Biology

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Published: June 20, 2016 doi: 10.3791/53912

Gabriela Ziomek¹, Cornelis van Breemen¹, Mitra Esfandiarei^1,2

¹Department of Anaesthesiology, Pharmacology, and Therapeutics, University of British Columbia, ²Department of Biomedical Sciences, Midwestern University

Introduction

Ca ^2+が、体内のすべての単一のセル内に豊富に見られる非常に重要なイオンです。それは、成長、増殖、遊走、およびアポトーシス^1-4を含む多くの異なる細胞機能、で重要な役割を持っています。よくのCa ^2+は両方の直接的および間接的な作用を介してこれらのプロセスに影響を与えることができることが確立されているため、このイオンの正常な細胞内濃度の変更が容易に影響を受けた細胞についてのネガティブな結果をもたらすことができます。 SRは、セル⁵内^の最大の細胞内Ca ²⁺ストアとして考えられています。 SRと細胞質の両方におけるCa ²⁺の定常状態レベルは正常にし、この細胞小器官の^の Ca ²⁺ -transportingチャンネルのうち、一定の磁束によって維持されています。損傷または疾患のいずれかの形式に起因する細胞に課さストレスの多い条件は、一般的に、彼に長期的な効果を持っているために行くSRのCa ²⁺の有意な変化と関連していますセルのALTH。例最も深刻で、ストレスを受けた細胞のできないことは、定常状態のSR Caを回復し、維持するため²⁺レベルはあっても、アポトーシス^6-8により死に終わることがあります。

携帯のCa ²⁺動態への現在の研究は、その数少ない研究試験細胞小器官^の Ca ²⁺ストアのコンテンツを直接^9-11事実によって制限されます。最も一般的な方法ではなく、SR ^の Ca ²⁺含有量^12-14の変化の間接的な測定として、細胞質のCa ²⁺レベルの測定を含みます。これらの実験において、 ^の Ca ^2+は、一般的^に細胞小器官の枯渇を引き起こす薬剤（ 例えば、タプシガルジン）の使用を介してSRから放出されるように誘導されます。結論は、その後、細胞質のCa ²⁺濃度の変動に基づいて、SRのCa ²⁺への変更に関連して描かれています。ラウンドアバウトのミリアンペアで、このような結論を導き出すために研究者のための残りの能力にもかかわらず、nner、のCa ²⁺測定SRのこの方法は明らかに収集されたデータの解釈に関する多くの制限で、そのような情報を収集するための間接的な方法です。この明確な制限を回避するためには、SR管腔ネットワーク内で直接見出さ^の Ca ²⁺の量を測定する必要があります。

直接管腔内SRのCa ²⁺レベルを記録することができるというの最終的な結果にバイタルは、細胞培養ツールと使用のCa ²⁺指標です。現在の原稿に参照されるデータについては、使用されたVSMCは、凍結した細胞株からのものであることに注意することが重要です。細胞を、5％CO ₂電源で一定37℃でインキュベート概説した実験用通路22-26上ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％新生仔ウシ血清（NCS）で培養しました。現在の方法を使用して、例えば、細胞が非常にうまく外をシミュレートするタンパク質混合物に成長しました組織¹⁵の多くの異なる種類の環境。 SRのCa ²⁺研究の静脈に沿って成功のための重要なのは、使用されるタンパク質の混合物の一種です。この場合には、低成長因子品種は、通常のCa ²⁺シグナル伝達と絶えず試験された細胞内で起こる動きに影響を与えることから、このツールの構成要素を回避するために必要でした。試験細胞の正常な成長に続いて、のCa ²⁺インジケータも効果的に、これらの培養細胞に導入されなければなりません。これは、SR-在住のCa ²⁺インジケーターD1SRを運ぶアデノウイルスベクターを使用することによって可能となりました。高いトランスフェクション効率を達成するために、細胞は、イメージングの前に、少なくとも36〜48時間のためのウイルスベクターを用いてインキュベートされなければなりません。この調製は、高い精度と再現性でSRルーメン内のCa ²⁺トランジェントを測定するための信頼性の高いツールを提供します。

このプロトコルで使用されるD1SRインジケータはD1ERのCa ^2+、iの修正変異体でありますもともとカリフォルニア大学の博士ロジャー・Y・チエンの研究室、サンディエゴ、USA ^9,16によって作成されたndicator。元D1ERは、前のCa ²⁺指標^9,16に比べてはるかに広い範囲（0.5から160μM）を介してのCa ²⁺感受性を表示カメレオンと呼ばれる遺伝的にコード化され^た Ca ²⁺指標の第二世代に属しています。新しい変種D1SR、博士ウェイン・チェン（アルバータ大学、カナダ）からの親切な贈り物は、しかし、（代わりに元D1ERのように、カルレティキュリンシーケンスの）変異カルセケストリンシーケンスを運びます。変異カルセケストリンは¹¹ルーメンSR内のCa ²⁺に結合する内因性カルセケストリンと競合の問題を解消するのCa ²⁺への結合を減少しています。 D1SRインジケータが変更されたカルモジュリン（CAM）とM13（トンを含むリンカータンパク質によるその結合切り捨て強化シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）を運びます彼のCaM）配列に結合ミオシン軽鎖キナーゼの26残基ペプチド。カムM13配列は、内在性カルモジュリンに結合するM13のを防止するように改変されています。また、SR保持を確実にするために、カルセケストリン配列はCFP ¹¹の5 '末端に追加されています。 Ca ²⁺と結合すると、カムM13ドメインは、FRETシグナル強度の増大として記録され、隣接CFPとYFPとの間のエネルギー伝達の増加をもたらす立体構造変化を経ます。ドロップ²⁺ SR腔のCa濃度は、カムM13ドメインが隣接CFPとYFPの間のエネルギー移動、及びFRETシグナル強度の有意な低下が低下、逆コンフォメーション変化を通過する一方、。

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Protocol

倫理の声明：全ての実験および手順はブリティッシュ・コロンビア州、バンクーバー、カナダの大学の研究室バイオセーフティ指針と一致して行われました。

FRETベースの共焦点顕微鏡のための35ミリメートルのガラス底の培養皿の調製

次の手順で36〜48時間前の実験とを使用してプレートを準備します。
Cストレージ-20℃から選択されたゲル状のタンパク質混合物と0.25％トリプシン-EDTAを取得し、使用するまでモバイル氷浴に保管してください。
注：コーティングタンパク質混合物は、使用前に固化から混合物を防止するために、短時間室温にさらされるべきです。必要になるまでトリプシン溶液も冷やしておくべきです。代わりに、トリプシンは、ステップ1.5が完了した後、-20℃の貯蔵から取り出すことができます。
DMEM（無血清添加、チルド）：タンパク質混合物の1時25希釈を準備します。各プレートが用意されているにタンパク質混合物/ DMEMの適切な量を転送。 35ミリメートルのガラス底板については、完全にプレートの底面に内側のガラスの円をカバーするために約200μlを添加します。
安全キャビネット内、室温で少なくとも30分間座ってプレートを残します。この期間中の水浴中で37℃、10％NCSで暖かいDMEM。
直前に次のステップに37℃に水浴中で暖かいトリプシン。
ガラスピペットと吸引を用いて培養フラスコに現在あるDMEMを削除します。残りのDMEM残留物を除去するために暖かい滅菌PBSでフラスコの床を洗います。
フラスコ底部から前培養平滑筋細胞を取り除きます。
注：フラスコは、細胞がプレートの準備の前に、所望の密集度（約80％）に達するようにするには、このステップに日に設立されました。細胞が元々 DMEM供給をリフレッシュし、細胞をインキュベーターに戻しした後、10％NCSを含むDMEM 20mlのフラスコ中に懸濁させ、24時間、5％CO ₂電源で37℃でインキュベートしました。 DMEMは前夜に更新されました細胞がコンフルエントに達するまで、これらの初期の手順以下のRY 48時間。
1. ウォッシュは、トリプシンの1ミリリットルで素早くフラスコ、その後、吸引を用いて、1 mlのトリプシンを削除します。
2. トリプシンの別の1ミリリットルに加え、酵素は、フラスコの底面全体に接触して確保するために、フラスコをswishing、より長い期間（約30-60秒）に向けて出発。
3. フラスコからの分離に満足するまで、顕微鏡下で剥離しているどのくらいの細胞を観察します。代替は、トリプシン溶液をswishing、フラスコから分離された細胞の割合に満足するまで、細胞の剥離をチェックします。
  注：フラスコを、37℃で、このプロセスをスピードアップするために約30〜60秒間インキュベーターに戻すことができます。
4. 細胞は、トリプシンを使用して取り除かれた後、（トリプシンをフラスコに総容量の^1/8を形成するように十分な体積）トリプシン反応を停止し、フラスコに10％NCSを用いて新鮮なDMEMを加えます。
  注：250mlの培養フラスコを使用した場合、例えば、これは、希望7 mlのDMEMを細胞溶液8mlにもたらすために、トリプシンの1mlに添加してもよいです。
（ラベル）クリーン50mlコニカルチューブにフラスコから細胞溶液を生じた譲渡。
各プレートに1ミリリットルの新鮮なDMEM + 10％NCSを追加しますが（十分な媒体が24時間持続するために）準備されています。
静かに形成された可能性のあるペレットを破壊するために細胞溶液を複数回含むチューブを反転。
ピペットを各プレートに穏やかに混合した細胞溶液の体積を所望します。
注：このプロトコルのためにメッキ推奨SMCの数が35ミリメートル培養皿あたり0.5〜0.8×10 ⁶です。これらの数は、細胞型に依存して変化してもよく、各研究所で試験され、修飾されるべきです。
ガラス下部に細胞の平等な分配を確保するために、各プレート徹底的に時計回り/反時計回りの渦巻。

D1SRのCa ²⁺インジケーターを運ぶアデノウイルスベクター2.一過性トランスフェクション

私の添加後各プレートにdiumとセルソリューション、細胞は皿の底にガラスに正しく取り付けることができるように、少なくとも1時間、5％CO ₂電源で37℃でインキュベートし、プレートを残します。細胞が明確に添付されるまで、15分間隔で顕微鏡下でプレートを確認してください。
-80℃ストレージからのアデノウイルスD1SRアリコートを取り出し、生物学的安全キャビネットに輸送するために、モバイル氷浴中に保ちます。
ピペット所望の投与量を各プレートに冷却D1SRの（100の感染多重度）。
注：プレートごとに必要なアデノウイルス溶液の体積の計算は、プラーク形成単位（PFU）として提示され、元の原液、中のウイルス力価に依存します。我々の経験に基づいて、我々は培養プレートに1平滑筋細胞（SMC）を感染させるために必要な番号やウイルス粒子として解釈される100の（MOI）を、感染の多重度をお勧めします。
5％CO ₂供給O / Nで37℃で感染させた細胞をインキュベートします。
翌日、新鮮なDMEM + 10％NCSの1ミリリットルで細胞を補充します。
5％CO _2、O / Nで37℃の加湿インキュベーター中で培養します。

FRETベースの共焦点イメージングを使用して3.測定SR腔のCa ²⁺

O / Nインキュベーション後、プレートから培地を除去します。
含む1ミリリットル温かい生理HEPES-PSS緩衝液で培養プレートを洗浄（mmol·Lに^- ^1）のNaCl 140、グルコース10、塩化カリウム5、HEPES 5、CaCl ₂を1.5およびMgCl ₂ 1（pH7.4）で3回。
直前の記録の開始に1ミリリットル新鮮な温かいHEPES-PSSのバッファを追加します。
共焦点顕微鏡の関連ソフトウェアにFRET SE（増感エミッション）アプリケーション（または同様の機能）を使用して初期撮影を行います。
1. アプリケーションが開いたら、目的の実験条件を達成するために、設定を調整する「設定」タブにクリックします。
2. 露光の間で10秒間隔（3つの連続CFPドナー、FRET、およびYFPアクセプターチャネルのための時間を記録する）、細胞の150ミリ秒の励起の露光時間で、15％の透過率で光の強度を設定します。
顕微鏡ステージ上のプレートを安定させます。
画像の解像度を確認するには、「ライブ」ボタンを使用します。所望の解像度に達するまで、さらに設定を微調整します。
それでも「設定」タブの下に、「キャプチャ画像」ボタンを使用してサンプルの画像を取ります。
「評価」タブに移動する、行われている実験のためのFRET効率を計算するために適切な方法を選択します。レシオメトリック計算[E _A（I）= B / Aを使用して方法3、]、このようなD1SR指標としてカメレオンを含む実験のために推奨されます。
実験中にグラフ形式で記録された強度値を観察することができるように、「グラフ」タブに切り替え。
実験が進むにつれて、グラフ上の関心のこの領域の対応する平均強度を観察するために、画像ビューアでROIを描きます。
注：研究者はまた、複数のROIを描き、対応する強度を記録し、グラフ上に同時に表示するように選択することがあります。また、研究者らは、最初の記録のための単一のROIを概説し、ソフトウェアのデータ分析指向のバージョンに実験ファイルを開くことによって、後で複数のROIの輪郭を描くに進むことができます。
注：FRETベースの実験をセットアップするために必要な手順に関するさらなる詳細は、FRETアプリケーションウィザードのマニュアルに記載されています。顕微鏡はFRETウィザードが装備されていない場合は、以下のプロトコルは、のパラメータを設定するために使用することができます手動で記録。
記録を開始し、目的の薬剤を導入する前に、信号の安定した基礎記録を確実にするために、少なくとも3分のデータ収集を可能にします。
手動で関心ビーイングの領域と近くにスポットでプレートに直接所定の線量をピペッティングすることにより、SRのCa ^2+を枯渇^させるためのツールとして、（100 nmのエンドセリン-1 例えば、2μMタプシガルギン）のCa ²⁺ -movingエージェントを導入可能性として記録。所望の時間の後処理のために記録を続けます。
レシオメトリックをキャプチャFRET SEアプリケーションを用いた共焦点倒立顕微鏡の63X油浸対物レンズとのシリアル画像（512×512ピクセル）をFRET。
関心の各領域における5-10のSMC（ROI）のクラスタからの撮像結果のデータを収集し、その後にフォーマットし、統計ベースのソフトウェアを使用して分析します。
1. 後で使用するためにデータを保存するには、記録されたトレース上で右クリックして、SAVする「エクスポート」オプションを選択します電子記録とのスプレッドシートは、研究者の選択したドライブ上の信号強度を意味します。
2. 時点0秒で観察された開始強度値によって各データポイントを分割して、各個々の実験からのデータを正規化します。
3. 手動で元のスプレッドシート/秒から関連するデータ行をコピーして貼り付けることにより、統計プログラムのプロジェクトファイルへのスプレッドシートからのインポート正規化されたデータ。
4. 自動的にプログラムに貼り付けられたデータセットに対応するグラフを生成。
  注：プログラムのデフォルト設定は、インポートしたデータから線グラフを生成します。表示されるグラフの種類は、メインツールバー内で見つかった見出し「変更」の「グラフの異なる種類を選択」ボタンをクリックして変更することができます。
5. 単一のデータ・シートに同一の実験の大きなグループ内の複数の独立した試験を表すプールのデータは、実行される特定のテストの平均トレースを生成します。

²⁺

黒のマイクロ遠心チューブ内のジメチルスルホキシド（DMSO）1ml中0.0125 gでプルロニック酸（PA）を溶解（PAの溶解を助けるために、モバイル水浴中でチューブを暖めるために有していてもよいです）。
-20℃の保存から細胞質のCa ²⁺指示薬色素（あるFluo-4 AM）のチューブ（50μgの）を取得します。
光との接触からできるだけそれを保護するために、箔中の染料のチューブを包みます。
色素を含有するチューブにDMSO + PAソリューションのピペット45μlの。 RTで箔とストア内のDMSO + PAソリューションを包みます。
徹底的に解決策の上下に複数回ピペッティングすることにより、チューブの内容物を混合。あるいは、10分間染料管超音波処理。
注：完全にDMSO + PAソリューション全体に染料を分配する方法のいずれかが十分であろう。単に研究者の好みの問題です。治験責任医師は、溶液を超音波処理することを選択した場合、それ他はノイズによって影響されない孤立した地域/部屋で行う必要があります。研究者はまた、耳を保護するために重いマフラーを使用する必要があります。
1. ソリューションを超音波処理した場合、超音波洗浄器（ _の dH ₂ Oで）フル2/3の内側に発泡チューブホルダーと場所の内部に染料を含有するアルミホイルにくるまれたチューブを挿入します。
2. 上の孤立した地域/部屋とパワー機に入れ超音波処理浴が（保護帽子を確保する前に、超音波処理プロセスを開始する場所にあります）。（できるだけ長く光から保護するためにホイルで包んでおく）部屋を出ると、それを遮断し、チューブを取得する前に10分間実行しているマシンのままにしておきます。
暗いマイクロ遠心チューブに今完全に混合した溶液アリコート（チューブあたり5μLを、10チューブ総作ることができるはずです）。
ホイルで各アリコートチューブを包みます。使用するまで-20℃の条件で乾燥剤でラベルのチューブとストア。

5.細胞質のCa ²⁺測定

ラット大動脈のSMCの培養プレートを準備するために1.1から1.12の手順に従ってください。
48時間後の培養液でプレートから培地を除去します。
-20℃の保存から細胞質のCa ²⁺インジケーター（5マイクロリットル）の先に調製したアリコートを削除し、使用するまでモバイル氷浴中で維持します。
含む1ミリリットル温かい生理HEPES-PSS緩衝液で培養プレートを洗浄（mmol·Lに^- ^1）のNaCl 140、グルコース10、塩化カリウム5、HEPES 5、CaCl ₂を1.5およびMgCl ₂ 1（pH7.4）で3回。
暖かいHEPES-PSSの1ミリリットルでインジケータを混合し、培養プレート上にロードします。
RT（24℃）で1時間の指標でのSMCをインキュベートします。
培養プレートからインジケータを削除し、1ミリリットル温かい生理HEPES-PSSバッファ3回洗浄します。
直前の記録の開始に1ミリリットル新鮮な温かいHEPES-PSSのバッファを追加します。
63X Oとシリアルの画像（512×512ピクセル）を取得共焦点倒立顕微鏡のIL-浸対物レンズ。
1. 手動で細胞が488nmで励起されるように設定を変更し、発光波長は700ヘルツの走査速度で555 nmで収集されます。
2. 細胞の150ミリ秒の励起露光時間（細胞を記録中、指定された時間間隔で光に暴露される時間量）と露光の間に5秒間隔で、15％の透過率で光の強度を設定します。
顕微鏡ステージ上のプレートを安定させ、記録を開始します。
前関心の薬剤を導入する信号の安定した基礎記録を確保するために、少なくとも3分間録音。
SRのCa ²⁺を枯渇させるためのツールとしてのCa ²⁺ -moving剤（ 例えば 、2μMタプシガルジン）を導入する（ステップ3.16で説明したように）と時間後処理所望の量の記録を継続します。
蛍光SIを平均化することにより、顕微鏡固有のソフトウェアを使用して記録信号強度興味（ROI）の各領域における5-10のSMCのクラスタからgnals（F / F _0）。収集フォーマット、およびデータ分析ソフトウェアを用いて画像化から生じるデータを分析します。このソフトウェアを使用して、データ収集の説明と分析のための手順を3.18.1-3.18.5参照してください。

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Representative Results

このセクションでは、間接的に、細胞質のCaの変動を観察することによって^の Ca ²⁺ストア濃度オルガネラへの変更を測定する一般的に用いられる方法と比較して、SR腔Ca ²⁺濃度データを捕捉するために記載された方法を用いて得られる結果の例を提供する²⁺ 。

図1Aは、（514 nm励起/ 535 nmの発光）YFPチャンネルでD1SRアデノウイルスでトランスフェクトされたSMCの文化の関心領域（ROI）のスナップショットを示しています。全てのSMCはD1SR発現について陽性であるが、示されているように、それはD1SRインジケーターの発現レベルは、同じROI内の異なるセル間で異なることは明らかである。 図1Bは、D1SRでトランスフェクトされたSMCの蛍光画像の2次元投影を示しますCa ²⁺の分布の鮮明な画像を提示するアデノウイルス（YFPチャンネル）、広大SR管腔ネットワーク内。 図1Cは、CFP（488分の440 nm）で、FRET（535分の440 nm）であり、YFP（535分の514 nm）のバンドパスフィルタを使用して、SMCでD1SR指標分布を示しています。

我々はまた、（2μM）（ 図2）タプシガルジンエージェントを空にするSRへの細胞の急性暴露の明確な試験を使用して、SRにこの対象となるイオンの動きを監視から得られ^た Ca ²⁺シグナルトレースの例を示しています。 図2Aおよび図2Bに示すように、タプシガルジンは、SR ^の Ca ²⁺含有量（の[Ca ^2+] _SR）の低下を誘導します。

図3Aに、我々はSR空剤タプシガルギン（2μM）で処理した細胞質のCa ²⁺インジケーターを搭載した培養平滑筋細胞の代表的な画像を示しています。記録され^た Ca ²⁺シグナルの観察された一過性のピーク（ 2+過渡現象の源は明示的に識別できない場合でも、SMCの細胞質へのCa ²⁺放出の指標です。

図4Aは、SRカルシウム指標D1SRを発現する培養平滑筋細胞の代表的なスナップショットを示し、エンドセリン-1の100nmで処理しました。 図4Aおよび図4Bの両方に示されるようにD1SR FRETシグナルの低下によって測定されるように、エンドセリン-1は遅いが、SRカルシウム含有量の安定した低下を誘導します。明らかなように、レシオメトリックFRETプロトコルが重要なのCaの研究を可能にする²⁺直接薬剤の作用機序に関連した動きが使用されます。直接このようにしてに/セルで最大のCa ²⁺ストアからこのイオンの動きを測定することが直接SRの行動や釣り銭に関係のCa ²⁺動態の結果の代表を提供する際に便利です SR内腔環境中のS。

ラット大動脈平滑筋細胞におけるSRのCa ²⁺インジケーターD1SRの 図1. 配布。（A）48時間後の感染でD1SR andenoviralベクターでトランスフェクトされた代表画像描いたSMCの文化。 （B）YFPチャネル（514 nm励起/ 535nmで発光）を用いて培養SMCにおいてD1SR分布の蛍光画像の2次元射影。 （C）CFP（488分の440 nm）を、FRET（535分の440ナノメートル）、およびYFP（535分の514 nm）のバンドパスフィルタを用いD1SR指標でトランスフェクトされたSMCの代表的なスナップショット。スケールバー=10μmとは。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図2. タプシガルジンは、の[Ca ^2+] _SR の大幅な低下を引き起こす 。培養ラット大動脈平滑筋細胞の（A）リアルタイム疑似カラーのスナップショット（FRETチャンネル）がD1SRでトランスフェクトし、2μMので処理された旨の信号強度の減少を示すタプシガルギンタプシガルギン誘発性のCa ²⁺放出にSR ^の Ca ²⁺含有量の有意な低下。 （B）の[Ca ^2+] _SRの大幅な低下を確認タプシガルジン2μMで処理された培養平滑筋細胞内のF / F ₀値のための代表的なトレース。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Fiのグレ3. タプシガルジンは、（[Ca ^2+] _i） の²⁺の細胞質のCaの有意な増加を引き起こします 。 （A）細胞質のCa ²⁺インジケーターを搭載した、およびタプシガルジンの2μMで処理した培養ラット大動脈平滑筋細胞の代表的なスナップショット。示されるように、タプシガルギン起因SRからのCa ²⁺放出を、細胞質内シグナル強度の有意な増加を引き起こします。 （B）タプシガルギンの2μMで処理された培養平滑筋細胞内のF / F ₀値のための代表的なトレース。 Ca ²⁺シグナルで描か増加はSRから放出され^た Ca ²⁺の量に比例すると考えられている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4.エンドセリン-1は、の[Ca ^2+] _SR。培養ラット大動脈平滑筋細胞の（A）リアルタイム疑似カラーのスナップショット（FRETチャンネル）D1SRでトランスフェクトし、100 nmのエンドセリン-1スローを示すで処理の大幅な低下を引き起こすが、原因SRのためのエンドセリン誘発性のCa ²⁺放出にSR ^の Ca ²⁺含有量の有意な低下を示す信号強度が着実に減少。 （B）エンドセリン-1の100 nmので処理された培養平滑筋細胞内のF / F ₀値のための代表的なトレース。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルは、SRのルーメン内のCa ²⁺濃度を研究するためにD1SRアデノウイルスとのVSMCのトランスフェクションを説明します。この方法は、異なるカルシウム移動剤を適用した結果に/ SRのうち、直接この細胞小器官内のCa ²⁺の測定だけでなく、その動きを可能にします。この方法は、SRおよび細胞質のCa ²⁺レベルの変化は、全体的な携帯の健康に影響を与えるとどのようにこれらの変更が相互に関連しているかの包括的な理解に向けて取り組んで研究者のための多くの利点を有しています。細胞内Ca ²⁺運動の伝統的な観測が唯一の細胞質のCa ²⁺レベルの変化を追跡することを含みます。 D1SRまたは類似の構築物を用い由来の重要な利点は、したがって、むしろSRに対するアゴニストの効果によって上あいまいな結論を引き出すするよりも、このようなSRのような特定の細胞小器官を含むこのイオンの動きを監視する機能です間接的にこのような操作によって誘発され、細胞質のCa ²⁺レベルの変化を観察します。同じ静脈に沿って、SRのCaに影響を与えるように働く薬剤は、特に、より効率的に細胞小器官、細胞全体の細胞^の Ca ²⁺濃度および全体的な健康の両方に対するそれらの効果を評価するために使用することができる^2+。それはD1SRで培養した細胞のトランスフェクションは、管腔内SRのCa ²⁺レベルの変化を測定するより直接的なだけでなく、無料の、方法を提供することで、これらの利点に起因しています。また、重要性のこのモデルは、細胞ストレスまたは特定の機能的応答を誘導することが知られている薬理学的または生理学的作用物質に応答してSRネットワーク内Ca ²⁺濃度の変化を測定するためのツールを提供することです。これは、関心のある任意の細胞でD1SRインジケータの較正曲線を生成することによって可能となります。 ER / SR中のカルシウム濃度は、正規化D1SR比（F / F _0を較正することによって計算することができます。）標準較正曲線に対して以前に^10、11記載の方法。

ここで概説したプロトコルの制限は、他の細胞型でD1SR構築物の使用に関する入手可能な情報の欠如です。他の細胞型との使用はこれまでに限られているが、この方法はこれまでのところ、我々の研究で複数回^13-15ラットのSMCのために成功しています。この方法の成功のためには、すべての予防措置は、細胞培養工程の健康な進行を確保するために取られることが重要です。ガラス底の顕微鏡プレート上のラット大動脈平滑筋細胞の十分な成長を促進することが証明されている購入のために利用可能な多くのタンパク質ベースのゲル状物質などのプレート上の細胞増殖を可能にする適切な材料を使用することが重要です。細胞は、それらの最適の通路の間に、高密集度で調製されていない場合D1SR、その後のイメージングでのトランスフェクションの成功の変動を観察することができます。 Pへの変更次善のトランスフェクションおよび弱い信号は、撮像段階の間に得られる可能性があり、同じ細胞株の長期の使用に固有henotype。 D1SR構造体を用いた実験は、イメージングのための細胞の密集度を確保するために前にその実行には、少なくとも36〜48時間のために準備しなければならないように、この方法の使用に関与する制限は、主にそのために必要な細胞培養作業によって避けられない作られたものであり、アデノウイルスで細胞を増殖させるのインキュベーションのための十分な時間。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

Acknowledgments

この作品は、[CVB＆MEにMOP-1112666]カナダ衛生研究所からの資金によってサポートされていました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.