Introduction
칼슘은 신체의 모든 단일 세포 내에서 풍부하게 발견되는 매우 중요한 이온입니다. 그것은 성장, 증식, 이동 및 세포 사멸 1-4 등 다양한 세포 기능에 중요한 역할을 가지고있다. 잘 칼슘이 모두 직간접적인 행동을 통해 이러한 프로세스에 영향을 미칠 수 있음을 설립, 따라서,이 이온의 정상적인 세포 내 농도 변화는 쉽게 영향을받는 세포에 대한 부정적인 결과가 발생할 수 있습니다. 스케줄링은 셀 (5) 내에서 가장 큰 세포 내 칼슘 저장소로 간주됩니다. 스케줄링 및 세포질 모두에서 칼슘의 정상 상태 수준은 일반적으로이 세포 기관의 칼슘 수송성 채널 중 일정한 유량을 통해 유지된다. 인한 부상 또는 질병의 형태로 세포에 가해지는 스트레스 조건은 일반적으로 그가 온 오래 지속되는 효과를 가지고 갈 SR 칼슘의 중요한 변화 2+와 관련된셀의 alth. 케이스의 가장 심각한에서 스트레스 셀의 무능력 복구하고 정상 상태 SR의 칼슘을 유지 2+ 수준도 사멸 6-8으로 사망 절정에 달하다 수 있습니다.
세포의 칼슘 역학에 대한 현재의 연구는 몇몇 연구 시험 칼슘 저장소의 콘텐츠를 직접 9-11 세포 기관 있다는 사실에 의해 제한된다. 가장 일반적인 방법은 대신 SR 칼슘 함량 12-14에서 변화의 간접적 인 측정과 같은 세포 내 칼슘 수준의 측정을 포함한다. 이 실험에서, 칼슘은 일반적으로 세포 소기관의 고갈을 초래되는 약물 (예 쌥시 가르 긴)의 사용을 통해 SR로부터 방출되도록 유도된다. 결론은 다음 세포질 칼슘 농도의 변동에 따라 SR 칼슘의 변경과 관련하여 그려집니다. 로터리 엄마에 같은 결론을 도출하기 위해 연구자 남은 능력에도 불구하고nner, SR 칼슘 측정이 방법은 수집 된 데이터의 해석에 관한 많은 제한과 같은 정보를 수집합니다 할 수있는 간접적 인 방법은 분명히있다. 이 명확한 제한을 우회시키기 위해서는, SR 내강 네트워크 내에서 직접 발견 칼슘의 양을 측정 할 필요가있다.
직접 관내 SR 칼슘 수준을 기록 할 수있는의 최종 결과에 필수적은 세포 배양 용 공구 및 사용되는 칼슘 지표이다. 현재의 논문에 언급 된 데이터의 경우, 사용되는 혈관 평활근 세포는 냉동 세포주로부터 왔다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 세포는 5 % CO 2 공급 일정 37 ° C에서 배양 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM) +를 설명 실험 구절 22-26을 통해 10 %의 신생아 혈청 (NCS)에서 배양 하였다. 현재의 방법을 이용하여, 예를 들어, 세포는 매우 성공적 세포 시뮬레이션 단백질 혼합물에 성장 된조직 (15)의 많은 다른 유형의 환경을 제공합니다. SR 칼슘 정맥 따른 성공에 중요 2+ 연구는 사용 된 단백질 혼합물의 형태이고; 이 경우, 낮은 성장 인자 다양한 일반 칼슘 신호 전달에 영향을주는 동작과 끊임없이 시험 셀 내에서 발생하는이 도구의 부품을 피할 필요가 있었다. 시험 셀의 성공적인 성장 후, 칼슘 인디케이터 효과적으로 이러한 배양 세포에 도입한다. 이 SR-상주 칼슘 2+ D1SR 지표를 전달하는 아데노 바이러스 벡터를 이용하여 가능하게되었다. 높은 형질 전환 효율을 달성하기 위해, 셀은 종래 촬상 적어도 36-48 시간 동안 바이러스 벡터와 함께 배양해야한다. 이 제제는 칼슘에게 높은 정확성과 재현성을 가진 SR 루멘 내에서 2 + 과도 전압을 측정 할 수있는 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다.
이 프로토콜에서 사용 D1SR 표시가 D1ER 칼슘의 수정 된 변종이다 2+ 난원래 캘리포니아 대학에서 박사 로저 첸의 실험실, 샌디에고, 미국 9,16에 의해 만들어진 ndicator. 원래 D1ER는 이전 칼슘 2 + 지표 9,16에 비해 훨씬 넓은 범위 (0.5-160 μM)을 통해 칼슘 감도를 표시 cameleons라는 유전자 인코딩 칼슘 지표의 2 세대에 속한다. 새로운 변형 D1SR 박사 웨인 첸 (캐나다 앨버타 대학)에서 일종의 선물은, 그러나, 돌연변이 calsequestrin 시퀀스 (대신 원래 D1ER에서와 같이 칼레 티 큘린 순서)를 수행한다. 돌연변이 calsequestrin는 11 루멘 SR 내에서 칼슘 결합에 내인성 calsequestrin과 경쟁의 문제를 제거 칼슘 결합 감소했다. D1SR 표시등이 잘린 강화 시안 형광 단백질 (CFP)과 노란색 형광 단백질 (YFP) 수정 칼 모듈 린 (CAM) 및 M13을 포함하는 링커 단백질에 의한 바인드 (t을 운반CAM) 시퀀스에 결합 미오신 경쇄 키나제의 그는 26 잔류 물 펩타이드. 캠-M13 순서는 내생 칼 모듈 린 결합에서 M13을 방지하기 위해 수정되었습니다. 또한, SR 유지를 보장하기 calsequestrin 시퀀스 CFP (11)의 5'- 말단에 첨가되었다. 칼슘 이온에 결합 할 때, 캠 M13 도메인은 FRET 신호 강도의 증가로 기록되는 측면 CFP와 YFP 사이의 에너지 전달이 증가 될 구조적 변화를 통해 진행한다. 2+ SR 내강 칼슘의 농도가 떨어질 때 한편, 캠 M13 도메인은 측면 CFP 및 YFP 및 FRET 신호 강도의 현저한 저하의 에너지 전달의 감소를 초래 역방향 구조적 변화를 통해 진행 .
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Protocol
윤리 문 : 모든 실험과 절차는 브리티시 컬럼비아 주, 밴쿠버, 캐나다의 대학의 연구소 바이오 안전성 가이드 라인과 일치 실시 하였다.
FRET 기반 공 초점 현미경을위한 35mm 유리 바닥 문화 요리 1. 준비
- 다음 절차에 따라 36-48 시간 전에 실험에를 사용하여 플레이트를 준비합니다.
- C 저장 ° -20에서 선택 젤라틴 단백질 혼합물 0.25 % 트립신 EDTA를 검색하고 사용할 때까지 이동 얼음 욕조에 보관하십시오.
주 : 단백질이 코팅 혼합물만을 사용 전에 고화 혼합을 방지하기 위해, 짧은 시간 동안 RT에 노출되어야한다. 필요할 때까지 트립신 용액은 냉장 보관한다; 대안으로, 트립신 단계 1.5 완료 후 -20 ° C 저장 영역에서 검색 할 수 있습니다. - DMEM (더 추가 된 혈청, 냉장) : 단백질 혼합물의 1시 25분 희석을 준비합니다. 각 플레이트가 준비되기 단백질 혼합물 / DMEM의 적절한 볼륨을 이동. 35mm 유리 바닥 판의 경우, 완전 판의 하단에 내부 유리 원을 충당하기 위해 약 200 μl를 추가합니다.
- 안전 캐비닛 내부 및 실온에서 적어도 30 분 동안 앉아 접시를 남겨주세요. 이 기간 동안 물을 욕조에 37 ° C 10 % NCS와 따뜻한 DMEM.
- 바로 전에 다음 단계에 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 트립신.
- 유리 피펫 및 흡입을 사용하여 배양 플라스크 현재 DMEM를 제거합니다. 따뜻한 멸균 PBS와 플라스크의 워시 바닥은 남아있는 DMEM 찌꺼기를 제거합니다.
- 플라스크의 바닥에서 미리 배양 평활근을 제거 :
참고 : 플라스크는 세포가 접시 준비하기 전에 원하는 컨 플루 (약 80 %)에 도달 할 수 있도록이 단계에 일 설립되었다. 세포들은 원래 10 % NCS로 DMEM 20 ml의 플라스크에 현탁시키고 DMEM 공급 재생 된 세포를 인큐베이터로 복귀 된 후 24 시간에 대해 5 % CO 2 공급하여 37 ℃에서 배양 하였다. DMEM는 이브를 갱신했다세포가 포화 상태에 도달 할 때까지 공예 48 시간이 초기 단계에 따라.- 워시는 트립신 1 ml의 신속 플라스크 다음 흡입을 사용하여 1 ml의 트립신을 제거합니다.
- 트립신의 또 다른 1 ㎖에 추가하고 효소가 플라스크의 전체 바닥과 접촉 할 수 있도록 플라스크를 휘두르는, 더 긴 기간 (약 30 ~ 60 초)로 떠난다.
- 플라스크에서 분리 만족 될 때까지 현미경으로 분리 얼마나 많은 세포를 관찰한다. 플라스크에서 분리 된 세포의 비율이 만족 될 때까지 대체 물기 제거 트립신 용액 및 검사 세포 분리.
주 : 플라스크를 37 ℃에서이 프로세스의 속도를 약 30-60 초 동안 인큐베이터로 복귀 할 수있다. - 세포를 트립신을 사용 빠질되고 나면 (트립신은 플라스크의 총 부피의 1/8 번째를 형성하도록 충분한 볼륨), 트립신 반응을 정지 플라스크에 10 % NCS 신선한 DMEM를 추가합니다.
주 : 250 ml의 배양 플라스크를 사용하는 경우, 예를 들어,이 것7 ㎖의 DMEM 세포 용액 8 ml의 결과 트립신 1 ㎖의에 추가.
- 깨끗한 (표시) 50 ML 원뿔 튜브에 플라스크에서 셀 솔루션을 결과로 전송.
- 각 플레이트에 1 ml의 신선한 DMEM 플러스 10 % NCS 추가는 (충분한 매체가 24 시간을 지속하기 위해) 준비되고있다.
- 부드럽게 튜브를 형성 할 수있는 모든 펠렛을 헤어 셀 솔루션을 여러 번 포함 반전.
- 피펫은 각 플레이트에 부드럽게 혼합 셀 솔루션의 볼륨을 원하는.
참고 :이 프로토콜에 대한 도금 권장 SMCs 번호는 35mm 배양 접시 당 0.5-0.8 × 106이다. 이 번호는 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 각각의 실험실에서 테스트하고 수정해야합니다. - 유리 바닥에서 세포의 평등 한 분배를 보장하기 위해 철저하게 / 시계 방향 반 시계 방향으로 각각의 판을 소용돌이 친다.
D1SR 칼슘 2 + 표시를 실시 아데노 바이러스 벡터 2. 과도 형질
- 나 또한 다음dium 각각의 접시에 세포 솔루션은 세포가 접시의 바닥에 유리에 제대로 부착 할 수 있도록 적어도 1 시간 동안 CO 2 공급 5 %와 37 ° C에서 배양 접시를 둡니다. 세포가 명확하게 부착 될 때까지 15 분 간격으로 현미경으로 번호판을 확인합니다.
- -80 ° C 저장 영역에서 아데노 바이러스 D1SR 나누어지는을 검색하고 생물 안전 캐비닛에 전송하는 모바일 얼음 욕조에 보관하십시오.
- 피펫 원하는 용량 각 플레이트에 냉장 D1SR의 (100의 감염의 다중성).
주 : 플레이트 당 필요한 아데노 바이러스 용액의 부피에 대한 계산은 플라크 형성 단위 (PFU)로 표시되는 원본 원액에 바이러스 역가에 의존한다. 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 배양 접시에 하나의 평활근 세포 (SMC)를 감염하는 데 필요한 번호 또는 바이러스 입자로 해석됩니다 (100)의 감염 (MOI)의 다양성을 권장합니다. - 5 % CO 2 공급 O / N 37 ° C에 감염된 세포를 품어.
- 다음 날, 신선한 DMEM 1 ㎖ 플러스 10 % NCS와 세포를 보충.
- CO 2 O / N 5 %에서 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 접시를 품어.
FRET 기반 공 촛점 이미징을 사용하여 3. 측정 SR 내강의 Ca 2+
- O / N 배양 후, 플레이트에서 배지를 제거합니다.
- 포함 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼와 배양 접시를 씻으 (mmol·L에 - 1) 염화나트륨 (140), 포도당 (10), KCl을 5, HEPES (5), 염화칼슘 (2) 1.5의 MgCl 2 일 (PH 7.4) 세 번.
- 직전 기록의 시작에 1 ml의 신선한 따뜻한 HEPES-PSS 버퍼를 추가합니다.
- 공 초점 현미경의 관련 소프트웨어에 FRET SE (감응 방출) 응용 프로그램 (또는 유사한 기능)를 사용하여 초기 이미징을 수행합니다.
- 응용 프로그램이 열리면, 원하는 실험 조건을 달성하기 위해 설정을 조정하려면 "설정"탭으로 클릭합니다. <세포 (기증자과 채널 FRET) 440 nm에서 순차적으로 흥분과 (수용체 채널에 대한) 513 nm의 있도록 리> 수동으로 채널 설정을 변경합니다. (기증자에 대한) 488 nm 내지 535 nm의 (FRET 및 수용체에 대한)에서 방출 파장을 수집합니다.
- 와 노출 사이에 10 초 간격 (세 개의 연속 CFP 기증자, FRET 및 YFP 수용체 채널에 대한 녹화 시간) 세포의 150 밀리 여기 노출 시간, 15 %의 전송 빛의 강도를 설정합니다.
참고 : 연구자가 여러 로아을 그리고 강도 기록하고 그래프에 동시에 표시 할 대응하도록 선택할 수 있습니다. 대안 적으로, 연구자들은 초기 기록을위한 단일 ROI 윤곽 및 소프트웨어의 데이터 분석 지향 버전 실험 파일을 열어 나중에 다수의 ROI 윤곽을 진행할 수있다.
참고 : FRET 기반 실험을 설정하는 데 필요한 단계에 대한 자세한 세부 사항은 FRET 응용 프로그램 마법사 매뉴얼에서 찾을 수 있습니다. 현미경은 FRET 마법사 장착되지 않은 경우, 다음의 프로토콜에 대한 파라미터를 설정하는데 사용될 수있다수동으로 기록.
- 나중에 사용하기 위해 데이터를 저장하기 위해, 기록 추적을 통해 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 SAV하기 위해 "내보내기"옵션을 선택합니다연구자가 선택한 드라이브에 기록 된 평균 신호 강도와 전자 스프레드 시트.
- 시각 0 초에서 관찰 원료 강도 값에 의해 각 데이터를 분할하여 각각의 실험 데이터를 정규화.
- 수동으로 복사하고 원래 스프레드 시트 / 초에서 관련 데이터 행을 붙여 넣기하여 통계 프로그램 프로젝트 파일에 스프레드 시트에서 가져 오기 정규화 된 데이터.
- 자동으로 프로그램에 붙여 넣을 데이터 세트에 해당하는 그래프를 생성합니다.
참고 :이 프로그램의 기본 설정은 가져온 데이터에서 선 그래프를 생성합니다. 표시되는 그래프의 종류는 기본 도구 모음에서 발견 제목 "변경"에서 "그래프의 다른 유형을 선택"버튼을 클릭하여 수정할 수 있습니다. - 단일 데이터 시트로 동일한 실험 큰 그룹 내에서 여러 개의 독립적 인 실험을 대표하는 풀 데이터 수행 특정 테스트에 대한 평균 추적을 생성한다.
- 검은 microcentrifuge 관에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 1 ml의 0.0125 g 플루로 닉 산 (PA)에 녹이고 (PA 용해 있도록 모바일 수욕 튜브를 따뜻하게 할 수있다).
- -20 ° C 저장 영역에서 세포질 칼슘 지시 염료 (FLUO-4 AM)의 튜브 (50 μg의)를 검색합니다.
- 빛과 접촉 최대한 보호하기 위해 호일 염료의 튜브를 감싸.
- 피펫 염료를 함유하는 튜브에 DMSO + PA 용액 45 μL. 실온에서 박 및 저장소에 DMSO + PA 솔루션을 감싸.
- 철저하게 솔루션 위아래로 여러 번 피펫 팅하여 튜브의 내용을 섞는다. 대안 적으로, 10 분 동안 염색 튜브를 초음파 처리.
참고 : 철저하게 충분한 될 것 DMSO + PA 솔루션을 통해 염료를 배포의 어느 단계; 단순히 연구자의 취향의 문제이다. 조사자 용액을 초음파 처리로 선택한 경우, 그것다른 사람들이 소음에 의해 영향을받지 않습니다 고립 된 지역 / 방에서 수행해야합니다. 조사는 귀를 보호하기 위해 무거운 머플러를 사용해야합니다.- 용액을 초음파 처리하는 경우, 2/3 전체 (와 DH 2 O) 초음파기 화장실 내부의 거품 튜브 홀더와 장소의 내부에 염료를 포함하는 포일 포장 튜브를 삽입합니다.
- 격리 지역 / 공간 및 전력 시스템의 장소 소니 케이 온천 (보호 모자를 확인하기 전에 초음파 처리를 시작으로 장소에). 공간을두고 튜브를 (가능한 한 오랫동안 빛으로부터 보호하기 위해 호일에 싸서 보관)을 차단하고 검색하기 전에 10 분 동안 실행중인 시스템을 그대로 둡니다.
- 어두운 마이크로 원심 튜브에 이제 완전히 혼합 용액 나누어지는 (튜브 당 5 μl를 10 튜브 총 만들 수 있어야합니다).
- 포일의 각 나누어지는 튜브를 감싸. 사용할 때까지 -20 ° C 조건에서 건조에 레이블 튜브 및 저장.
5. 세포질 칼슘의 측정 2 +
- 쥐 대동맥 SMCs의 문화 판을 준비하는 1.1-1.12의 단계를 따릅니다.
- 48 시간 포스트 문화의 접시에서 배양 배지를 제거합니다.
- -20 ° C 저장 영역에서 세포질 칼슘 2 + 표시 등 (5 μL)의 이전 준비 나누어지는을 제거하고 사용할 때까지 이동 얼음 조에서 유지한다.
- 포함 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼와 배양 접시를 씻으 (mmol·L에 - 1) 염화나트륨 (140), 포도당 (10), KCl을 5, HEPES (5), 염화칼슘 (2) 1.5의 MgCl 2 일 (PH 7.4) 세 번.
- 따뜻한 HEPES-PSS 1 ml의 지표를 혼합 배양 접시에로드합니다.
- 실온에서 1 시간 동안 표시기 (24 °에 C)와 SMCs을 품어.
- 문화 판에서 표시를 제거하고 1 ml의 따뜻한 생리 HEPES-PSS 버퍼로 3 회 세척한다.
- 직전 기록의 시작에 1 ml의 신선한 따뜻한 HEPES-PSS 버퍼를 추가합니다.
- 63X 오와 직렬 이미지 (512 X 512 픽셀) 캡처공 촛점 거꾸로 현미경의 IL-침지 목표.
- 수동 세포를 488 nm에서 흥분하도록 설정을 변경하고, 발광 파장은 700 Hz의 스캔 속도로 555 nm에서 수집된다.
- 세포를 150 밀리 여진 노출 시간 (세포 촬영 중에 지정된 시간 간격으로 빛에 노출되는 시간)과 노출 사이 5 초 간격으로, 15 %의 투과에서의 광 강도를 설정한다.
- 현미경 무대에서 판을 안정화하고 녹음을 시작.
- 적어도 3 분 녹음하기 전에 관심의 제를 도입하여 신호의 꾸준한 기초 기록을 확인합니다.
- (단계 3.16에 설명 된대로) 2 + SR 칼슘을 고갈 및 시간 후 처리의 원하는 금액에 대한 기록을 계속위한 도구로 칼슘 -moving 에이전트 (예를 들면, 2㎛ 쌥시 가르 긴) 소개합니다.
- 녹음 신호 강도 형광 SI 평균을 현미경 특정 소프트웨어를 사용하여관심 (ROI)의 각 지역에서 5 ~ 10 SMCs의 클러스터에서 gnals (F / F 0). 수집 형식 및 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 영상에서 얻어진 데이터를 분석한다. 이 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집의 설명과 분석을위한 단계를 3.18.1-3.18.5 참조하십시오.
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Representative Results
이 섹션은 간접적 세포질 칼슘의 변동을 관찰함으로써 칼슘 저장소 농도 소기관하는 변화를 측정 통상 사용되고있는 방법에 비해, SR 내강 칼슘 농도 데이터를 캡처하는 한 방법을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예를 제공 2+ .
도 1a는 YFP 채널 (514 nm의 여기 / 535 nm의 방출)에 D1SR 아데노 바이러스로 형질 SMC 문화의 관심 (ROI)의 영역의 스냅 샷을 보여줍니다. 모든 SMCs가 D1SR 발현 양성되지만, 도시 된 바와 같이,이 D1SR 표시기 발현 수준이 동일한 ROI 내의 다른 셀 사이에서 변화하는 것이 분명하다.도 1b는 D1SR로 형질 SMC의 형광 화상의 2-D 투사를 도시 칼슘 분포의 명확한 그림을 제공 아데노 바이러스 (YFP 채널)팽창성 SR 내강 네트워크 내.도 1C는 CFP (488분의 440 ㎚), FRET (535분의 440 ㎚) 및 YFP (535분의 514 ㎚) 대역 통과 필터를 사용하여 SMC에서 D1SR 표시 분포를 나타낸다.
또한 (2 μM) (도 2) 쌥시 가르 긴 SR 비우는 에이전트 세포 급성 노출 분명 시험을 사용하여 SR이 표적 이온의 이동을 모니터링로부터 얻은 칼슘 신호 트레이스의 예를 보여준다. 도 2a 및도 2b에 도시 된 바와 같이, SR 쌥시 가르 긴는 칼슘 함량 ([칼슘] SR)의 감소를 유도한다.
도 3a에서, 우리는 SR 비우는 에이전트 쌥시 가르 긴 (2 μM)로 처리 세포질 칼슘 2 + 표시와 함께로드 배양 SMCs의 대표 이미지를 보여 주었다. 기록 된 칼슘 신호의 관측 과도 피크 (
도 4A는 SR 칼슘 인디케이터 D1SR 발현 및 엔도 텔린 -1의 100 nm의 처리 배양 SMCs 대표 스냅 샷을 도시한다. 도 4a 및도 4b 모두에 도시 된 바와 같이, 엔도 텔린 1 D1SR FRET 신호의 감소에 의해 측정 SR 칼슘 함량 천천히, 그러나 정상 강하를 유도한다. 명백한 바와 같이의 비율 계량 FRET 프로토콜은 중요한 칼슘의 연구를 할 수 있습니다 2+ 직접 에이전트의 행동의 모드에 관련된 움직임이 사용됩니다. 바로 이러한 방식으로 셀에서 가장 큰 칼슘 저장소에서 /로이 이온의 움직임을 측정하는 변화에 SR의 행동에 관한 또는 인해 2 + 역학 직접 칼슘의 결과를 담당자에게 제공에 도움이됩니다 SR 루멘 환경에서의.
쥐 대동맥 SMCs의 SR 칼슘 2 + 표시 D1SR 그림 1. 배포. (A) 48 시간 게시물 감염에 D1SR andenoviral 벡터로 형질 대표 이미지 묘사 SMC 문화. (B) YFP 채널 (514 nm의 여기 / 535 nm의 발광)을 사용하여 배양 된 SMC에서 D1SR 분포의 형광 화상의 2-D 투사. (C) CFP (488분의 440 ㎚), FRET (535분의 440 ㎚) 및 YFP (535분의 514 ㎚) 대역 통과 필터를 사용 D1SR 표시기 형질 SMC 대표 샷. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2. 쌥시 가르 긴은 크게 감소의 원인 [칼슘 2 +] SR. (A) 실시간 배양 한 쥐 대동맥 SMCs 나타내는 신호 강도의 감소를 보여주는 쌥시 가르 긴 D1SR로 형질과의 2 μM 처리의 사색 스냅 샷 (FRET 채널) 때문에 쌥시 가르 긴 유도 칼슘 출시 SR 칼슘 함량이 크게 감소. (B) [칼슘 2 +] SR에있는 뜻 깊은 감소를 확인 쌥시 가르 긴 2 μM로 처리 배양 SMCs에서 F / F 0 값에 대한 대표 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
인터넷gure 3. 쌥시 가르 긴 2+ 세포질 칼슘의 상당한 증가가 발생합니다 ([칼슘 2 +] I). (A) 세포질 칼슘 2 + 표시와 함께로드 및 쌥시 가르 긴 2 μM로 처리 배양 한 쥐 대동맥 SMCs의 대표 스냅 샷. 도시 된 바와 같이, 쌥시 가르 긴 때문에 SR로부터의 칼슘의 방출 2+로 세포질 내 신호 세기의 상당한 증가를 야기한다. (B) 쌥시 가르 긴 2 μM로 처리 배양 SMCs에서 F / F 0 값에 대한 대표 추적. 칼슘 신호의 묘사 증가는 SR에서 출시 된 칼슘의 양에 비례하는 것으로 간주됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 엔도 텔린-1에 상당한 하락의 원인 [칼슘 2 +] SR. (A) 실시간 배양 한 쥐 대동맥 SMCs D1SR로 형질 및 100 nm의 치료의 사색 스냅 샷 (FRET 채널) 엔도 텔린 -1 느린를 표시하지만, 때문에 SR에 대한 엔도 텔린 유도 칼슘 출시 SR 칼슘 함량의 상당한 감소를 나타내는 신호 강도의 꾸준한 감소. (B) 엔도 텔린-1의 100 nm의 치료 배양 SMCs에서 F / F 0 값에 대한 대표 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 SR의 루멘 내 칼슘 농도를 연구하기 D1SR 아데노 바이러스와 혈관 평활근 세포의 형질을 설명합니다. 이 방법은 직접이 소기관 내 칼슘의 측정뿐만 아니라 다른 칼슘 이동 에이전트 애플리케이션의 결과로서 SR 만점으로의 이동 / 허용한다. 이 방법은 SR과 세포질 칼슘 수준에 변화가 전체 세포의 건강에 영향을 미칠 어떻게 이러한 변화는 상호 관련있는 방법의 포괄적 인 이해를 위해 노력 연구자를위한 많은 장점을 가지고있다. 세포 내 칼슘 운동의 전통 관찰은 세포질 칼슘 수준 변화의 추적을 포함한다. D1SR하거나 유사한 구조를 이용하여 유래의 중요한 장점은 따라서, 오히려 SR에 대한 아고 니스트의 효과에 의해 모호한 결론을 도출 할 필요없이, 예를 들면 SR 같은 특정 소기관을 포함하는이 이온의 움직임을 모니터 할 수있다간접적 조작에 의해 유도 된 세포 내 칼슘 수준의 변화를 관찰. 같은 맥락 함께 영향을 봉사 요원은 SR 칼슘은 특히 더 효율적으로 모두 세포 기관 및 세포 전체 세포의 칼슘 농도 및 전반적인 건강에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다 2+. 그것은 D1SR 배양 세포의 형질 관내 SR 칼슘 수준의 변화를 측정하는 직접적인 외에도 무료, 방법을 제공하는 것이 이러한 장점에 기인한다. 또한 중요성이 모델은 세포 스트레스 또는 특정 기능성 반응을 유도하는 것으로 알려진 약리학 적 또는 생리 학적 제제에 응답 SR 네트워크 내 칼슘의 변화 2+ 농도를 측정하기위한 수단을 제공한다는 점이다. 이 관심의 셀에 D1SR 표시에 대한 교정 곡선을 생성함으로써 가능합니다. 응급실 / SR의 내 칼슘 농도이어서 (F / F 0 정규화 D1SR 비율을 보정함으로써 계산 될 수있다) 이전 10, 11 바와 같이 표준 교정 곡선에 대한.
여기에 설명 된 프로토콜의 제한은 다른 세포 유형에 D1SR 구조체의 사용에 관한 유용한 정보의 부족이다. 다른 세포 유형의 사용은 날짜 제한되어에가 있지만이 방법은 지금까지, 우리의 연구를 여러 번 13-15에서 쥐 SMCs 성공적인 입증했다. 이 방법의 성공을 위해, 모든 예방 조치가 세포 배양 단계의 건강한 진행을 보장하기 위해 촬영하는 것이 중요합니다. 이는 유리 바닥 현미경 플레이트 상 래트 대동맥 SMCs 충분한 성장을 촉진 입증 구입할 수있는 많은 단백질 계 젤라틴 물질로서 플레이트상의 세포의 성장을 허용하는 적절한 재료를 사용하는 것이 중요하다. 세포는 최적의 통로 중에 높은 포화 상태로 제조되지 않은 경우 D1SR 후속 이미징 형질 전환의 성공에 변화가 관찰 될 수있다. 페이지 변경최적 형질 약한 신호가 상기 촬상 단계에서 획득되는 것을 초래할 수 동일한 세포주의 장기간 사용에 내재 henotype. D1SR 구조를 사용하여 실험 영상에 대한 세포의 생장을 보장하기 위해 이전에 자신의 실행에 적어도 36-48 시간 동안 준비해야하므로이 방법의 사용에 연루 한계, 따라서 주로 그 필요한 세포 배양 작업에 의해 불가피했다입니다 아데노 바이러스와 세포 성장의 배양을위한 충분한 시간.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 [CVB & ME에 MOP-1112666] 건강 연구의 캐나다 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate) | Life technologies | 11995-065 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml | Corning | 356230 | Keep at -20 °C until right before use |
| Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | Keep at -20 °C until right before use | |
| 35 mm glass-bottomed plates | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| 250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask | BD Falcon | 353136 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Life technologies | 25200056 | Keep at -20 °C until right before use |
| 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Falcon | 352070 | |
| D1SR | N/A | N/A | Gift |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Fluo 4-AM | Life technologies | F-23917 | Keep at -20 °C until right before use |
| 1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes | Argos Technologies | T7100BK | |
| Leica TCS SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application) | Leica Microsystems | ||
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Software, Inc. |
References
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