מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

Introduction

Ca ^{2 +} הוא יון חשוב מאוד למצוא למכביר בתוך כל תא ותא בגוף. יש לו תפקידים משמעותיים רבים תפקודים תאיים שונים, לרבות גידול, התפשטות, הגירה, ו אפופטוזיס ^1-4. היא מבוססת היטב כי Ca ^{2 +} יכול להשפיע על תהליכים אלה הם באמצעות פעולות ישירות ועקיפות, ולכן, שינויים לריכוז הנורמלי התאי של יון זה יכול לגרום בקלות תוצאות שליליות עבור תאים חולים. ערך SR נחשב החנות הגדולה התאי Ca ^{2 +} בתוך התא ^5. רמות מצב יציב של Ca ²⁺ הן SR ו הציטופלסמה נשמרות בדרך כלל באמצעות זרימה מתמדת לתוך ומתוך ערוצי -transporting Ca ²⁺ של אברון זה. התנאים המלחיצים המוטלים תאים בשל כל צורה של פציעה או מחלה הם נפוצים הקשורים שינויים משמעותיים SR Ca ^{2 +} כי להמשיך להיות השפעות ארוכות טווח על שהואalth של התא. בשנת הקשה ביותר של המקרים, את חוסר היכולת של תא הדגיש להתאושש ולשמור Ca SR מצב יציב ²⁺ רמות אולי אפילו לשיאה למוות על ידי אפופטוזיס ^6-8.

מחקר נוכחי לתוך דינמיקת הסלולר Ca ²⁺ מוגבל על ידי העובדה כי בדיקת מחקרים מעטים אברון תוכן החנות ^{2 +} Ca ישירות ^9-11. המנהג הנפוץ ביותר במקום כרוך מדידת רמות ציטופלסמית Ca ^{2 +} מדידות עקיפות של שינויים בתוכן SR Ca ^{2 + 12-14.} בניסויים אלה, Ca ^{2 +} מושרת נפוצה להשתחרר מן SR באמצעות סוכנים תרופתיים גורמים הדלדול של אברון (למשל thapsigargin). מסקנות אז נמשכו לגבי שינויי SR Ca ^{2 +} ומתבססים על תנודות הריכוזים ציטופלסמית Ca ^2+. למרות היכולת הנותרים לחוקרים להסיק מסקנות כאלה בתוך ma עקיפהnner, שיטה זו של מדידת ²⁺ SR Ca היא ללא ספק דרך עקיפה כדי ללקט מידע כזה, עם מגבלות רבות בנוגע לפרשנות של הנתונים שנאספו. כדי לעקוף מגבלה ברורה זו, יש צורך למדוד את כמות Ca ^{2 +} מצאה ישירות בתוך הרשת לומינל SR.

ויטל לתוצאה הסופית של יכולת להקליט רמות Ca ²⁺ SR intraluminal ישירות הם כלי תרבית תאים ומחוון Ca ²⁺ בשימוש. עבור הנתונים הפניה בכתב היד הנוכחית, חשוב לציין כי VSMCs בשימוש בא משושלת תא קפוא. תאים היו בתרבית הבינונית של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) + 10% בת-יומה בסרום (NCS) מעל הקטעים 22-26 עבור הניסויים שתוארו, וטופח על 37 מעלות צלזיוס קבוע עם 5% CO ₂ אספקה. באמצעות השיטה הנוכחית, למשל, תאים כבר גדלו מאוד בהצלחה על תערובת חלבון המדמה את תאייםהסביבה של סוגים שונים של רקמות ^15. חשוב להצלחה לאורך הוריד של SR Ca ^{2 +} מחקר הוא סוג של תערובת חלבונים המשמשים; במקרה זה, מגוון גורם צמיחה נמוך היה נחוץ כדי למנוע מרכיבי הכלי הזה מאת משפיע על האיתות הרגילה Ca ²⁺ ותנועות המתרחשות כל זמן בתוך התאים הנבדקים. בעקבות גידול מוצלח של תאי בדיקה, מחוון Ca ²⁺ חייב גם להיות הציג ביעילות תאים בתרבית אלה. זה הפך להיות אפשרי באמצעות וקטור adenoviral שנושא את SR-המתגורר Ca ^{2 +} אינדיקטור D1SR. כדי להשיג יעילות transfection גבוהה, התאים חייבים להיות מודגרות עם וקטורים ויראליים לפחות 36-48 שעות לפני הדמיה. הכנה זו מספקת כלי אמין למדידת Ca ^{2 +} ארעיים בתוך לומן SR עם דיוק שחזור גבוה.

מחוון D1SR להשתמש בפרוטוקול זה היא גרסה שונה של D1ER Ca ^{2 +} indicator כי נוצרה במקור על ידי המעבדה של ד"ר רוג'ר צ'יין באוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו, ^9,16 ארה"ב. D1ER המקורי שייך לדור שני של אינדיקטורים מקודדים גנטי Ca ²⁺ שנקראו cameleons המציגים רגישויות ²⁺ Ca פני טווח רחב הרבה יותר (0.5-160 מיקרומטר) לעומת מדדים קודמים Ca ^{2 + 9,16.} D1SR גרסה חדשה, מתנה סוג מד"ר וויין חן (מאוניברסיטת אלברטה, קנדה), לעומת זאת, נושא רצף calsequestrin מוטציה (במקום רצף calreticulin כמו D1ER המקורי). Calsequestrin מוטציה יש מופחת מחייב Ca ^{2 +} הפותר את הבעיה של מתחרים עם calsequestrin אנדוגני מחייב Ca ^{2 +} בתוך SR לומן ^11. מחוון D1SR נושאת חלבון פלואורסצנטי ציאן משופרת קטום (CFP) ו חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כי לאגד על ידי חלבון מקשר המכיל calmodulin שונה (CAM) ו M13 (tהוא 26-שאריות פפטיד של קינאז אור-שרשרת שרירן הנקשרת רצפים CAM). רצף CAM-M13 שונה כדי למנוע M13 מלהיקשר calmodulin אנדוגני. כמו כן, על מנת להבטיח שימור SR, רצף calsequestrin נוסף על קצה 5'של CFP ^11. כאשר חייב Ca ^{2 +,} תחום CAM-M13 עובר שינויים מרחביים כי לגרום לעלייה בהעברת האנרגיה בין CFP האיגוף ו YFP, הנרשם כעלייה את עוצמת אות הסריג. מצד השני, כאשר הריכוז של SR לומינל Ca ^{2 +} טיפות, תחום CAM-M13 עובר שינויים מרחביים הפוכים, וכתוצאה מכך ירידת העברת האנרגיה בין CFP האיגוף ו YFP, וירידה משמעותית בעוצמת אות סריג .

Protocol

הצהרה אתיקה: כל הניסויים ונהלים נערכו בהסכם עם הנחיות בטיחות ביולוגית מעבדה של אוניברסיטת קולומביה הבריטית, ונקובר, קנדה.

1. הכנה 35 מ"מ תרבות מנות זכוכית תחתונות למיקרוסקופיה Confocal מבוססת סריג

1. כן צלחות באמצעות ההליך הבא 36-48 השעות לפני ניסויים.
2. תחזור תערובת חלבונים דביקה נבחרה 0.25% טריפסין-EDTA מ -20 ° C אחסון ולשמור אותם באמבט קרח נייד עד שימוש.
   הערה: תערובת חלבוני ציפוי צריכה להיחשף רק RT במשך תקופה קצרה של זמן כדי למנוע את התערובת מן לחיזוק לפני השימוש. פתרון טריפסין צריך להיות גם לשמור מצונן עד הצורך; לחילופין, טריפסין ניתן לאחזר מהאחסון -20 ° C לאחר השלמת שלב 1.5.
3. כן 01:25 דילול של תערובת חלבונים: DMEM (אין סרום מוסף, מצונן). עבר נפח מתאים של חלבון תערובת / DMEM על כל צלחת שמכינה. במשך 35 צלחות מ"מ עם רצפת זכוכית, להוסיף כ 200 μl כדי לכסות באופן מלא מעגל זכוכית פנימי בתחתית הצלחת.
4. השאירו צלחות לשבת לפחות 30 דקות בתוך ארון בטיחות ב RT. DMEM חם עם 10% NCS ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים במהלך פרק זמן זה.
5. טריפסין חם באמבט מים עד 37 ° C מיד לפני הצעדים הבאים.
6. הסר DMEM שנמצא כעת בקבוק תרבות בעזרת פיפטה זכוכית יניקה. רצפת Wash של הבקבוק עם PBS סטרילי חמים כדי להסיר שאריות DMEM הנותרים.
7. לסלק תאי שריר חלק מתורבתים בעבר מלמטה בקבוק:
   הערה: Flask הוקמה ימים את הצעד הזה כדי לאפשר לתאים להגיע confluency הרצוי (כ 80%) לפני הכנת צלחת. תאים הושעו במקור בבקבוק ב 20 מ"ל של DMEM עם 10% NCS וטופחו על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ האספקה ​​למשך 24 שעות, ולאחר מכן אספקת DMEM היה רענון ותאי הוחזרו חממה. DMEM שרועננה ערבר"י 48 שעות ביצוע השלבים הראשוניים האלה עד התאים הגיעו confluency.
   1. לשטוף בקבוקון במהירות עם 1 מ"ל של טריפסין ולאחר מכן הסר 1 מ"ל טריפסין באמצעות שאיבה.
   2. מוסיפים עוד 1 מ"ל של טריפסין ולהשאיר למשך תקופה ארוכה יותר (כ 30-60 שניות), מרשרש הבקבוק כדי להבטיח את האנזים יוצר קשר עם כל תחתית הבקבוק.
   3. שים לב כמה תאים יש מנותק תחת מיקרוסקופ עד מרוצי הפרדה מן הבקבוק. פתרון טריפסין מרשרש חלופי וניתוק תא בדיקה עד מרוצה חלקם של תאים המופרדים מן הבקבוק.
      הערה: צורת הבקבוק ניתן להחזיר בחממה במשך כ 30-60 שניות כדי להאיץ את התהליך הזה על 37 מעלות צלזיוס.
   4. לאחר התאים כבר וחילצה באמצעות טריפסין, להוסיף DMEM טרי עם 10% NCS אל הבקבוק כדי לעצור את התגובה טריפסין (נפח מספיק כך טריפסין מהווה 1/8 ^ה הנפח הכולל בקבוק).
      הערה: לדוגמה, בעת שימוש בבקבוק תרבות 250 מ"ל, זה היהלהיות 7 מ"ל DMEM להוסיף 1 מ"ל של טריפסין כדי לגרום 8 מ"ל של תמיסת התא.
8. העברה שהתקבלה פתרון תא מהבקבוק כדי נקי (שכותרתו) 50 מ"ל צינור חרוטים.
9. הוסף 1 מ"ל טרי DMEM בתוספת 10% NCS על כל צלחת שמכינים (בינוני מספיק כדי להימשך 24 שעות).
10. בעדינות להפוך שפופרת המכילה מספר פעמים פתרון התא כדי לשבור את כל גלולה שאולי נוצרו.
11. פיפטה רצויה נפח של פתרון תא מעורב בעדינות לתוך כל צלחת.
    הערה: מספר SMCs המומלץ מצופה עבור פרוטוקול זה הוא 0.5-0.8 x 10 ⁶ לכל 35 מנות מ"מ תרבות. מספרים אלה עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא צריך להיבדק שונה על ידי כל מעבדה.
12. מערבולת כל צלחת ביסודיות עם כיוון השעון / נגד כיוון השעון כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים על פני תחתית הכוס.

2. Transfection חלוף עם adenoviral וקטור נשיאה ²⁺ מחוון D1SR Ca

1. בעקבות תוספת של ליdium פתרון התא על כל צלחת, לעזוב צלחות כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ אספקת hr 1 לפחות, כדי לאפשר לתאים לצרף כראוי זכוכית בתחתית הכלים. בדוק צלחות תחת מיקרוסקופ ב 15 מרווחי דקות עד התאים מחוברים בבירור.
2. תחזור aliquot אדנו-D1SR מאחסון -80 ° C ולשמור על באמבט קרח נייד להובלה אל ארון בטיחות ביולוגי.
3. המינון הרצוי פיפטה (ריבוי של זיהום של 100) של D1SR מקורר על כל צלחת.
   הערה: החישוב עבור נפח של פתרון adenoviral צורך לכל צלחת תלוי כייל הנגיף פתרון המניות המקורי, אשר מוצג כיחידה פלאק ויוצרים (PFU). בהתבסס על הניסיון שלנו, אנו ממליצים על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 100, אשר מתפרשת החלקיקים מספר או וירוס צריך להדביק תא שריר חלק אחד (SMC) בצלחת תרבות.
4. דגירת התאים הנגועים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% O האספקה ​​CO ₂ / N.
5. למחרת, לחדש תאים עם 1 מ"ל של DMEM טריים בתוספת 10% NCS.
6. דגירה צלחות חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ O / N.

3. מדידה של SR לומינל Ca ^{2 +} שימוש הדמיה Confocal מבוססי סריג

1. לאחר דגירת O / N, להסיר את מדיום התרבות מהצלחת.
2. לשטוף את הצלחת תרבות עם חיץ פיזיולוגית חמה 1 מ"ל HEPES-PSS המכיל (ב mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, גלוקוז 10, KCl 5, 5 HEPES, CaCl ₂ 1.5 ו MgCl ₂ 1 (pH 7.4) שלוש פעמים.
3. הוסף 1 מ"ל טרי חיץ HEPES-PSS חם מיד לפני תחילת ההקלטה.
4. בצע הדמיה ראשונית באמצעות SE הסריג (רגישה-פליטה) היישום (או תכונה דומה) על התוכנה הנלווית של מיקרוסקופ confocal.
   1. לאחר היישום פתוח, לחץ על הכרטיסייה "הגדרות" כדי להתאים את הגדרות כדי להשיג תנאי ניסוי רצויים.
   <li> שינוי ידני בהגדרות הערוץ, כך התאים נרגשים ברצף ב 440 ננומטר (עבור התורם סריג ערוצים) 513 ננומטר (עבור ערוץ acceptor). אסוף את אורכי גל הפליטה ב 488 ננומטר (עבור התורם) ו 535 ננומטר (עבור סריג ו acceptor).
   2. הגדר את עוצמת האור על העברת 15%, עם זמן חשיפת עירור 150 ms של תאים (זמן הקלטה עבור שלושה תורם CFP רציף, סריג, וערוצי acceptor YFP) ו -10 במרווחים שניים בין חשיפות.
5. ייצב צלחת על במת מיקרוסקופ.
6. השתמש בלחצן "חי" כדי לבדוק את רזולוציית התמונה. כוונן הגדרות נוספות עד רזולוציה הרצוי הוא הגיע.
7. עדיין תחת הלשונית "הגדרות", לקחת תמונה של המדגם באמצעות הלחצן "לכידת תמונה".
8. על מנת להזיז את הכרטיסייה "ההערכה", לבחור את השיטה המתאימה לחישוב יעילות הסריג עבור הניסויים נעשתה. שיטה 3, באמצעות חישוב ratiometric _[א E (i) = B / A], מומלץ ניסויים מעורבים cameleons כגון מחוון D1SR.
9. לעבור אל הכרטיסייה "גרף" להיות מסוגל לראות את הערך העוצם מוקלט בצורת גרף במהלך הניסוי.
10. צייר ROI במציג התמונות כדי לבחון את עוצמת הממוצע המקביל של אזור זה של הריבית על הגרף ככל שמתקדם הניסוי.
    הערה: חוקר יכול גם לבחור לצייר ROIs המרובה ויש מקביל עוצם יתועדו ויוצג בו זמנית על הגרף. לחלופין, חוקרים ישרטטו החזר השקעה אחת להקלטה ראשונית, והמשיכו להתוות ROIs המרובה במועד מאוחר יותר על ידי פתיחת קובץ הניסוי על גרסת ניתוח מונחה נתונים של התוכנה.
    הערה: פירוט נוסף על הצעדים הנדרשים כדי להגדיר ניסויים מבוססי סריג ניתן למצוא מדריכים אשפים יישום סריג. אם המיקרוסקופ אינו מצויד אשף סריג, בפרוטוקול הבא ניתן להשתמש כדי להגדיר את הפרמטרים עבורהקלטה ידנית.
11. התחל הקלטה ולאפשר איסוף נתונים עבור לפחות 3 דקות כדי להבטיח הקלטת בסיס יציבה של האות לפני החדרת הסוכן של עניין.
12. הציגו Ca ²⁺ סוכן -moving (למשל 2 מיקרומטר thapsigargin; 100 ננומטר אנדותלין -1) ככלי ומכלה SR Ca ^{2 +,} על ידי pipetting ידנית במינון קבוע מראש ישירות לתוך הצלחת בנקודה הכי קרובה לאזור ההוויה עניין רשם ככל האפשר. המשך הקלטה עבור טיפול פוסט זמן רצוי.
13. ratiometric הלכידה סריג תמונות סדרתי (512 x 512 פיקסלים) עם מטרת נפט טבילה 63X של המיקרוסקופ confocal הפוכה באמצעות יישום SE הסריג.
14. איסוף נתונים נובעים הדמיה מתוך מקבץ של 5-10 SMCs בכל אזור של (ROI) הריבית ובהמשך לעצב ולנתח באמצעות תוכנה מבוססת סטטיסטיקה.
    1. כדי לשמור את הנתונים לשימוש מאוחר יותר, לחץ לחיצה ימנית על העקבות רשמו ולבחור באפשרות "ייצא" כדי SAVדואר אלקטרוני עם עוצמות אות ממוצעות שנרשמו בכונן הנבחר של החוקר.
    2. לנרמל את נתוני כל ניסוי פרט על ידי חלוקת כל נקודת נתונים על ידי הערך העוצם החל נצפה בנקודת זמן 0 שניות.
    3. נתונים מנורמלים יבוא מגיליונות אלקטרוניים לתוך קובץ פרויקט תוכנה סטטיסטי על ידי העתקה ידנית והדבקה שורות נתונים רלוונטיות מהגיליון האלקטרוני / sec המקורי שלהם.
    4. באופן אוטומטי ליצור גרפים המתאים ערכות נתונים ולהדביק לתוך התוכנית.
       הערה: הגדרות ברירת המחדל של התכנית ליצור קו גרפים מנתונים מיובאים. סוג הגרף המוצג ניתן לשנות על ידי לחיצה על "בחר סוג אחר של גרף" הכפתור תחת "השינוי" כותרת נמצא בתוך הכלים הראשיים.
    5. נתוני פול מייצגים ניסויים עצמאיים רבים בתוך קבוצה גדולה יותר של ניסויים זהים לגיליון נתונים יחיד לייצר עקבות ממוצעות עבור הבדיקה הספציפית שבוצעה.
4. הכנה של Ca cytoplasmic ²⁺ מחוון
1. ממיסים 0.0125 גרם Pluronic חומצה (PA) ב 1 מ"ל של sulfoxide דימתיל (DMSO) בצינור microcentrifuge שחור (ייתכן שיהיה צורך לחמם את הצינור באמבט מים ניידים לעזור לפזר PA).
2. אחזור צינור (50 מיקרוגרם) של צבע אינדיקטור ציטופלסמית Ca ^{2 +} (AM Fluo-4) מאחסון -20 מעלות צלזיוס.
3. לעטוף את הצינור של צבע בנייר כדי להגן עליו ככל האפשר ממגע עם אור.
4. פיפטה 45 μl של פתרון PA + DMSO לתוך הצינור המכיל את צבען. עוטפים פתרון DMSO + PA בנייר ולאחסן ב RT.
5. מערבבים התוכן של הצינור היטב על ידי pipetting למעלה פתרון ולמטה מספר פעמים. לחלופין, sonicate הצינור לצבוע במשך 10 דקות.
   הערה: או שיטה להפצת לצבוע ביסודיות לאורך כל פתרון DMSO + PA יהיה מספיק; זה פשוט עניין של העדפה של החוקר. אם החוקר בוחר sonicate פתרון, זהצריך להיעשות על שטח / חדר מבודד במקום שאחרים לא יושפעו על ידי הרעש. חוקר צריך גם להשתמש אגזוזים כבדים כדי להגן על אוזניים.
   1. אם sonicating פתרון, הכנס צינור עטוף בנייר אלומיניום המכיל את צבען בתוך מחזיק קצף צינור ומקום בתוך 2/3 מלאה (עם DH ₂ O) אמבטית sonicator.
   2. מקום באמבטיה sonicator במכונה אזור / חדר וכוח מבודדים על (להבטיח בארה'ב מגן נמצאת במקום לפני ייזום תהליך sonication). להשאיר מקום ולהשאיר מכונת ריצה במשך 10 דקות לפני סגירת אותו ואחזור הצינור (לשמור עטוף בנייר כסף כדי להגן מפני אור עבור זמן רב ככל האפשר).
6. Aliquot הפתרון המעורב חברה ביסודיות לתוך צינורות כהים microcentrifuge (5 μl לכל צינור, אמור להיות מסוגל לעשות 10 צינורות בסך הכל).
7. עוטפים כל צינור aliquot בנייר כסף. צינורות לייבל ולאחסן יבוש בתנאים -20 ° C עד השימוש.

5. מדידת cytoplasmic Ca ²⁺

1. בצע את השלבים ב 1.1-1.12 להכין צלחות תרבית של SMCs אבי העורקים חולדה.
2. הסר את מדיום התרבות מהצלחת בבית תרבות פוסט 48 שעות.
3. הסר את aliquot בעבר הכין האינדיקטור ציטופלסמית Ca ^{2 +} (5 μl) מאחסון -20 ° C ולשמור באמבט קרח ניידים עד השימוש.
4. לשטוף את הצלחת תרבות עם חיץ פיזיולוגית חמה 1 מ"ל HEPES-PSS המכיל (ב mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, גלוקוז 10, KCl 5, 5 HEPES, CaCl ₂ 1.5 ו MgCl ₂ 1 (pH 7.4) שלוש פעמים.
5. מערבב את המחוון עם 1 מיליליטר של חמי HEPES-PSS לטעון אותו על הצלחת התרבות.
6. דגירה SMCs עם מחוון עבור שעה 1 ב RT (24 מעלות צלזיוס).
7. הסר מחוון מהצלחת התרבות ולשטוף עם 1 מ"ל חם חיץ פיזיולוגית HEPES-PSS שלוש פעמים.
8. הוסף 1 מ"ל טרי חיץ HEPES-PSS חם מיד לפני תחילת ההקלטה.
9. צלמו תמונות סדרתי (512 x 512 פיקסלים) עם o 63Xמטרת il-טבילה של המיקרוסקופ confocal ההפוכה.
   1. שינוי ידני ההגדרות כך התאים נרגשים ב 488 ננומטר, ואת אורכי גל הפליטה נגבים 555 ננומטר עם מהירות סריקה של 700 הרץ.
   2. הגדר את עוצמת האור על העברת 15%, עם 150 זמן חשיפת עירור msec של תאים (כמות הזמן כי התאים נחשפים אור במרווחי זמן מסוים במהלך הקלטה) ו -5 במרווחים שניים בין חשיפות.
10. ייצב צלחת על הבמה מיקרוסקופ להתחיל להקליט.
11. שיא עבור לפחות 3 דקות כדי להבטיח הקלטת בסיס יציבה של האות לפני החדרת הסוכן של עניין.
12. הציגו Ca ²⁺ סוכן -moving (למשל 2μM thapsigargin) ככלי ומכלה Ca SR ^{2 +} (כמתואר בשלב 3.16) ולהמשיך הקלטה עבור הכמות הרצויה של הטיפול שלאחר זמן.
13. שיא עוצמת אות באמצעות תוכנה ספציפית-מיקרוסקופ פלואורסצנטי ידי ממוצעי סיgnals (F / F ₀₎ מתוך מקבץ של 5-10 SMCs בכל אזור של (ROI) ריבית. אסוף, פורמט, ולנתח נתונים נובעי הדמיה באמצעות תוכנת ניתוח נתונים. ראה שלבי 3.18.1-3.18.5 תיאור של איסוף נתונים וניתוח באמצעות תוכנה זו.

Representative Results

סעיף זה מספק דוגמאות של התוצאות ניתן להשיג באמצעות השיטה המתוארת ללכוד SR לומינל Ca ²⁺ נתוני ריכוז, בהשוואה לאופן מועסק בדרך של בעקיפין מדידת שינויי אברון ריכוזי החנות ^{2 +} Ca ידי התבוננות תנודות ציטופלסמית Ca ²⁺ .

איור 1 א מציג תמונת מצב של אזור של עניין (ROI) של התרבות SMC טרנספקציה עם אדנו D1SR בערוץ YFP (514 ננומטר עירור / 535 פליטה ננומטר). כפי שניתן לראות, למרות כל SMCs הן חיוביות לביטוי D1SR, ברור כי רמות ביטוי במדד D1SR להשתנות בין תאים שונים בתוך אותו ROI. 1B איור מראה השלכה 2-D של תמונה הקרינה של SMC טרנספקציה עם D1SR אדנו (ערוץ YFP), המציג תמונה ברורה של חלוקת Ca ²⁺בתוך הרשת לומינל SR המרחיבה. תרשים 1C מציג הפצת מחוון D1SR ב SMC באמצעות CFP (440/488 ננומטר), סריג (440/535 ננומטר), ו YFP (514/535 ננומטר) מסנן להקה עוברת.

כמו כן, אנו מציגים דוגמאות של עקבות אות Ca ²⁺ המתקבל ניטור התנועה של יון ממוקד זה SR, באמצעות מבחן ברור של חשיפה אקוטית של תאים לסוכן ריקון SR thapsigargin (2 מיקרומטר) (איור 2). כפי שניתן לראות בתרשים 2 א ו -2, thapsigargin גורם לירידה תוכן SR Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _SR).

באיור 3 א, הראינו תמונות מייצגות של SMCs תרבותי טעון עם מחוון ציטופלסמית Ca ²⁺ שטופלו thapsigargin סוכן ריקון SR (2 מיקרומטר). השיא החולף שנצפה אות Ca ²⁺ רשם ( 2 + שחרור לתוך הציטופלסמה של SMC, למרות שהמקור הארעי Ca ^{2 +} לא ניתן לזהות באופן מפורש.

תרשים 4 א מראה תמונות נציג של SMCs תרבותי המבטא את D1SR מחוון SR סידן שטופלו 100 ננומטר של אנדותלין -1. כפי שניתן לראות בשני דמויות 4 א ו -4, אנדותלין -1 גורם לירידה איטית, אך מתמדת תכולת הסידן SR כפי שהיא נמדדת על ידי ירידה אות D1SR סריג. כפי שניתן לראות, פרוטוקול סריג ratiometric חשוב מאפשר מחקר של Ca ^{2 +} התנועות קשורות ישירות למצב פעולה של הסוכן בשימוש. ומדידה ישירה התנועה של יון זה אל / מהחנות ²⁺ Ca הגדולה בתא באופן זה מועיל במתן נציג תוצאות Ca ישירות ²⁺ דינמיקה הנוגע לפעולות של SR או בשל שינוי הים בסביבת לומן SR.

הפצה איור 1. של D1SR מחוון SR Ca ^{2 +} SMCs עכברוש אבי העורקים. (א) תרבות נציג תמונה המתארת ​​SMC טרנספקציה עם וקטור andenoviral D1SR בבית זיהום שלאחר 48 שעות. (ב) היטל 2-D של תמונת קרינה של הפצת D1SR בתוך SMC בתרבית באמצעות ערוץ YFP (514 ננומטר עירור / 535 פליטת ננומטר). (C) תמונת מצב נציג של SMC טרנספקציה עם מחוון D1SR באמצעות CFP (440/488 ננומטר), סריג (440/535 ננומטר), ו YFP (514/535 ננומטר) מסננים הלהקה עוברים. ברי סולם = 10 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
איור 2. thapsigargin גורמת לירידה משמעותית [Ca ^{2 +]} _SR. (א) בזמן אמת תמונות pseudocolor (ערוץ סריג) של SMCs אבי העורקים חולדה תרבותי טרנספקציה עם D1SR ומטופל עם 2 מיקרומטר של thapsigargin המראה ירידה בעוצמת האות המציינת ירידה משמעותית תוכן SR Ca ^{2 +} עקב שחרור ²⁺ Ca-induced thapsigargin. (ב) עקבות נציג עבור ערך F / F ₀ ב SMCs התרבותי שטופל 2 מיקרומטר thapsigargin המאשר ירידה משמעותית [Ca ^{2 +]} _SR. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אלחוטי איור 3. thapsigargin גורמת לעלייה משמעותית ציטופלסמית Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i). (א) תמונות נציג של SMCs אבי העורקים חולדה תרבותי טעון עם מחוון ציטופלסמית Ca ^{2 +,} ו שטופלו 2 מיקרומטר של thapsigargin. כפי שניתן לראות, thapsigargin גורמת לעלייה משמעותית בעוצמת האות בתוך הציטופלסמה בשל שחרורו של Ca ^{2 +} מ SR. (ב) עקבות נציג עבור F / F ₀ ערך SMCs תרבותי שטופלו 2 מיקרומטר של thapsigargin. הגידול המתואר אות ²⁺ Ca נחשב יחסי לכמות של Ca ^{2 +} שוחררה מן SR. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

er.within-page = "1">
איור 4. אנדותלין -1 גורם לירידה משמעותית [Ca ^{2 +]} _SR. (א) תמונות pseudocolor בזמן אמת (ערוץ סריג) של SMCs אבי העורקים חולדה תרבותי טרנספקציה עם D1SR ומטופל עם 100 ננומטר אנדותלין -1 מראה איטי אך ירידה עקבית בעוצמת אות מה שמעיד על ירידה משמעותית תוכן SR Ca ^{2 +} עקב שחרור אנדותלין מושרה Ca ^{2 +} עבור SR. (ב) עקבות נציג עבור F / F ₀ ערך SMCs התרבותי שטופל 100 ננומטר של אנדותלין -1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את transfection של VSMCs עם אדנו D1SR ללמוד Ca ^{2 +} ריכוזים בתוך לומן של SR. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של Ca ^{2 +} בתוך אברון זה, כמו גם את התנועה לתוך / מתוך SR כתוצאה היישום של סוכנים שונים נע בסידן. לשיטה זו יתרונות רבים עבור חוקרים עובדים לקראת הבנה מקיפה של כמה שינויים ברמות SR ו cytoplasmic Ca ²⁺ להשפיע על בריאות הסלולר הכוללת וכיצד שינויים אלה הנם ייחודיים לכל שאר. תצפית מסורתית תנועה תאית Ca ^{2 +} כרוך המעקב של שינויים ברמות ציטופלסמית Ca ²⁺ בלבד. יתרון חשוב נגזר בעזרת מבני D1SR או דומה, אם כן, הוא היכולת לנטר תנועת יון זה מעורב אברון ספציפי כגון SR, ולא צורך להסיק מסקנות מעורפלות על השפעת אגוניסטים על SR ידיבעקיפין התבוננות שינויים ציטופלסמית Ca ^{2 +} רמות המושרה על ידי מניפולציה כזו. יחד באותה רוח, סוכנים המשרתים להשפיע SR Ca ²⁺ במיוחד ניתן להשתמש ביעילות רבה יותר כדי להעריך את השפעתם על שני אברון וריכוזי Ca ²⁺ הסלולר ברחבי התא ועל הבריאות הכללית. זה בגלל היתרונות האלה כי transfection של תאים בתרבית עם D1SR מספק ישירה יותר, כמו גם טיפוח, שיטת מדידת שינויי intraluminal רמות Ca ²⁺ SR. כמו כן בעל חשיבות היא העובדה כי מודל זה מספק כלי למדידת שינויי Ca ^{2 +} ריכוז בתוך רשת SR בתגובת סוכנים תרופתיים או פיסיולוגיים שידועים כי הם לגרום ללחץ הסלולר או תגובות תפקודיות ספציפיות. זה יהיה אפשרי על ידי יצירת עקומת כיול עבור מחוון D1SR בכל תא של עניין. ריכוז סידן בתוך / SR ER אז יכול להיות מחושב על ידי כיול יחס D1SR מנורמל (F / F ₀) כנגד עקומת הכיול הסטנדרטית כפי שתואר לעיל ^{10, 11.}

הגבלה של הפרוטוקול המתואר כאן היא העדר המידע הנגיש לשימוש של מבנה D1SR בסוגי תאים אחרים. שיטה זו עד כה הייתה מוצלחת עבור SMCs עכברוש במחקרים שלנו מספר פעמים ^13-15, אם כי השימוש בו עם סוגי תאים אחרים יש עד כה היה מוגבל. על ההצלחה של שיטה זו, היא חיונית, כי כל ננקטים אמצעי זהירות כדי להבטיח את התקדמות בריא הצעדים תרבית תאים. לכן חשוב להשתמש חומר מתאים המאפשר צמיחת תאים על צלחות, כגון חומרים דביקים הרבים מבוסס החלבון הזמינים לרכישה שהוכחו לקדם צמיחה מספקת של SMCs אב עורקי חולדה על צלחות מיקרוסקופיה עם רצפת זכוכית. משתנה הוא להצלחת transfection עם D1SR ו ההדמיה הבאה ניתן לראות אם תאים אינם מוכנים במהלך הקטעים האופטימליים שלהם בבית confluency הגבוה. שינויי phenotype טבועה שימוש ממושך של הקו הסלולרי אותו עלול לגרום transfection לא טוב ואת האות חלשה להיות שהושגו בשלב ההדמיה. המגבלות המעורבות בשימוש בשיטה זו ולכן הן בעיקר אלה שנעשו בלתי נמנעים על ידי עבודת תרבית תאים הנדרשת, כמו ניסויים באמצעות מבנה D1SR חייבים להיות מוכנים לפחות 36-48 שעות לפני הוצאה להורג על מנת להבטיח confluency של תאים עבור הדמיה מספיק זמן הדגירה של גידול תאים עם אדנו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.