एकल जांच के आवेदन: मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग और परिवेश की स्थिति के तहत सिंगल सेल विश्लेषण
Summary
Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.
Abstract
Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 µm) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (< 10 µm), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.
Introduction
Mass spectrometry imaging (MSI) is a relatively new molecular imaging technique to provide the spatial distribution of the compounds of interest on surfaces. During the MSI analysis, mass spectrometry (MS) measurements are recorded across the surface on an individual pixel basis to create a 2D image of the species of interest 1. MSI techniques have the ability to provide a spatially resolved feature distribution for a large range of metabolites, allowing a much greater amount of information to be obtained from a sample than from using traditional molecular imaging techniques, and they have the potential to greatly improve the analysis of biological samples for biological and pharmacology studies 2. MSI can be broadly separated into non-ambient and ambient approaches. The non-ambient MSI analysis techniques, such as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) MS 3 and time of flight secondary ion MS (ToF SIMS) 4, are capable of high spatial resolution (around 5 µm and 100 nm, respectively) and high sensitivity. However, these methods require extensive sample preparation, such as the application of matrix molecules to the sample surface, and a vacuum sampling environment, which could introduce artifacts to the data obtained. Ambient techniques such as desorption electrospray ionization (DESI) MS 5, laser ablation electrospray ionization (LAESI) MS 6, and nano-DESI MS 7 are capable of MSI of samples with little to no prior preparation under the ambient environment, which is able to produce MS images that potentially reflect the sample in its most native state. However, most of these techniques generally lack the high spatial resolution and detection sensitivity compared with the non-ambient techniques, with experiments typically conducted at around 150 µm per pixel 8.
Single cell analysis (SCA) is a growing field that has the ability to characterize the chemical composition of biological samples at the cellular level. SCA enables the analysis of biological systems at a more fundamental level than traditional cell analysis techniques, which produce an averaged result of a population of cells, potentially providing insights that are previously intractable 9. MS techniques have recently been applied to SCA (termed single cell mass spectrometry or SCMS) using non-ambient techniques such as MALDI MS 10 and ToF SIMS 11 in which cells are pretreated before analysis, and with ambient techniques such as LAESI MS 12 and direct extraction methods, such as live single-cell video-MS 13, 14, to analyze a wide variety of cell types such as egg, plant, and cancer. Ambient techniques have the advantage of being applied to live cells, which again minimizes the artifacts, leading to a better representation of the metabolites in the live cells. The direct extraction based methods described above, however, perform the sample extraction and analysis process at two different steps, which result in a time gap during the analysis that could potentially alter the metabolites present within the sample.
The single-probe, a miniaturized multifunctional device that is capable of conducting high spatial resolution ambient MSI on biological tissue sections 15 and near real-time in-situ SCMS on live single cells 16. The single-probe has an integrated construction that is made up of a pulled dual-bore quartz capillary coupled with a solvent providing inlet and a nano-ESI emitter made from fused silica capillaries, enabling solvent delivery and analyte extraction to be performed from a single device. In the ambient MSI mode, the single-probe is placed over the sample tissue and surface micro-extraction occurs, allowing a rastered MS image to be made at high spatial resolution. Particularly, the tapered tip of the single-probe is small enough to be inserted into live eukaryotic cells for in-situ SCMS analysis, where the metabolite detection takes less than two seconds between probe insertion and MS detection, allowing chemical information to be taken in near real-time. Here are the protocols to fabricate the single-probe device and to conduct both the ambient MSI and SCMS modes using the single-probe MS techniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
एकल जांच एक multifunctional डिवाइस है कि दोनों MSI और एस सी एम एस के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकल जांच सेटअप (अनुवाद चरण प्रणाली, माइक्रोस्कोप, आयन स्रोत इंटरफ़ेस निकला हुआ किनारा, आदि सहित) एक ऐड-ऑन घटक है कि लचीले ढंग से मौजूदा मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए अनुकूलित किया जा सकता के रूप में बनाया गया है। एकल जांच सेटअप और पारंपरिक ईएसआई आयन स्रोत के बीच एक तेजी से आदान-प्रदान एक मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है। सिद्धांत रूप में, उचित आयन स्रोत इंटरफ़ेस का उपयोग कर निकला हुआ, एकल जांच सेटअप किसी अन्य मास स्पेक्ट्रोमीटर लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, नमूना अभिकर्मकों की एक किस्म युक्त विलायक प्रतिक्रियाशील एमएसआई और एस सी एम एस के प्रयोगों के लिए एकल जांच सेटअप है, जो बहुत biomolecules के व्यापक पर्वतमाला का पता लगाने को बढ़ाता है के साथ प्रयोग किया जा सकता है। जानवरों के ऊतकों और सेल लाइनों के अलावा, एकल जांच भी इस तरह के पौधों के रूप में अन्य जैविक प्रणालियों का विश्लेषण करने में सक्षम है। इसलिए, एक ही प्रयोगात्मक सेटअप के साथ औरइसी तरह के उपयोगकर्ता प्रशिक्षण, अध्ययन की एक किस्म के लिए एक एकल साधन का उपयोग किया जा सकता है और एक ही उपयोगकर्ताओं द्वारा, कुशल और बहुमुखी प्रयोगों के लिए अनुमति देने के लिए न्यूनतम प्रशिक्षण समय और इंस्ट्रूमेंटेशन लागत के साथ पूरा किया जा सके।
एकल जांच एमएस तकनीक के प्रमुख घटक जांच ही है। एकल जांच की गुणवत्ता में अपने प्रदर्शन है, जो काफी हद तक दोनों MSI और एस सी एम एस के प्रयोगों की गुणवत्ता निर्धारित करता है पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है। जब एकल जांच fabricating, यकीन है कि दोहरे बोर ट्यूबिंग के अंदर केशिकाओं सुरक्षित प्रयोगों के दौरान विलायक रिसाव की संभावना को समाप्त करने के लिए चिपके रहे हैं। यह यूवी का इलाज epoxy की एक न्यूनतम राशि है, कि इस तरह के orifices और केशिकाओं जांच निर्माण के दौरान भरा नहीं कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
एकल जांच जैविक नमूने 15 पर संचालन करने के लिए उच्च स्थानिक और सामूहिक संकल्प परिवेश एमएसआई इस्तेमाल किया गया है। खत्म परिवेश एमएसआई के प्रमुख लाभगैर-परिवेश के तरीकों कि नमूना तैयार करने के लिए एक वैक्यूम नमूना पर्यावरण के लिए कोई जरूरत नहीं है, जो नमूना एक के पास देशी राज्य 8 में विश्लेषण करने की अनुमति देता के साथ एक न्यूनतम पर रखा जाता है। अधिकांश अन्य परिवेश एमएसआई तकनीक के लिए प्रमुख बाधाओं में से एक स्थानिक संकल्प 1 की कमी की गई है। desorption आधार के साथ तुलना MSI, एकल जांच की छोटी सी टिप आकार की अनुमति देता है एक और अधिक मजबूत और कुशल सतह तरल सूक्ष्म निष्कर्षण के एक उच्च स्थानिक संकल्प के लिए अग्रणी, एक छोटे से क्षेत्र पर प्रदर्शन किया जा रहा है (जैसे कि देसी और LAESI के रूप में) तकनीक 8.5 माइक्रोन, जो परिवेश एमएसआई तकनीक का प्रयोग कर प्राप्त 15 सबसे ज्यादा लोगों के बीच है। इसके अलावा, नमूना विलायक के घटकों का समायोजन अतिरिक्त लचीलेपन के प्रयोगों का संचालन करने के लिए प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, नमूने अभिकर्मकों (जैसे, dicationic यौगिकों) युक्त सॉल्वैंट्स प्रतिक्रियाशील एमएसआई प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, पहचान चयापचयों पीई की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि के लिए अनुमतिआर प्रयोग 20। एकल जांच के अन्य लाभ यह एकीकृत डिजाइन, जो पूरे डाटा अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान आपरेशन में आसानी प्रदान करता है। क्योंकि नोक और ऊतकों की सतह के बीच की दूरी आयन संकेत तीव्रता और स्थिरता, एक फ्लैट ऊतक अनुभाग प्राप्त करने और समायोजन सपाट दूरी विचरण को कम से कम करने के लिए सतह के संचालन के लिए बहुत ही संवेदनशील है उच्च गुणवत्ता एमएसआई प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण है। यह इस प्रकार है कि एकल जांच एमएसआई तकनीक असमान सतहों के उच्च स्थानिक एमएस छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
एक उच्च गुणवत्ता जांच fabricating के अलावा, ध्यान से साधन ट्यूनिंग सफल एमएसआई प्रयोग के लिए आवश्यक है। सभी ट्यूनिंग कदम के अलावा, ऊपर ऊतक अनुभाग सतह एकल जांच टिप की ऊंचाई का समायोजन सबसे महत्वपूर्ण एक है। जब जांच ऊंचाई का समायोजन, नमूने विलायक पंप और, आयनीकरण वोल्टेज पर बारी इतना है कि केवल विलायक पृष्ठभूमि आयन संकेतों observ हो सकता हैईडी। फिर जन स्पेक्ट्रम के परिवर्तन की निगरानी करते हुए सावधानी से जब तक ऊतक अनुभाग से मजबूत और स्थिर आयन संकेतों मनाया जा सकता है मोटर जेड चरण उठाने से जांच-सतह दूरी को कम करने; इस जांच ऊंचाई प्रयोग के दौरान एमएसआई डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। इसके अलावा, एक अनुकूलित विलायक प्रवाह की दर एमएसआई प्रयोगों के लिए आवश्यक है। अनुकूलित जांच ऊंचाई के साथ प्रवाह दर को समायोजित। सुनिश्चित करें ऊतक सतह पर कोई विलायक प्रसार है कि वहाँ (यानी, प्रवाह की दर बहुत अधिक है) या नैनो ईएसआई emitter (यानी, प्रवाह की दर बहुत कम है) के अंदर बुलबुला गठन।
एकल जांच bioanalysis के लिए एक multifunctional डिवाइस है। एमएसआई के प्रयोगों के अलावा, यह वास्तविक समय में सीटू एस सी एम एस लाइव कोशिकाओं 16 से विस्तृत रासायनिक जानकारी है, जो एक बड़ा फायदा है अन्य वैक्यूम के साथ तुलना में स्पष्ट करने के लिए निकट आयोजित करने में सक्षम है इस तरह के MALDI 10 और एस के रूप में आधारित एस सी एम एस तकनीक ( 21 </sup>)। जांच टिप के छोटे आकार की क्षमता एक जीवित यूकेरियोटिक सेल में डाला जाएगा और निकालने के लिए और तत्काल एमएस विश्लेषण के लिए intracellular यौगिकों योण बनाना है। इसी तरह, नमूना अभिकर्मकों (जैसे, dicationic यौगिकों) युक्त सॉल्वैंट्स एस सी एम एस प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, और सेलुलर घटकों में से एक व्यापक रेंज से पहले से कहीं ज्यादा एक लाइव एकल कोशिका में पाया जा सकता है (चल रहे अनुसंधान, डेटा नहीं दिखाए जाते हैं)। हालांकि वास्तविक समय विश्लेषण झिल्ली और सेलुलर सामग्री की निकासी की सेल पैठ के कारण लाइव एकल कक्षों की रासायनिक प्रोफाइल, प्रदान करेगा, जांच के तहत सेल प्रयोग के बाद मार डाला जाएगा, जिसका अर्थ एकल जांच एस सी एम एस तकनीक अभी भी है कि एक विनाशकारी विधि। इसके अलावा, जांच टिप और एकल जांच में नैनो ईएसआई emitter आसानी से अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए भरा जा सकता है। डिवाइस clogging की संभावना को कम करने के लिए, जब एक सेल में एकल जांच टिप डालने नाभिक को छू से बचने के लिए सुनिश्चितएल। Clogging होता है, तो डिवाइस भरा जांच टिप या एक homebuilt हीटिंग का तार 16 का उपयोग emitter नैनो ईएसआई को हीटिंग द्वारा पुनर्जीवित किया जा सकता है। एकल जांच एस सी एम एस तकनीक का एक और सीमा यह है कि केवल चिपकने वाला कोशिकाओं (यानी, कोशिकाओं सतहों से जुड़े होते हैं) मौजूदा सेटअप का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि, एकल जांच एमएस तंत्र में सेल हेरफेर प्रणाली को शामिल करके, सेल के व्यापक प्रकार भविष्य में अध्ययन किया जा सकता है।
एमएसआई प्रयोग करने के लिए भी इसी तरह, एक उच्च गुणवत्ता जांच और एक अनुकूलित विलायक प्रवाह की दर प्राप्त करने एस सी एम एस के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। जब विलायक प्रवाह की दर ट्यूनिंग, एकल जांच टिप नमूना ऊपर रखा गया है (यानी, सेल या संस्कृति के माध्यम से कोई संपर्क नहीं), और यह सुनिश्चित जांच टिप या नैनो ईएसआई के अंदर बुलबुला गठन से कोई विलायक टपकता है कि वहाँ emitter।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Laskin (the Pacific Northwest National Laboratory) for sharing the motorized stage control software and MSI visualization program. We also thank Dr. Mao (the University of Oklahoma) for providing mouse organ samples and Mr. Chad E. Cunningham (the University of Oklahoma) for the assistance in machining and electronics work. This research was supported by grants from the Research Council of the University of Oklahoma Norman Campus, the American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsored by Waters Corporation), Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152), and National Institutes of Health (R01GM116116).
Materials
| Single-probe fabrication | |||
| Dual bore quartz tubing, 1.120’’×0.005”×12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
| Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
| Fused silica capillary, ID: 40µm, OD: 110µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
| UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
| LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
| Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
| Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
| Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
| Microscope slide (glass) | C & A Scientific – Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
| Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mass spectrometer | |||
| LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
| Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
| Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Contact closure device | |||
| USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
| Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Single-probe setup | |||
| Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
| Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
| Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
| Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
| Digital stereo microscope, 250X-2000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
| USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
| Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
| Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
| Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents | |||
| Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
| Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
| 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
| 10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
| 12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
| T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
| Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue imaging | |||
| Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
| Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
| Microscope slide (polycarbonate ) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P |
References
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