Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.
Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 µm) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (< 10 µm), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a relatively new molecular imaging technique to provide the spatial distribution of the compounds of interest on surfaces. During the MSI analysis, mass spectrometry (MS) measurements are recorded across the surface on an individual pixel basis to create a 2D image of the species of interest 1. MSI techniques have the ability to provide a spatially resolved feature distribution for a large range of metabolites, allowing a much greater amount of information to be obtained from a sample than from using traditional molecular imaging techniques, and they have the potential to greatly improve the analysis of biological samples for biological and pharmacology studies 2. MSI can be broadly separated into non-ambient and ambient approaches. The non-ambient MSI analysis techniques, such as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) MS 3 and time of flight secondary ion MS (ToF SIMS) 4, are capable of high spatial resolution (around 5 µm and 100 nm, respectively) and high sensitivity. However, these methods require extensive sample preparation, such as the application of matrix molecules to the sample surface, and a vacuum sampling environment, which could introduce artifacts to the data obtained. Ambient techniques such as desorption electrospray ionization (DESI) MS 5, laser ablation electrospray ionization (LAESI) MS 6, and nano-DESI MS 7 are capable of MSI of samples with little to no prior preparation under the ambient environment, which is able to produce MS images that potentially reflect the sample in its most native state. However, most of these techniques generally lack the high spatial resolution and detection sensitivity compared with the non-ambient techniques, with experiments typically conducted at around 150 µm per pixel 8.
Single cell analysis (SCA) is a growing field that has the ability to characterize the chemical composition of biological samples at the cellular level. SCA enables the analysis of biological systems at a more fundamental level than traditional cell analysis techniques, which produce an averaged result of a population of cells, potentially providing insights that are previously intractable 9. MS techniques have recently been applied to SCA (termed single cell mass spectrometry or SCMS) using non-ambient techniques such as MALDI MS 10 and ToF SIMS 11 in which cells are pretreated before analysis, and with ambient techniques such as LAESI MS 12 and direct extraction methods, such as live single-cell video-MS 13, 14, to analyze a wide variety of cell types such as egg, plant, and cancer. Ambient techniques have the advantage of being applied to live cells, which again minimizes the artifacts, leading to a better representation of the metabolites in the live cells. The direct extraction based methods described above, however, perform the sample extraction and analysis process at two different steps, which result in a time gap during the analysis that could potentially alter the metabolites present within the sample.
The single-probe, a miniaturized multifunctional device that is capable of conducting high spatial resolution ambient MSI on biological tissue sections 15 and near real-time in-situ SCMS on live single cells 16. The single-probe has an integrated construction that is made up of a pulled dual-bore quartz capillary coupled with a solvent providing inlet and a nano-ESI emitter made from fused silica capillaries, enabling solvent delivery and analyte extraction to be performed from a single device. In the ambient MSI mode, the single-probe is placed over the sample tissue and surface micro-extraction occurs, allowing a rastered MS image to be made at high spatial resolution. Particularly, the tapered tip of the single-probe is small enough to be inserted into live eukaryotic cells for in-situ SCMS analysis, where the metabolite detection takes less than two seconds between probe insertion and MS detection, allowing chemical information to be taken in near real-time. Here are the protocols to fabricate the single-probe device and to conduct both the ambient MSI and SCMS modes using the single-probe MS techniques.
Den enkelt-proben er en multifunksjonell anordning som kan brukes til både MSI og SCMS eksperimenter. Singelen-probe oppsett (inkludert oversettelse scenesystemer, mikroskoper, ion kilde grensesnitt flens, etc.) er utformet som en add-on komponent som kan fleksibelt tilpasses den eksisterende massespektrometer. En rask utveksling mellom enkelt-proben oppsett og den konvensjonelle ESI ione-kilde som kan oppnås i løpet av ett minutt. I prinsippet, ved anvendelse av hensiktsmessig ionekilden grensesnitt flens, enkelt-proben oppsett kan tilpasses til de eventuelle andre massespektrometre. I tillegg kan prøvetagningsløsningsmiddel inneholdende en rekke forskjellige reagenser kan brukes med en enkelt sonde-oppsett for reaktive MSI og SCMS eksperimenter, som i stor grad forbedrer deteksjonen av et videre spekter av biomolekyler. I tillegg til animalsk vev og cellelinjer, er det enkelt-proben også i stand til å analysere andre biologiske systemer slik som planter. Derfor, med den samme eksperimentelle oppsettet oglignende brukeropplæring, kan en rekke studier utføres ved hjelp av et enkelt instrument og av de samme brukerne, noe som åpner for effektiv og allsidig eksperimenter skal gjøres med minimum opplæringstid og instrumentering kostnader.
Nøkkelkomponenten av den enkelt-proben MS teknikk er proben i seg selv. Kvaliteten på single-sonden har en betydelig innvirkning på ytelsen, som i stor grad avgjør kvaliteten på både MSI og SCMS eksperimenter. Når fabrikere single-sonder, sørg for at kapillærene innsiden av dual-boring rør er forsvarlig limt til eliminere muligheten for løsemiddel lekkasje under forsøkene. Det er viktig å bruke en minimal mengde av UV-herdbare epoksy, slik at åpningene og kapillærer ikke blir tilstoppet under sonden fabrikasjon.
Den enkelt-probe er blitt brukt for å drive med høy romlig oppløsning og masseomgivelses MSI på biologiske prøver 15. Den store fordelen med ambient MSI løpetikke-normale metoder er at prøvepreparering, holdes på et minimum uten behov for et vakuum samplings miljø, som gjør at prøven som skal analyseres i en nær naturlig tilstand 8. En av de største hindringer for de fleste andre omgivelses MSI teknikken har vært mangel på en romlig oppløsning. Sammenlignet med desorpsjon basert MSI teknikker (for eksempel DESI og LAESI), den lille tuppen størrelsen av enkelt sonde tillater en mer robust og effektiv overflate væske mikro-ekstraksjon utføres over et lite område, noe som fører til en høy romlig oppløsning av 8,5 um, som er blant de høyeste som er oppnådd ved hjelp av omgivelses MSI teknikker 15. I tillegg justering av komponentene i prøvetakingsløsningsmidlet gir ekstra fleksibilitet til å utføre forsøkene. For eksempel, prøvetaking løsemidler som inneholder reagenser (f.eks dicationic forbindelser) har vært brukt til å utføre reaktive MSI eksperimenter, slik at for en betydelig økning i antall metabolitter identifiserte per eksperiment 20. Den andre fordelen av single-sonde er integrert design, som gir enkel betjening under hele datainnsamlingsprosessen. På grunn av at avstanden mellom spissen og overflatevevet er meget følsom for ioner signal intensitet og stabilitet, å skaffe en flat vev seksjon og ledende overflate flatere justering for å minimere avstanden variansen er en nøkkel for høykvalitets MSI eksperimenter. Det følger at de enkelt-sonde MSI teknikker er ikke egnet for å oppnå høy romlig MS bilder av ujevne overflater.
I tillegg til fremstilling av en høy kvalitet sonde, forsiktig tuning instrumentet er avgjørende for en vellykket MSI eksperiment. Blant alle justeringstrinn, å justere høyden av enkeltsondespissen ovenfor vevet seksjonen overflate er den mest kritiske en. Ved justering av sonden høyden, pumpe prøvetaking løsemiddel og slå på ionisering spenning, slik at bare de løsemiddelbakgrunns ion-signaler kan være observatøred. Deretter overvåke endringen av massespekteret samtidig som man reduserer sonde-overflaten avstand ved å løfte den motordrevne Z-trinns til sterke og stabile ion signaler fra vev seksjon kan observeres; denne sonde høyde vil bli brukt for MSI datainnsamling under forsøket. I tillegg er en optimalisert løsningsmiddelstrømningshastighet avgjørende for MSI eksperimenter. Juster strømningshastighet med optimalisert sonde høyde. Sikre at det ikke er noe løsningsmiddel spredt på vevsoverflaten (dvs., er strømningshastigheten for høy) eller bobledannelse inne i nano-ESI emitter (dvs. strømningshastighet er for lav).
Singelen-sonde er en multifunksjonell enhet for bioanalyse. I tillegg til de MSI eksperimenter, er den i stand til å gjennomføre nær sanntid in-situ SCMS å belyse detaljert kjemisk informasjon fra levende eukaryote celler 16, som er en stor fordel sammenlignet med andre vakuumbaserte SCMS teknikker (for eksempel MALDI 10 og SIMS 21 </sup>). Den lille størrelsen på sondespissen gir mulighet til å føres inn i en levende eukaryot celle og for å ekstrahere og ionisere de intracellulære forbindelser for umiddelbar MS-analyse. På samme måte kan prøvetakingsløsemidler som inneholder reagenser (f.eks dicationic forbindelser) anvendes i SCMS eksperimenter, og et bredere spekter av cellebestanddeler kan påvises i en levende enkelt celle enn noen gang før (pågående forskning, data ikke vist). Selv om sanntids analyse vil gi de kjemiske profiler av levende enkle celler, på grunn av cellegjennomtrengning av membranen og utvinning av celleinnholdet, vil cellen som undersøkes bli drept etter forsøket, noe som tyder på at den enkelt-proben SCMS teknikk er fremdeles en destruktiv metode. I tillegg kan sondespissen og nano-ESI emitter i single-sonden være lett tilstoppet for uerfarne brukere. For å redusere sjansen for enheten tilstopping, sørge for å unngå å berøre kjernen når du setter den enkelt-sonde tips til en cell. Hvis tilstopping oppstår, kan enheten regenereres ved å varme opp tett probespissen eller nano-ESI emitter bruker en homebuilt varmebatteri 16. En annen begrensning ved den enkelt-proben SCMS teknikken er at bare de klebende celler (dvs. celler som er festet til overflatene) kan analyseres ved bruk av nåværende oppsett. Imidlertid, ved å inkorporere cellen manipulering systemet i enkelt-proben MS apparat, bredere celletypene kan studeres i fremtiden.
I likhet med MSI forsøket, å oppnå en høy kvalitet sonde og en optimalisert oppløsningsmiddel strømningshastighet er avgjørende for SCMS studier. Når tuning løsningsmidlet strømningshastighet, er det enkelt-sondespissen plassert over prøven (dvs. ingen kontakt med cellen eller kulturmedium), og sikre at det ikke er noe løsningsmiddel drypper fra sondespissen eller bobledannelse inne i nano-ESI emitter.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Laskin (the Pacific Northwest National Laboratory) for sharing the motorized stage control software and MSI visualization program. We also thank Dr. Mao (the University of Oklahoma) for providing mouse organ samples and Mr. Chad E. Cunningham (the University of Oklahoma) for the assistance in machining and electronics work. This research was supported by grants from the Research Council of the University of Oklahoma Norman Campus, the American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsored by Waters Corporation), Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152), and National Institutes of Health (R01GM116116).
Single-probe fabrication | |||
Dual bore quartz tubing, 1.120’’×0.005”×12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
Fused silica capillary, ID: 40µm, OD: 110µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
Microscope slide (glass) | C & A Scientific – Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass spectrometer | |||
LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Contact closure device | |||
USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Single-probe setup | |||
Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
Digital stereo microscope, 250X-2000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solvents | |||
Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue imaging | |||
Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
Microscope slide (polycarbonate ) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P |