experiments typically conducted at around 150 µm per pixel 8.
Single cell analysis (SCA) is a growing field that has the ability to characterize the chemical composition of biological samples at the cellular level. SCA enables the analysis of biological systems at a more fundamental level than traditional cell analysis techniques, which produce an averaged result of a population of cells, potentially providing insights that are previously intractable 9. MS techniques have recently been applied to SCA (termed single cell mass spectrometry or SCMS) using non-ambient techniques such as MALDI MS 10 and ToF SIMS 11 in which cells are pretreated before analysis, and with ambient techniques such as LAESI MS 12 and direct extraction methods, such as live single-cell video-MS 13, 14, to analyze a wide variety of cell types such as egg, plant, and cancer. Ambient techniques have the advantage of being applied to live cells, which again minimizes the artifacts, leading to a better representation of the metabolites in the live cells. The direct extraction based methods described above, however, perform the sample extraction and analysis process at two different steps, which result in a time gap during the analysis that could potentially alter the metabolites present within the sample.
The single-probe, a miniaturized multifunctional device that is capable of conducting high spatial resolution ambient MSI on biological tissue sections 15 and near real-time in-situ SCMS on live single cells 16. The single-probe has an integrated construction that is made up of a pulled dual-bore quartz capillary coupled with a solvent providing inlet and a nano-ESI emitter made from fused silica capillaries, enabling solvent delivery and analyte extraction to be performed from a single device. In the ambient MSI mode, the single-probe is placed over the sample tissue and surface micro-extraction occurs, allowing a rastered MS image to be made at high spatial resolution. Particularly, the tapered tip of the single-probe is small enough to be inserted into live eukaryotic cells for in-situ SCMS analysis, where the metabolite detection takes less than two seconds between probe insertion and MS detection, allowing chemical information to be taken in near real-time. Here are the protocols to fabricate the single-probe device and to conduct both the ambient MSI and SCMS modes using the single-probe MS techniques.
De single-probe is een multifunctioneel apparaat dat kan worden gebruikt voor zowel MSI en SCMS experimenten. De single-probe opstart (inclusief translatietrap systemen, microscopen, ionenbron flens-interface, etc.) als een add-on component die flexibel kan worden aangepast aan de bestaande massaspectrometer. Een snelle uitwisseling tussen de single-probe setup en de conventionele ESI ionenbron kan worden bereikt binnen één minuut. In principe, met de geschikte ionenbron-interface flens, de één-probe installatie kan worden aangepast aan de andere massaspectrometers. Bovendien kan de bemonstering oplosmiddel dat verschillende reagentia worden gebruikt met de single-probe opstart reactief MSI en SCMS experimenten, die de detectie van vollere biomoleculen sterk verbetert. Behalve dierlijke weefsels en cellijnen, de één-probe is eveneens geschikt voor het analyseren andere biologische systemen zoals planten. Daarom, met dezelfde experimentele opstelling ensoortgelijke opleiding van de gebruikers, kan een verscheidenheid aan studies worden uitgevoerd met behulp van een enkel instrument en door dezelfde gebruikers, waardoor een efficiënte en veelzijdige experimenten worden uitgevoerd met de minimale trainingstijd en instrumentatie kosten.
Het belangrijkste onderdeel van de single-probe MS techniek is de sonde zelf. De kwaliteit van de single-sonde heeft een significante invloed op zijn prestaties, die de kwaliteit van zowel de MSI en SCMS experimenten grotendeels bepaalt. Bij het fabriceren van single-probes, zorg ervoor dat de haarvaten binnenkant van de dual-boring buizen stevig vastgelijmd aan de kans op oplosmiddel lek tijdens de experimenten te elimineren. Het is cruciaal om een minimale hoeveelheid UV uithardbare epoxy, zodat de openingen en capillairen niet tijdens de fabricage probe verstopt gebruiken.
De single-probe werd gebruikt om een hoge ruimtelijke en massa resolutie ambient MSI voeren van biologische monsters 15. Het grote voordeel van ambient MSI bovennon-ambient werkwijzen is dat monstervoorbereiding minimaal wordt gehouden zonder de noodzaak van een vacuüm omgeving bemonstering, waardoor het te analyseren monster in een bijna natieve toestand 8. Een van de belangrijkste hindernissen voor de meeste andere ambient MSI techniek onvoldoende ruimtelijke resolutie 1 geweest. Vergeleken met de desorptie gebaseerde MSI technieken (zoals DESI en LAESI), de kleine tip grootte van de interne-sonde maakt een meer robuuste en efficiënte oppervlaktevloeistof micro-extractie wordt uitgevoerd met een klein oppervlak, wat leidt tot een hoge ruimtelijke resolutie van 8,5 micrometer, die tot de hoogste zijn weliswaar via omgevingstemperatuur MSI 15 technieken. Bovendien, aanpassing van de bestanddelen van de bemonstering oplosmiddel geeft extra flexibiliteit om de experimenten. Bijvoorbeeld bemonstering oplosmiddelen bevattende reagentia (bijvoorbeeld dicationic verbindingen) gebruikt reactieve MSI experimenten, waardoor een aanzienlijke toename van het aantal geïdentificeerde metabolieten per experiment 20. Het andere voordeel van de single-sonde is de geïntegreerde ontwerp, dat het bedieningsgemak biedt gedurende de hele data-acquisitie proces. Omdat de afstand tussen de naaldpunt en het oppervlak weefsel is zeer gevoelig voor ion signaalintensiteit en stabiliteit, het verkrijgen van een vlakke weefselsectie en geleidende oppervlaktelaag afvlakking aanpassing van de afstand variantie te minimaliseren is een sleutel voor hoogwaardige MSI experimenten. Hieruit volgt dat de single-probe MSI technieken zijn niet geschikt om een hoge ruimtelijke MS beelden van oneffen oppervlakken te verkrijgen.
Naast het vervaardigen van een hoge kwaliteit probe zorgvuldig afstemmen van het instrument is essentieel voor een succesvolle MSI experiment. Van alle afstemstappen, om de hoogte van de punt enkele sonde boven de weefselsectie oppervlak de meest kritische is. Het instellen van de hoogte probe, pomp de bemonstering oplosmiddel en zet de ionisatiespanning, zodat alleen het oplosmiddel achtergrond ionen signalen OBSERV kaned. controleren wordt deze verandering van het massaspectrum terwijl de probe-afstandsvlak zorgvuldig verminderen door het opheffen van de gemotoriseerde Z-fase tot sterke en stabiele ionen signalen van weefselsectie kan worden waargenomen; deze hoogte probe wordt gebruikt voor MSI gegevensverzameling tijdens het experiment. Bovendien, een geoptimaliseerde oplosmiddel stroomsnelheid is essentieel voor MSI experimenten. Stel het debiet met de geoptimaliseerde probe hoogte. Zorg ervoor dat er geen oplosmiddel verspreid over het weefsel oppervlak (dat wil zeggen, debiet te hoog is) of de vorming bubbel in de nano-ESI emitter (dat wil zeggen, het debiet te laag is).
De single-sonde is een multifunctioneel apparaat voor bioanalyse. Naast de MSI experimenten, is het in staat zijn die vrijwel in real time in-situ SCMS gedetailleerde chemische informatie van levende eukaryote cellen 16, hetgeen een groot voordeel ten opzichte van andere vacuüm opheldering gebaseerd SCMS technieken (zoals MALDI 10 en SIMS 21 </sup>). De geringe omvang van de punt van de sonde geeft de mogelijkheid tot een levende eukaryotische cel worden ingebracht en te extraheren en ioniseren de intracelluaire onmiddellijk MS analyse. Evenzo kan de bemonstering oplosmiddelen bevattende reagentia (bijvoorbeeld dicationic verbindingen) worden gebruikt in de experimenten SCMS en een breder scala van celbestanddelen kan in een levende cel dan ooit worden gedetecteerd (lopend onderzoek, gegevens niet getoond). Hoewel de real-time analyse van de chemische profielen van levende enkele cellen, als gevolg van de cel binnendringen van membraan en extractie van cellulaire inhoud ervan, zullen de cellen onderzocht worden gedood na het experiment, hetgeen impliceert dat de één-probe SCMS techniek nog een destructieve methode. Bovendien kan de sondepunt en nano-ESI emitter in de single-probe gemakkelijk verstopt voor onervaren gebruikers. Om de kans op verstopping apparaat te verminderen, zorgen voor om te voorkomen dat het aanraken van de kern bij het plaatsen van de punt single-sonde in een cell. Bij verstopping kan de inrichting worden geregenereerd door het opwarmen van de verstopte sondetip of nano-ESI emitter met een zelfgebouwde verwarmingselement 16. Een andere beperking van de interne probe SCMS techniek is dat slechts het kleefmiddel cellen (dat wil zeggen, zijn cellen gehecht aan oppervlakken) kunnen worden geanalyseerd met behulp huidige opstelling. Echter, door het opnemen van de cel manipulatiesysteem in de enkele-probe MS inrichting bredere celtypen kunnen worden bestudeerd in de toekomst.
Vergelijkbaar met de MSI experiment, het verkrijgen van een hoge kwaliteit probe en een geoptimaliseerde oplosmiddel stroomsnelheid is essentieel voor SCMS studies. Bij het stemmen van het oplosmiddel stroomsnelheid, wordt de punt single-sonde geplaatst boven het monster (dat wil zeggen, geen contact met de cel of het kweekmedium), en ervoor te zorgen dat er geen oplosmiddel druipen van de sonde of de vorming bubbel in de nano-ESI emitter.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Laskin (the Pacific Northwest National Laboratory) for sharing the motorized stage control software and MSI visualization program. We also thank Dr. Mao (the University of Oklahoma) for providing mouse organ samples and Mr. Chad E. Cunningham (the University of Oklahoma) for the assistance in machining and electronics work. This research was supported by grants from the Research Council of the University of Oklahoma Norman Campus, the American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsored by Waters Corporation), Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152), and National Institutes of Health (R01GM116116).
Single-probe fabrication | |||
Dual bore quartz tubing, 1.120’’×0.005”×12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
Fused silica capillary, ID: 40µm, OD: 110µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
Microscope slide (glass) | C & A Scientific – Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass spectrometer | |||
LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Contact closure device | |||
USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Single-probe setup | |||
Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
Digital stereo microscope, 250X-2000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solvents | |||
Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue imaging | |||
Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
Microscope slide (polycarbonate ) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P |