Protocol
Animal bruk og velferd bør følge guiden NIH for omsorg og bruk av forsøksdyr følgende protokoller gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). Muse vevsprøver ble levert av samarbeidspartner Dr. Chuanbin Mao.
1. Mouse Tissue del Fremstilling
- Plasser en hel mus organ av interesse (hjerne, nyre, lever, etc.) inn i sentrum av en liten plast vel (som 12-brønners cellekulturplate), og gå ned i vev innebygging forbindelse opptil ca. 10 mm høyde. Pass på at det ikke er noen boble dannes i vevet innebygging sammensatte og at orgelet er plassert i ønsket retning (dvs. sagittal, koronal, etc.).
- Umiddelbart plassere vev i flytende nitrogen for flash frysing. For langtidslagring, lagrer de frosne prøvene i en -80 ° C fryser.
- Ta den frosne mus orgel og tine til -15 ° C i en temperare kontrollert cryomicrotome.
- Sikker vev på et stål med ca 500 ul av vev bygge sammensatte og plasser den på en cryomicrotome seksjonering montere slik at den ønskede seksjonering orientering blir presentert for kniven.
- Seksjon vevet til en 12 um tykkelse. Plasser seksjonert vevssnitt på polykarbonat objektglass og la det tørke i 30 minutter ved romtemperatur. For langtidslagring, lagre den frosne lysbilde i en -80 ° C fryser.
2. Cell Culture
Merk: Cellekultur ble utført i biologisk sikkerhetskabinett (biosikkerhetsnivå II) under sterile forhold. HeLa-cellelinjen ble brukt som et modellsystem, og cellene ble dyrket i komplett kulturmedium med følgende konvensjonelle protokoller:
- Varme reagenser (dvs. trypsin, fosfatbufret saltvann (PBS), og cellekulturmedium) til 37 ° C.
Merk: cellekulturmedium inneholder uorganisk SAlts, aminosyrer, vitaminer og andre. For en fullstendig liste over bestanddeler, se formuleringen fra produsenten. - Skaff celleprøve (for eksempel en ml HeLa cellesuspensjon) og legge den inn i 9 ml komplett cellekulturmedium i en standard 10-cm cellekultur plate. Den opprinnelige celleantall er rundt 0,5 x 10 6 celler / ml. Holde-celler i kultur ved 37 ° C med 5% CO2 i 2-3 dager inntil den voksende overflate er dekket ved 70-80% i cellekulturplaten. Record celle passasje nummer for hver påfølgende runde.
- Utfør celleaging (dvs. celle splitting) i cellekulturplaten.
- Sug av vekstmedium, og bruke 5 ml 1 x PBS for å skylle cellene. Fjern PBS ved hjelp av en steril aspirasjon spiss, og inkuberes cellene med 2,5 ml trypsin (0,25%) i ~ 5 min ved 37 ° C for å løsne cellene fra kulturplaten.
Merk: Den faktiske trypsin Behandlingstiden må være optimalisert i henhold til den spesifikke trypsin proct kjøpt fra produsenten. Utilstrekkelig behandlingstiden forlater cellene festet seg til platen, mens overdreven behandling fører til celledød. - Stoppe trypsin-aktivitet ved å tilsette 7,5 ml komplett cellekulturmedium, og deretter jevnt resuspender cellene (totalvolum 10 ml). Bruk cellesuspensjonen for kultur (trinn 2.2) eller utarbeidelse av SCMS prøver (trinn 2.4).
- Sug av vekstmedium, og bruke 5 ml 1 x PBS for å skylle cellene. Fjern PBS ved hjelp av en steril aspirasjon spiss, og inkuberes cellene med 2,5 ml trypsin (0,25%) i ~ 5 min ved 37 ° C for å løsne cellene fra kulturplaten.
- Forbered celleprøver for SCMS eksperimenter.
- Plassere individuelle mikro-dekkglass i en 12-brønners plate og tilsett 1,8 ml cellekulturmedium og 0,2 ml av cellesuspensjonen inn i brønnen.
- Bland forsiktig celler med mild agitering av platen, og inkuberes i en 5% CO2 miljø ved 37 ° C i ~ 24 timer. For å utføre medikamentell behandling til de dyrkede celler, legge til en medikamentforbindelse løsning (for eksempel i DMSO (dimetylsulfoksid)) i 12-brønners cellekultur plate.
Merk: Den endelige legemiddelkonsentrasjon (f.eks 10 nM, 100 nM, 1fiM, og 10 mm) og treatment tid (for eksempel 4 timer) blir variert i henhold til det spesifikke formål studier. Celler som er festet til mikro-dekkglass og klar for CSMS eksperimenter (trinn 6).
3. Single-probe Fabrication
- Plasser den dual-boring kvarts rør (indre diameter (ID) 127 um, ytre diameter (OD) 500 mikrometer) i en laser mikropipette avtrekker og trekke en dual-boring kvarts nål. Bruk følgende parametere som utgangspunkt: Heat = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150, og Pul = 250 (alle enheter er produsentens enheter). Sørg trakk dual-boringen kvarts nål har en konisk spiss for optimal probe egenskaper. Skjær den inntrukne spiss, slik at det er ~ 5 mm langt fra unpulled dual-boring kvarts kapillær venstre i den andre enden.
Merk: Den faktiske parametrene av laser avtrekker bør være optimalisert i henhold til de spesifikke forholdene i instrumentet. - Skjær en ~ 80 mm seksjon av smeltet silika kapillær (ID 40 mikrometer, OD. 105 mikrometer) som løsemiddel gi kapillært, og sett det inn i ett løp på den flate enden av dual-boringen kvarts nål.
- Skjær en ~ 40 mm seksjon av smeltet silika kapillær (ID 40 mikrometer, OD 105 nm) og bruke en barberhøvel til å barbere ~ 5 mm av polyamid belegget fra midtpunktet. Bruk en propanflamme for å raskt varme og trekk smeltet kapillært til en nano-electrospray ionisering (ESI) emitter med en fin taper. Skjær en nano-ESI emitter (~ 7-10 mm lang), og sett den inn i den andre boringen på den flate enden av dual-boringen kvarts nål. Alternativt kan du bruke laser avtrekker for å produsere en fin taper.
- Anvende en minimal mengde av (~ 1-2 ul) UV-herdende harpiks på den flate enden av dobbelt boringen kvarts nål, og stivner harpiksen ved hjelp av en LED-UV-lampe for ~ 20 sekunder for å sikre løsningsmidlet gir kapillær og nano- ESI emitter. Fremgangsmåtene for å montere de enkelte delene i en enkelt-probe er vist i figur 1a.
- Skjær en standard mikroskop glass lysbilde (1 "x 3") i halv lengderetning. Plasser den enkelt-proben på en ende av objektglasset, slik at nano-ESI emitter er rettet utover. Anvende den vanlige epoksy til kroppen av enkelt-proben, slik at det blir festet på glass-slide (figur 1b). La over natten for herding. Par den fabrikkerte enkelt-sonde med den integrerte enkelt-probe oppsett (figur 1c), som er festet til et massespektrometer som illustrert i figur 1d.
4. Bygg Integrert Single-probe MS Setup
- Modifisere ionekilden grensesnittet flens massespektrometer og fremstille stativet (med justerbar posisjon og høyde) av den digitale stereoskop (fig 1e og 1f).
- Boring av en ionekilde grensesnitt flens med to hull som muliggjør festing av et aluminium optisk bord. Lag en glideskinne enhet og en høydejustering stang (knyttet tilet XY scene for fine stilling tuning), slik at den digitale stereoskop-systemet kan festes til aluminium optiske kortet (figur 1E).
- Feste den modifiserte digitale stereomikroskop, et USB digitalt mikroskop, en miniatyr manuell XYZ oversettelsestrinnet med en fleksibel klemme holder, den motordrevne XYZ oversettelsestrinnet system til den optiske aluminium bord, som er montert på den tilpassede ionekilden grensesnitt flensen på massespektrometer (Tall 1c og 1f). Bruk fleksibel klemholderen å fikse glass-slide festet med en single-sonde.
- Fest single-sonde oppsett til massespektrometer (Figur 1f). Juster den fleksible klemholderen og den miniatyr XYZ trinnet for å plassere emitter av enkelt-proben foran innløpet til massespektrometer. Bruk USB digitalt mikroskop (med regulerbar vis vinkel) på siden av enkelt-proben for å tilveiebringe en zoomet inn bilde av enkel-pkappe spissen eller nano-ESI emitter, og den digitale stereoskop (med justerbar høyde) over enkelt-proben for å vise celler og sondespissen.
Merk: Ved å bruke det tilsvarende ionekilden flens, kan denne integrerte enkeltsondesystem kobles til andre typer av massespektrometrene som er utstyrt med omgivelses ionisering kilder.
5. Ambient MSI
- Tine prøven seksjonen ved romtemperatur og plasser det motoriserte XYZ oversettelse trinns system under single-sonde. Juster prøveposisjon ved å endre koordinatene i styreprogramvaren.
- Ved hjelp av sprøyte for å pumpe prøvetaking oppløsningsmiddel ved en passende hastighet (f.eks, 0,2 mL / min), og anvende ioniseringen spenning (for eksempel 5 kV). Utvelgelsen av samplingsløsningsmiddel er fleksibel, og de vanligste er MeOH: vann (9: 1) og acetonitril. Dødvolumet av nano-ESI emitter ble estimert til å være ~ 3 nl, og tiden mellom sonde-Surface kontakt og ion signal observasjon er vanligvis mindre enn 1 sek 15.
Merk: tilpasset ion kilde grensesnitt flensen gjør at ionisering spenningen som skal leveres fra massespektrometer til en ledende union gjennom en krokodille klipp. Ionisering spenningen blir så overført gjennom en ledende forening til løsemiddelet inne i kapillært og single-probe-kanaler, og påføres nano-ESI emitter å ionisere samplede analytter. Kontroller at ionisering spenningen er slått av når du kobler til krokodilleklemme med den ledende forening. - Juster høyden av enkelt sonden, slik at det hviler like over overflaten av prøven og i stand til å utføre overflate utvinning av metabolitter. Løft forsiktig Z-scenen, og deretter bruke USB digitalt mikroskop (på siden av single-probe) for å overvåke avstanden endringen mellom enkelt probespissen og overflatevevet. Overvåke endringer i massespekteret i løpet av denne høydejustering, og stoppe heisening Z-fasen når en endring av ione-signalet fra oppløsningsmiddel bakgrunn til vev metabolitter observeres.
- Gjenta trinn 5.3 tre ganger for å sette tre forskjellige punkter innenfor scenen kontrollprogram for automatisert overflaten utflating justering. Plassere spissen av enkelt-proben ved tre punkter på prøveoverflaten i en avstand på ca 10 mm fra hverandre. Utfør høydejustering ved å trykke opp og ned ikoner, og låse de tre punktene på plass under "Plan-metoden".
- Sett andre parametere for å rastrere over den delen av interesse i prøven ved hjelp av dette programmet. For musenyre seksjoner som presenteres her, kan du bruke en 10,0 mikrometer / sek rastrere hastighet og 20 mikrometer avstand mellom linjene. Den motoriserte trinns system har et 0,1 um minimum tilvekst bevegelse. Avstanden mellom enkeltsondespissen og vev blir oppnådd fra trinn 5.3.
- Satt opp en fremgangsmåte for automatisert kjøp av MS-spektrene fra de massespektrometer. for høymesse oppløsning MSI på mus nyre prøve, kan du bruke følgende parametere: masse oppløsning 60000 (m / Δm), ~ 5 kV positiv modus, 1 micro, 150 msek max injeksjon tid, og AGC på. Alle ervervet MS-spektra som representerer de enkelte linjer av MS bilde hadde samme antall skanninger med ensartet tidsavstanden mellom hver skanning, noe som indikerer at bildepunktstørrelser for de bilder produsert var jevnt fordelt.
- Initiere MSI datainnsamling. Initiere MS akkvisisjonssekvens for massespektrometer, og deretter starte rastrere sekvens for XYZ kontrollprogram.
- For eksempel i MS datainnsamlingsprogram benyttes her, gå til "Sequence setup", velg "New sekvens", generere et sett med filer for en ny sekvens nummerert fra 01 til X, der X er antall linjer som brukes til ønsket MS bildet tas, og trykk deretter "Run sekvens".
- Bruk en hjemmelaget elektronisk enhet for å tillate programvare for å produsere en Contact lukkesignal for massespektrometeret for å samle inn data. Det koblingsskjema er vist i den supplerende figuren (fig S1) som en referanse.
- Konstruer MS bilder fra rå MS-filer ved hjelp av passende MSI visualisering programvare. For eksempel, når du bruker programvarepakke utviklet av Laskin gruppe på PNNL 17, utføre følgende trinn.
- Klikk "Brows File". Velg den første filen hentet fra MSI forsøket. Angi hvor filen starter og slutter i henhold til "Antall linjer." Velg en rekke m / z-verdier for MS bildeområdet under "Enter MZ Range".
- Trykk på "Start" -knappen for å starte bildeskaping prosessen. Når MS bildet er gjort, klikk på "Lagre bilde" under "Toolbar" for å lagre bilder på datamaskinen.
6. I-situ Levende SCMS
- Oppsett av enkelt-sonde system som per instruereioner for MSI. Juster løsningsmiddel (f.eks, MeOH / H 2 O eller acetonitril) strømningshastighet (for eksempel 25 ~ nl / min).
- Vask de dyrkede celler, som er festet på mikrodekkglass, med PBS for å fjerne kultur- medier og ekstracellulære legemiddelkomponentene. Plasser celle med glass-slide på motoriserte XYZ oversettelse trinns system for forsøket.
Merk: Du kan også bruke den friske cellekulturmedium (uten å inneholde føtalt bovint serum) for å skylle de dyrkede celler. Mindre ion undertrykkelse har blitt observert. I tillegg kan celle overleve i lengre tid under forsøket hvor omgivelsestemperatur (~ 20 ° C) er betydelig lavere enn den temperatur kultur (37 ° C). Den medikamenttype, løsningskonsentrasjon, og behandlingstiden variere i forskjellige studier. - Fokusere den digitale stereomikroskop (over prøven) på tuppen av den enkelt-proben for å overvåke cellegjennomtrengning under analysen. Bruk USB digitalt mikroskop (på side av single-sonde) for å overvåke arbeidsforholdene i nano-ESI emitter på single-sonde.
- Bruk motoriserte XYZ scenen kontrollprogram og digital stereo mikroskop (ovenfor celler) for å finne en celle av interesse, og nettopp posisjonere single-sondespissen over prøven. Starter MS datainnsamling før den enkelt-sonde-spissen føres inn i cellen.
- Bruk følgende parametere som referanser for MS analyse ved hjelp av et høyoppløselig massespektrometer: masse oppløsning 100 000 (m / Δm), ~ 3 kV positiv og negativ modus, 1 micro, 150 msek maks injeksjon tid, AGC-modus på. Automatisert kjøpet av MS spektra gjøres ved å klikke på "Start" i MS datainnsamlingsprogram.
- Løft motorisert Z-scenen ved å klikke på ikonet for å trenge gjennom cellemembranen og holde opptaket MS signal genereres fra cellen. En tidsforsinkelse på 1-2 sekunder er vanligvis observert mellom proben innsetting og signaldeteksjons MS. Som bekreftelse påcelle penetrasjon, en dramatisk endring av MS-signalene kan observeres ved inntrengning av cellemembranen. MS signaler om intracellulære forbindelser vanligvis kan vare i ~ 15-20 sek før en betydelig nedgang.
- Lavere ned i cellen inneholdende plate for å trekke den enkelt-sondespissen ut fra cellen. Det tar vanligvis <15 sek for ion-signalene fra de cellulære forbindelser for å nærme seg støynivået. La løsningsmidlet strømnings for ~ 3 minutter for fullstendig å spyle den enkelt-proben. I mellomtiden, plasserer den motoriserte XYZ-trinns system for å lokalisere den neste celle som skal analyseres. Hver celle eksperimentet krever ~ 3 min å være dyktig.
Representative Results
Den enkelt-proben ble med hell anvendt for omgivelses MSI analyse av kåret musenyrevevet 15. Enheten bruker mekanismen av overflaten væske mikro-ekstraksjon (Figur 1a), som gir svært effektiv analytt utvinning fra et lite område, som fører til rikelig ion signaler intensiteter i MSI resultater. For eksempel, er signalintensitetene av mer enn 10 7 blitt oppnådd for noen rikelig metabolitter (figur 2a). Et stort antall av metabolitter ble detektert på denne måte, herunder et antall sfingomyelin (SM) og fosfatidylcholin (PC) arter som [SM (34: 1) + Na] + (725,5575 m / z), [PC (32: 0) + H] + (734,5700 m / z), [PC (34: 1) + Na] + (782,5696 m / z), og [PC (38: 5 + Na)] + (814,5726 m / z). Disse forbindelser ble identifisert med høy oppløsning masse og masse nøyaktighet når kombinert toa høy oppløsning massespektrometer. For eksempel ble identifikasjon oppnås med mindre enn 4 ppm m / z masse nøyaktighet (dvs. forskjellen mellom den observerte og teoretiske verdier) for hver metabolitt (figur 2b) på resultatene presentert her. I tillegg analyserer tandem MS (dvs. MS / MS) ble også gjennomført for mer trygg identifisering av arter av interesse. 15
På grunn av evnen til å utføre effektiv væske mikro-ekstraksjon på et lite område, kan den enkelt-sondeanordningen brukes til å utføre høy romlig oppløsning MSI eksperimenter under omgivelsesbetingelser 15. For eksempel har detaljerte MS bilder av musenyreseksjoner er innhentet viser den romlige fordelingen av utvalgte metabolitter (figur 2c). Den romlige oppløsning av MS bildet ble bestemt til å være 8,5 um, etter den mye brukte beregningen av å ha transiti. på punktet i en skarp funksjonen styres innenfor et intensitetsendring av MS signal 20-80% 18 I tilfellet av fosfolipid [PC (38: 5 + Na)] + på musen nyre delen, funksjonen overgangen mellom den indre medulla og den ytre marg finner sted over en scan syklus i chronogram, viser en intensitet endring større enn 20-80% rekkevidde. Basert på prøven bevegelige Hastighet (10,0 pm / sek) og MS datainnsamlingshastighet (0.85 sec / spektrum), prøven beveger avstand i en MS skanne syklus (8,5 um), dvs. MSI romlig oppløsning, kan beregnes (figur 2d). Dette romlig oppløsning er blant de høyeste ennå oppnådd for omgivelses MSI teknikker utført på biologiske prøver.
For SCMS enkelt-proben var i stand til å oppnå en analyse av enkelt levende HeLa-celler 16. Spissen størrelsen av enkelt sonden er typisk mindre enn 10 um (Figure 3a), som er liten nok til å være direkte innsatt i mange typer av eukaryote celler, av hvilke diameteren er ~ 10 mikrometer, for utvinning og MS-analyse. Den innsettingsprosessen av enkeltsondespissen inn i en celle kan bli visuelt overvåket ved bruk av en digital stereomikroskop (figur 3b), og cellemembranen gjennomtrengning kan bekreftes ved hjelp av rask og vesentlig endring av massespektra fra PBS (eller frisk cellekultur medium) til intracellulære forbindelser (figurene 3c og 3d). Forsøkene kan utføres i både positive og negative ion-modus for å detektere bredere typer av molekylarter. For eksempel, ble det identifisert 18 forskjellige lipid-arter i den positive modus, inkludert sfingomyeliner (SM) og fosfatidylcholiner (PC), mens adenosin-fosfater (AMP, ADP og ATP) ble påvist i den negative ion-modus (fig 3c og d). Tidsforsinkelsen mellom den enkelt-proben innsetting inFor en celle og signaldeteksjon, vanligvis mindre enn to sekunder, slik at en nær sanntid deteksjon av cellulære metabolitter. SCMS ble også brukt til eksperimenter hvor celler ble behandlet med kreftmedisiner (f.eks OSW-en, paclitaxel og doksorubicin) 19]. De tilsvarende medikamenter kan bli detektert i løpet av HeLa-celler etter 4 timers behandling ved en rekke konsentrasjoner (det vil si, 10 nM, 100 nM, 1 uM og 10 uM) i DMSO (dimetylsulfoksyd), ved hjelp av ubehandlede celler (add DMSO bare ) som kontrollene. MS-signalene i legemidler var ikke til stede i det ekstracellulære PBS eller kontroll (figur 3E), men ble påvist i de enkle celler ved bruk av enkelt-proben MS teknikk (bare 100 nM behandlingsresultater er vist i figur 3f). Fordi cellene ble skylt med PBS (eller frisk cellekulturmedium) for å fjerne ekstra-cellulære forbindelser og forurensninger, påvisning av endogene metabolitter (for eksempel celle lipider and adenosin fosfater) og eksogene forbindelser (f.eks anticancer-legemidler) indikerer at Single-sonde MS-teknikken kan brukes til å analysere intracellulære forbindelser.
Figur 1. Fabrikasjon og installasjon av enkelt-probe for omgivelses MSI og SCMS analyse. A) Fabrikasjonsfremgangsmåtene ifølge den enkelt-proben. B) fotografi av en fabrikkert enkelt-probe er festet til en glass-slide. C) fotografi av enkelt- probe oppsett festet til et massespektrometer. d) Diagram av den enkelt-proben oppsett kombinert med et massespektrometer. I løpet av et eksperiment, blir samplingsløsningsmiddel kontinuerlig tilgjengelig fra sprøyten, blir ioniseringen spenning som påtrykkes det ledende union fra massespektrometeret blir to digitale mikroskop brukes til å overvåke prøve plassering, den motordrevne XYZ trinnetSystemet brukes til å kontrollere prøve bevegelse, og et massespektrometer er brukt for analyse. e) Fotografi av den tilpassede digitale stereoskop system. f) fotografi som viser den digitale stereoskop festet til ionekilden grensesnittet flens gjennom en optisk bord. Trykk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Resultater fra en omgivelses MSI studie av en mus nyre seksjon med høy romlig og masse oppløsning. A) En representant massespekteret fra single-sonde MSI. Den maksimale intensiteten av detekterte metabolitter kan nå 3,39 x 10 7 (vilkårlige enheter). B) Et utvalg av de detekterte metabolittene presentert med deres masse nøyaktighet. C)MS bilder av [PC (32: 0) + H] + og [PC (34: 1) + Na] + tatt fra et musenyre seksjon på 8,5 um romlig oppløsning. PC: phosphatidylcholine. Skala: 2 mm; 0,20 mm (innfelt) d) Fastsettelse av romlig oppløsning av MS bildet for. [PC (38: 5) + Na] + (tilpasset med tillatelse fra referanse 15). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Resultater fra en omgivelses SCMS analyse av medikament behandlede HeLa-celler med høy masse oppløsning. A) zoomet inn fotografi av enkeltsondespissen som viser en typisk størrelse på <10 um i diameter. B) Foto tatt ved det punktet av enkelt-sonde innsetting i en HeLa celle. Skala: 50 mikrometer.c) En typisk positiv ion-modus massespektrum med identifikasjonene til et antall av PC (fosfatidylcholin) arter. d) En representativ liste av metabolitter som detekteres fra SCMS analyse av HeLa-celler i både de positive og negative ion-modus. ef) Massespektra for kontroll og behandlet (100 nM OSW-1) celler (tilpasset med tillatelse fra referanse 16). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur S1. Koblingsskjema av den elektroniske enheten brukes til å produsere kontaktlukking signal for massespektrometer å samle inn data. Klikk her for å se eller laste ned dette tallet.
Discussion
Den enkelt-proben er en multifunksjonell anordning som kan brukes til både MSI og SCMS eksperimenter. Singelen-probe oppsett (inkludert oversettelse scenesystemer, mikroskoper, ion kilde grensesnitt flens, etc.) er utformet som en add-on komponent som kan fleksibelt tilpasses den eksisterende massespektrometer. En rask utveksling mellom enkelt-proben oppsett og den konvensjonelle ESI ione-kilde som kan oppnås i løpet av ett minutt. I prinsippet, ved anvendelse av hensiktsmessig ionekilden grensesnitt flens, enkelt-proben oppsett kan tilpasses til de eventuelle andre massespektrometre. I tillegg kan prøvetagningsløsningsmiddel inneholdende en rekke forskjellige reagenser kan brukes med en enkelt sonde-oppsett for reaktive MSI og SCMS eksperimenter, som i stor grad forbedrer deteksjonen av et videre spekter av biomolekyler. I tillegg til animalsk vev og cellelinjer, er det enkelt-proben også i stand til å analysere andre biologiske systemer slik som planter. Derfor, med den samme eksperimentelle oppsettet oglignende brukeropplæring, kan en rekke studier utføres ved hjelp av et enkelt instrument og av de samme brukerne, noe som åpner for effektiv og allsidig eksperimenter skal gjøres med minimum opplæringstid og instrumentering kostnader.
Nøkkelkomponenten av den enkelt-proben MS teknikk er proben i seg selv. Kvaliteten på single-sonden har en betydelig innvirkning på ytelsen, som i stor grad avgjør kvaliteten på både MSI og SCMS eksperimenter. Når fabrikere single-sonder, sørg for at kapillærene innsiden av dual-boring rør er forsvarlig limt til eliminere muligheten for løsemiddel lekkasje under forsøkene. Det er viktig å bruke en minimal mengde av UV-herdbare epoksy, slik at åpningene og kapillærer ikke blir tilstoppet under sonden fabrikasjon.
Den enkelt-probe er blitt brukt for å drive med høy romlig oppløsning og masseomgivelses MSI på biologiske prøver 15. Den store fordelen med ambient MSI løpetikke-normale metoder er at prøvepreparering, holdes på et minimum uten behov for et vakuum samplings miljø, som gjør at prøven som skal analyseres i en nær naturlig tilstand 8. En av de største hindringer for de fleste andre omgivelses MSI teknikken har vært mangel på en romlig oppløsning. Sammenlignet med desorpsjon basert MSI teknikker (for eksempel DESI og LAESI), den lille tuppen størrelsen av enkelt sonde tillater en mer robust og effektiv overflate væske mikro-ekstraksjon utføres over et lite område, noe som fører til en høy romlig oppløsning av 8,5 um, som er blant de høyeste som er oppnådd ved hjelp av omgivelses MSI teknikker 15. I tillegg justering av komponentene i prøvetakingsløsningsmidlet gir ekstra fleksibilitet til å utføre forsøkene. For eksempel, prøvetaking løsemidler som inneholder reagenser (f.eks dicationic forbindelser) har vært brukt til å utføre reaktive MSI eksperimenter, slik at for en betydelig økning i antall metabolitter identifiserte per eksperiment 20. Den andre fordelen av single-sonde er integrert design, som gir enkel betjening under hele datainnsamlingsprosessen. På grunn av at avstanden mellom spissen og overflatevevet er meget følsom for ioner signal intensitet og stabilitet, å skaffe en flat vev seksjon og ledende overflate flatere justering for å minimere avstanden variansen er en nøkkel for høykvalitets MSI eksperimenter. Det følger at de enkelt-sonde MSI teknikker er ikke egnet for å oppnå høy romlig MS bilder av ujevne overflater.
I tillegg til fremstilling av en høy kvalitet sonde, forsiktig tuning instrumentet er avgjørende for en vellykket MSI eksperiment. Blant alle justeringstrinn, å justere høyden av enkeltsondespissen ovenfor vevet seksjonen overflate er den mest kritiske en. Ved justering av sonden høyden, pumpe prøvetaking løsemiddel og slå på ionisering spenning, slik at bare de løsemiddelbakgrunns ion-signaler kan være observatøred. Deretter overvåke endringen av massespekteret samtidig som man reduserer sonde-overflaten avstand ved å løfte den motordrevne Z-trinns til sterke og stabile ion signaler fra vev seksjon kan observeres; denne sonde høyde vil bli brukt for MSI datainnsamling under forsøket. I tillegg er en optimalisert løsningsmiddelstrømningshastighet avgjørende for MSI eksperimenter. Juster strømningshastighet med optimalisert sonde høyde. Sikre at det ikke er noe løsningsmiddel spredt på vevsoverflaten (dvs., er strømningshastigheten for høy) eller bobledannelse inne i nano-ESI emitter (dvs. strømningshastighet er for lav).
Singelen-sonde er en multifunksjonell enhet for bioanalyse. I tillegg til de MSI eksperimenter, er den i stand til å gjennomføre nær sanntid in-situ SCMS å belyse detaljert kjemisk informasjon fra levende eukaryote celler 16, som er en stor fordel sammenlignet med andre vakuumbaserte SCMS teknikker (for eksempel MALDI 10 og SIMS 21 (f.eks dicationic forbindelser) anvendes i SCMS eksperimenter, og et bredere spekter av cellebestanddeler kan påvises i en levende enkelt celle enn noen gang før (pågående forskning, data ikke vist). Selv om sanntids analyse vil gi de kjemiske profiler av levende enkle celler, på grunn av cellegjennomtrengning av membranen og utvinning av celleinnholdet, vil cellen som undersøkes bli drept etter forsøket, noe som tyder på at den enkelt-proben SCMS teknikk er fremdeles en destruktiv metode. I tillegg kan sondespissen og nano-ESI emitter i single-sonden være lett tilstoppet for uerfarne brukere. For å redusere sjansen for enheten tilstopping, sørge for å unngå å berøre kjernen når du setter den enkelt-sonde tips til en cell. Hvis tilstopping oppstår, kan enheten regenereres ved å varme opp tett probespissen eller nano-ESI emitter bruker en homebuilt varmebatteri 16. En annen begrensning ved den enkelt-proben SCMS teknikken er at bare de klebende celler (dvs. celler som er festet til overflatene) kan analyseres ved bruk av nåværende oppsett. Imidlertid, ved å inkorporere cellen manipulering systemet i enkelt-proben MS apparat, bredere celletypene kan studeres i fremtiden.
I likhet med MSI forsøket, å oppnå en høy kvalitet sonde og en optimalisert oppløsningsmiddel strømningshastighet er avgjørende for SCMS studier. Når tuning løsningsmidlet strømningshastighet, er det enkelt-sondespissen plassert over prøven (dvs. ingen kontakt med cellen eller kulturmedium), og sikre at det ikke er noe løsningsmiddel drypper fra sondespissen eller bobledannelse inne i nano-ESI emitter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Single-probe fabrication | |||
| Dual bore quartz tubing, 1.120’’ × 0.005” × 12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
| Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
| Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 110 µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
| UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
| LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
| Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
| Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
| Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
| Microscope slide (glass) | C & A Scientific - Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
| Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
| Mass spectrometer | |||
| LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
| Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
| Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| Contact closure device | |||
| USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
| Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
| Single-probe setup | |||
| Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
| Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
| Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
| Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
| Digital stereo microscope, 250X - 2,000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
| USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
| Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
| Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
| Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
| Solvents | |||
| Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
| Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
| 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
| 10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
| 12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
| T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
| Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
| Tissue imaging | |||
| Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
| Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
| Microscope slide (polycarbonate) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P | |
References
- Vickerman, J. C. Molecular imaging and depth profiling by mass spectrometry-SIMS, MALDI or DESI? Analyst. 136 (11), 2199-2217 (2011).
- Schwamborn, K. Imaging mass spectrometry in biomarker discovery and validation. J. Proteomics. 75 (16), 4990-4998 (2012).
- Schwamborn, K., Caprioli, R. M. MALDI Imaging Mass Spectrometry - Painting Molecular Pictures. Mol Oncol. 4 (6), 529-538 (2010).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18120-18125 (2008).
- Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. Simultaneous imaging of small metabolites and lipids in rat brain tissues at atmospheric pressure by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 82 (3), 982-988 (2010).
- Laskin, J., Heath, B. S., Roach, P. J., Cazares, L., Semmes, O. J. Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84 (1), 141-148 (2012).
- Wu, C., Dill, A. L., Eberlin, L. S., Cooks, R. G., Ifa, D. R. Mass spectrometry imaging under ambient conditions. Mass. Spectrom. Rev. 32 (3), 218-243 (2013).
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-Cell MALDI-MS as an Analytical Tool for Studying Intrapopulation Metabolic Heterogeneity of Unicellular Organisms. Anal. Chem. 82 (17), 7394-7400 (2010).
- Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-cell lipidomics: characterizing and imaging lipids on the surface of individual Aplysia californica neurons with cluster secondary ion mass spectrometry. Anal. Chem. 85 (4), 2231-2238 (2013).
- Shrestha, B., et al. Subcellular metabolite and lipid analysis of Xenopus laevis eggs by LAESI mass spectrometry. PLoS One. 9 (12), e115173 (2014).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass. Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 26 (6), 986-993 (2015).
- Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Thomas, M., et al. Visualization of High Resolution Spatial Mass Spectrometric Data during Acquisition. 2012 Annual International Conference of the Ieee Engineering in Medicine and Biology Society (Embc). , 5545-5548 (2012).
- Luxembourg, S. L., Mize, T. H., McDonnell, L. A., Heeren, R. M. High-spatial resolution mass spectrometric imaging of peptide and protein distributions on a surface. Anal. Chem. 76 (18), 5339-5344 (2004).
- Zhou, Y., et al. OSW-1: a natural compound with potent anticancer activity and a novel mechanism of action. J Natl Cancer Inst. 97 (23), 1781-1785 (2005).
- Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).
- Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary ion MS imaging to relatively quantify cholesterol in the membranes of individual cells from differentially treated populations. Anal. Chem. 79 (10), 3554-3560 (2007).
