Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.
Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 µm) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (< 10 µm), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a relatively new molecular imaging technique to provide the spatial distribution of the compounds of interest on surfaces. During the MSI analysis, mass spectrometry (MS) measurements are recorded across the surface on an individual pixel basis to create a 2D image of the species of interest 1. MSI techniques have the ability to provide a spatially resolved feature distribution for a large range of metabolites, allowing a much greater amount of information to be obtained from a sample than from using traditional molecular imaging techniques, and they have the potential to greatly improve the analysis of biological samples for biological and pharmacology studies 2. MSI can be broadly separated into non-ambient and ambient approaches. The non-ambient MSI analysis techniques, such as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) MS 3 and time of flight secondary ion MS (ToF SIMS) 4, are capable of high spatial resolution (around 5 µm and 100 nm, respectively) and high sensitivity. However, these methods require extensive sample preparation, such as the application of matrix molecules to the sample surface, and a vacuum sampling environment, which could introduce artifacts to the data obtained. Ambient techniques such as desorption electrospray ionization (DESI) MS 5, laser ablation electrospray ionization (LAESI) MS 6, and nano-DESI MS 7 are capable of MSI of samples with little to no prior preparation under the ambient environment, which is able to produce MS images that potentially reflect the sample in its most native state. However, most of these techniques generally lack the high spatial resolution and detection sensitivity compared with the non-ambient techniques, with experiments typically conducted at around 150 µm per pixel 8.
Single cell analysis (SCA) is a growing field that has the ability to characterize the chemical composition of biological samples at the cellular level. SCA enables the analysis of biological systems at a more fundamental level than traditional cell analysis techniques, which produce an averaged result of a population of cells, potentially providing insights that are previously intractable 9. MS techniques have recently been applied to SCA (termed single cell mass spectrometry or SCMS) using non-ambient techniques such as MALDI MS 10 and ToF SIMS 11 in which cells are pretreated before analysis, and with ambient techniques such as LAESI MS 12 and direct extraction methods, such as live single-cell video-MS 13, 14, to analyze a wide variety of cell types such as egg, plant, and cancer. Ambient techniques have the advantage of being applied to live cells, which again minimizes the artifacts, leading to a better representation of the metabolites in the live cells. The direct extraction based methods described above, however, perform the sample extraction and analysis process at two different steps, which result in a time gap during the analysis that could potentially alter the metabolites present within the sample.
The single-probe, a miniaturized multifunctional device that is capable of conducting high spatial resolution ambient MSI on biological tissue sections 15 and near real-time in-situ SCMS on live single cells 16. The single-probe has an integrated construction that is made up of a pulled dual-bore quartz capillary coupled with a solvent providing inlet and a nano-ESI emitter made from fused silica capillaries, enabling solvent delivery and analyte extraction to be performed from a single device. In the ambient MSI mode, the single-probe is placed over the sample tissue and surface micro-extraction occurs, allowing a rastered MS image to be made at high spatial resolution. Particularly, the tapered tip of the single-probe is small enough to be inserted into live eukaryotic cells for in-situ SCMS analysis, where the metabolite detection takes less than two seconds between probe insertion and MS detection, allowing chemical information to be taken in near real-time. Here are the protocols to fabricate the single-probe device and to conduct both the ambient MSI and SCMS modes using the single-probe MS techniques.
Den enda sonden är en multifunktionell enhet som kan användas för både MSI och SCMS experiment. Den enda sond setup (inklusive översättning scensystem, mikroskop, ion källgränssnittet fläns, etc.) är utformad som en add-on komponent som kan flexibelt anpassas till den befintliga masspektrometer. En snabbt utbyte mellan den enda sonden inställning och den konventionella ESI jonkällan kan åstadkommas inom en minut. I princip, genom att använda den lämpliga jon källgränssnittet fläns, den enkel sonden konfiguration kan anpassas till de andra masspektrometrar. Dessutom kan provtagnings lösningsmedel innehållande en mängd olika reagens användas med det enda sond setup för reaktiva MSI och SCMS experiment, vilket i hög grad förbättrar detekteringen av bredare intervall av biomolekyler. Förutom djurvävnader och cellinjer, är den enda sonden också i stånd att analysera andra biologiska system, såsom växter. Därför, med samma experimentuppställning ochliknande användarutbildning, kan utföras ett flertal studier med hjälp av ett enda instrument och av samma användare, vilket möjliggör effektiva och mångsidiga experiment som ska utföras med minsta träningstid och instrumentering kostnad.
Nyckelkomponenten i enkel sonden MS teknik är själva sonden. Kvaliteten på den enda sonden har en betydande inverkan på dess prestanda, som till stor del avgör kvaliteten på både MSI och SCMS experiment. Vid tillverkning enkel sonder, se till att kapillärerna inne i dubbla innerdiameter är ordentligt limmade för att eliminera risken för läckage lösningsmedel under experimenten. Det är viktigt att använda en minimimängd av UV-härdbar epoxi, så att öppningarna och kapillärer inte är igensatta under sondens tillverkning.
Den enkel proben har använts för att genomföra hög rumslig och massupplösningen omgivnings MSI på biologiska prover 15. Den stora fördelen med omgivande MSI övericke-omgivande metoder är att provberedningen hålls på ett minimum med något behov av en vakuumprovtagnings miljö, vilket gör det prov som skall analyseras i en nära infödd stat 8. En av de stora hindren för de flesta andra omgivnings MSI teknik har varit en brist på rumslig upplösning 1. Jämfört med desorption baserad MSI tekniker (såsom DESI och LAESI), den lilla spets storlek enda sonden möjliggör en mer robust och effektiv yta flytande mikro-extraktion utföras över ett litet område, vilket leder till en hög rumslig upplösning av 8,5 pm, vilket är bland de högsta som uppnåtts med hjälp av omgivnings MSI tekniker 15. Dessutom justerar komponenterna i provtagningslösningsmedlet ger extra flexibilitet för att utföra experimenten. Till exempel provtagning lösningsmedel innehållande reagens (t.ex. dicationic föreningar) har använts för att utföra reaktiva MSI experiment, vilket möjliggör en betydande ökning av antalet metaboliter identifierats per experiment 20. Den andra fördelen med enkel sonden är integrerad design, som ger enkel drift under hela datainsamlingsprocessen. Eftersom avståndet mellan spetsen och vävnadsytan är mycket känslig för jon signalintensitet och stabilitet, att erhålla en plan vävnadssektion och ledande yta plattas justering för att minimera avståndet variansen är en nyckel för högkvalitativa MSI experiment. Härav följer att de enda sond MSI tekniker är inte lämpliga för att erhålla höga rumsliga MS bilder av ojämna ytor.
Förutom att tillverka en högkvalitativ sond, noggrant avstämma instrumentet är avgörande för en framgångsrik MSI experiment. Bland alla frekvenssteg, justering av höjden av den inre-sondspetsen ovanför vävnads ytsektion är den mest kritiska. Vid justering sonden höjd, pumpa provtagning lösningsmedel och slå på jonisering spänningen, så att endast de lösningsmedel bakgrunds jon signalerna kan vara Observed. Sedan övervaka förändringen av masspektrum medan noggrant reducerar prob-yta avstånd genom att lyfta det motoriserade Z-stadiet tills kan observeras god och stabil jon signaler från vävnadssektionen; denna sond höjd kommer att användas för MSI datainsamling under experimentet. Dessutom är en optimerad lösningsmedlets flödeshastighet väsentlig för MSI experiment. Justera flödet med den optimerade probhöjden. Se till att det inte finns något lösningsmedel sprids på vävnadsytan (dvs., är flödeshastigheten för hög) eller bubbelbildning inuti nano ESI emitter (dvs., flödeshastighet är för låg).
Den enda sonden är en multifunktionell enhet för bioanalys. Förutom MSI experiment, är det kapabel att genomföra nära realtid in situ SCMS att belysa detaljerad kemisk information från levande eukaryota celler 16, vilket är en stor fördel jämfört med andra vakuumbaserade SCMS tekniker (t.ex. MALDI 10 och SIMS 21 </sup>). Den lilla storleken på sondspetsen ger möjlighet att sättas in i en levande eukaryot cell och för att extrahera och jonisera de intracellulära föreningar för omedelbar MS-analys. På samma sätt kan provtagnings lösningsmedel innehållande reagens (t.ex. dicationic föreningar) användas i SCMS experiment och ett bredare utbud av cellbeståndsdelar kan upptäckas i en levande enda cell än någonsin tidigare (pågående forskning, data visas ej). Även om den analys i realtid kommer att ge de kemiska profiler av levande enstaka celler, på grund av cellpenetration av membran och utvinning av cellinnehållet, kommer cellen som undersöks avlivas efter experimentet, vilket innebär att den inre-sonden SCMS teknik är fortfarande en destruktiv metod. Dessutom kan sondspetsen och nano-ESI emitter i enkel sonden lätt igensatt för oerfarna användare. För att minska risken för enheten igensättning, säkerställa att undvika att röra kärnan när du sätter enkelsondspetsen i en cell. Om tilltäppning inträffar, kan anordningen regenereras genom att värma upp tilltäppta sondspetsen eller nano-ESI emitter användning av en hembyggd värmeslinga 16. En annan begränsning av den enda sonden SCMS tekniken är att endast de vidhäftande celler (dvs celler fästa till ytor) kan analyseras med hjälp av aktuella inställningar. Emellertid genom att införliva den cellmanipulering systemet i den inre-sonden MS apparat, bredare typer av celler kan studeras i framtiden.
Liknande den MSI experimentet, erhålla en högkvalitativ sond och en optimerad lösningsmedlets flödeshastighet är kritisk för SCMS studier. När avstämning av lösningsmedelsflödet, är det enda sondspetsen placeras ovanför provet (dvs, ingen kontakt med cellen eller odlingsmedium), och se till att det inte finns något lösningsmedel droppar från sondspetsen eller blåsbildning på insidan av nano-ESI emitter.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Laskin (the Pacific Northwest National Laboratory) for sharing the motorized stage control software and MSI visualization program. We also thank Dr. Mao (the University of Oklahoma) for providing mouse organ samples and Mr. Chad E. Cunningham (the University of Oklahoma) for the assistance in machining and electronics work. This research was supported by grants from the Research Council of the University of Oklahoma Norman Campus, the American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsored by Waters Corporation), Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152), and National Institutes of Health (R01GM116116).
Single-probe fabrication | |||
Dual bore quartz tubing, 1.120’’×0.005”×12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
Fused silica capillary, ID: 40µm, OD: 110µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
Microscope slide (glass) | C & A Scientific – Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass spectrometer | |||
LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Contact closure device | |||
USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Single-probe setup | |||
Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
Digital stereo microscope, 250X-2000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solvents | |||
Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture | |||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue imaging | |||
Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
Microscope slide (polycarbonate ) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P |