Misura di fluttuazioni calcio all'interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Introduction

Ca ²⁺ è uno ione molto importante si trova in abbondanza all'interno di ogni singola cellula del corpo. Ha ruoli significativi in molte funzioni cellulari diverse, tra cui la crescita, la proliferazione, la migrazione e l'apoptosi ^1-4. E 'ben noto che la Ca ²⁺ può influenzare questi processi attraverso azioni dirette e indirette, e di conseguenza, le modifiche ai normali concentrazioni intracellulari di questo ione può facilmente portare a risultati negativi per le cellule colpite. Il SR è considerato come il più grande intracellulare Ca ²⁺ negozio all'interno della cella ^5. I livelli di stato stazionario di Ca ²⁺ sia nel SR e nel citoplasma sono normalmente mantenuti attraverso il flusso costante dentro e fuori le Ca ²⁺ -transporting canali di questo organello. Le condizioni di stress imposte sulle cellule a causa di qualsiasi forma di lesioni o malattie sono comunemente associati con cambiamenti significativi nella SR Ca ²⁺ che andare avanti per avere effetti duraturi sulla eglialth della cella. Nel più grave dei casi, l'incapacità di una cellula stressata per recuperare e mantenere lo stato stazionario SR Ca ^{2 +} livelli possono anche culminare nella morte per apoptosi ^6-8.

La ricerca attuale in cellulari Ca ²⁺ dinamica è limitata dal fatto che pochi studi di prova organello Ca ²⁺ contenuto negozio direttamente ^9-11. La pratica più comune prevede invece la misura di citoplasmatici di Ca ²⁺ livelli come misure indirette dei cambiamenti in SR Ca ²⁺ contenuti ^12-14. In questi esperimenti, Ca ²⁺ viene indotto ad essere rilasciato dalla SR attraverso l'uso di agenti farmacologici che causano deplezione del organello (es thapsigargin). Le conclusioni sono poi disegnati in relazione alle modifiche SR Ca ²⁺ sulla base fluttuazioni dei citoplasmatici di Ca ²⁺ concentrazioni. Nonostante la capacità residua per gli investigatori di trarre tali conclusioni in una rotonda manner, questo metodo di SR Ca ²⁺ misura è chiaramente un modo indiretto per raccogliere tali informazioni, con molte limitazioni relative all'interpretazione dei dati raccolti. Per aggirare questo chiaro restrizione, è necessario misurare la quantità di Ca ²⁺ trovato direttamente all'interno della rete luminale SR.

Vitale per il risultato finale di essere in grado di registrare direttamente endoluminali SR livelli di Ca ²⁺ sono gli strumenti di coltura cellulare e l'indicatore di Ca ²⁺ utilizzato. Per i dati di riferimento nel manoscritto attuale, è importante notare che VSMC utilizzati provenivano da una linea cellulare congelati. Le cellule sono state coltivate in terreno Dulbecco Modified Eagle (DMEM) + 10% di siero di vitello neonato (NCS) su passaggi 22-26 per gli esperimenti descritti, incubate a una costante 37 ° C con 5% di CO ₂ di alimentazione. Utilizzando il metodo attuale, per esempio, le cellule sono state coltivate con successo su una miscela di proteine ​​che simula il extracellulareambiente di molti diversi tipi di tessuto ^15. Importante per il successo lungo la vena della SR Ca ²⁺ ricerca è il tipo di miscela proteina utilizzata; in questo caso, una varietà a basso fattore di crescita era necessario evitare componenti di questo strumento comprometta il regolare Ca ²⁺ segnalamento e movimenti costantemente avvenuto nelle cellule testate. Dopo crescita di successo di celle di prova, l'indicatore Ca ²⁺ deve essere effettivamente introdotto a queste cellule in coltura. Questo è diventato possibile utilizzando un vettore adenovirale che porta il SR-residente Ca ²⁺ indicatore D1SR. Per ottenere una elevata efficienza di trasfezione, le cellule devono essere incubate con vettori virali per almeno 36-48 ore prima di imaging. Questa preparazione fornisce uno strumento affidabile per misurare Ca ²⁺ transitori all'interno del lume SR con elevata precisione e riproducibilità.

Indicatore D1SR utilizzato in questo protocollo è una variante modificata del D1ER Ca ²⁺ indicator che è stato originariamente creato dal laboratorio del Dr. Roger Tsien presso l'Università della California, San Diego, USA ^9,16. Il D1ER originale appartiene a una seconda generazione di geneticamente codificati Ca ²⁺ indicatori chiamati Cameleons che visualizzano Ca ²⁺ sensibilità su una gamma molto più ampia (0,5-160 micron) rispetto ai precedenti Ca ²⁺ indicatori ^9,16. Il nuovo D1SR variante, un gentile dono del Dr. Wayne Chen (Università di Alberta, Canada), tuttavia, comporta una sequenza calsequestrina mutante (invece di una sequenza calreticulin come nel D1ER originale). Il calsequestrina mutante ha una ridotta vincolante per Ca ²⁺ che elimina il problema di competere con calsequestrina endogena nel legame di Ca ²⁺ all'interno della SR lume ^11. L'indicatore D1SR trasporta una proteina fluorescente troncata migliorato ciano (PCP) e di proteine ​​di colore giallo fluorescente (YFP) che si legano da una proteina linker contenente calmodulina modificato (CAM) e M13 (tegli peptide di 26 residui di miosina chinasi luce-catena che lega a camma) sequenze. La sequenza CAM-M13 è stato modificato per evitare M13 di legarsi a calmodulin endogena. Inoltre, per evitare la fuoriuscita SR, una sequenza calsequestrina è stato aggiunto all'estremità 5'della PCP ^11. Quando è legato al Ca ^2+, il dominio CaM-M13 passa attraverso cambiamenti conformazionali che provocano un aumento del trasferimento di energia tra la PCP accompagnamento e YFP, che viene registrato come un aumento dell'intensità del segnale FRET. D'altra parte, quando la concentrazione di SR luminale Ca ²⁺ gocce, il dominio CaM-M13 passa attraverso cambiamenti conformazionali inversa, con una conseguente diminuzione del trasferimento di energia tra la PCP accompagnamento e YFP, e un calo significativo dell'intensità del segnale FRET .

Protocol

dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti e le procedure sono state condotte in accordo con le linee guida Laboratory Biosafety della University of British Columbia, Vancouver, Canada.

1. Preparazione di 35 mm con fondo di vetro piatti della cultura per FRET-based Microscopia confocale

1. Preparare piatti utilizzando la hr seguente procedura 36-48 prima di esperimenti.
2. Recupera miscela proteica gelatinosa scelto e lo 0,25% tripsina-EDTA da -20 ° C di stoccaggio e tenerli in bagno di ghiaccio mobili fino al momento dell'uso.
   NOTA: La miscela di proteine ​​di rivestimento deve essere esposto al RT per un breve periodo di tempo per evitare che il composto solidificazione prima dell'uso. soluzione tripsina dovrebbe anche essere a mantenere refrigerata fino a quando necessario; In alternativa, tripsina può essere recuperato da stoccaggio -20 ° C a seguito del completamento della fase 1.5.
3. Preparare una diluizione 1:25 di miscela proteica: DMEM (senza siero aggiunto, refrigerati). Trasferire il volume appropriato di proteine ​​miscela / DMEM ad ogni piatto in fase di preparazione. Per 35 lastre di vetro a fondo mm, aggiungere circa 200 ml di coprire completamente cerchio di vetro interno sulla parte inferiore della piastra.
4. Lasciare le piastre a sedere per almeno 30 minuti all'interno della cappa di sicurezza e a temperatura ambiente. DMEM caldo con il 10% NCS a 37 ° C in bagno d'acqua durante questo periodo di tempo.
5. tripsina calda in bagno d'acqua a 37 ° C immediatamente prima passaggi successivi.
6. Rimuovere DMEM che è attualmente in pallone di coltura utilizzando una pipetta di vetro e di aspirazione. Lavare piano del pallone con caldo PBS sterile per rimuovere i residui rimanenti DMEM.
7. Rimuovere le cellule muscolari lisce precedentemente coltivate dal basso pallone:
   NOTA: Boccetta è stata fondata giorni di tempo per questo passaggio per permettere alle cellule di raggiungere confluenza desiderata (circa l'80%) prima della preparazione piatto. Le cellule sono state inizialmente sospese nel pallone in 20 ml di DMEM con 10% NCS ed incubate a 37 ° C con 5% di CO ₂ fornitura per 24 ore, dopo di che fornitura DMEM era riposato e le cellule sono stati restituiti al incubatore. DMEM è stato aggiornato vigiliary 48 ore dopo questi primi passi fino a quando le cellule hanno raggiunto confluenza.
   1. Lavare Boccetta rapidamente con 1 ml di tripsina e quindi rimuovere 1 ml tripsina usando aspirazione.
   2. Aggiungere in altre 1 ml di tripsina e lasciare per lungo periodo (circa 30-60 sec), swishing pallone per garantire l'enzima fa contatto con l'intero fondo del pallone.
   3. Osservare quanto le cellule hanno staccato al microscopio fino soddisfatto con la separazione dalla boccetta. soluzione fruscio tripsina si alternano e si verifica il distacco delle cellule fino soddisfatti proporzione di cellule separate dalla boccetta.
      NOTA: Il pallone può essere restituito al incubatore per circa 30-60 secondi per accelerare questo processo a 37 ° C.
   4. Una volta che le cellule sono state sloggiato con tripsina, aggiungere DMEM fresco con 10% NCS al pallone per fermare la reazione tripsina (volume sufficiente affinché tripsina costituisce ^1/8 del volume totale nel pallone).
      NOTA: per esempio, quando si utilizza un pallone di coltura da 250 ml, questo sarebbeessere 7 ml DMEM aggiunge 1 ml di tripsina comportare 8 ml di soluzione di cellule.
8. Trasferimento risultante soluzione di cellule dal pallone ad un (etichettati) tubo da 50 ml pulito.
9. Aggiungere 1 ml di DMEM fresco più 10% NCS per ogni piatto in preparazione (media sufficiente per durare 24 ore).
10. Capovolgere delicatamente provetta contenente soluzione di cellule più volte per rompere qualsiasi pellet che possono essersi formate.
11. Pipetta volume di soluzione delle cellule delicatamente mescolato in ciascun piatto desiderato.
    NOTA: Il numero SMC consigliato placcato per questo protocollo è 0,5-0,8 x 10 ⁶ per 35 piatti della cultura mm. Questi numeri possono variare a seconda del tipo di cellula e dovrebbero essere testato e modificato da ciascun laboratorio.
12. Agitare ogni piatto a fondo in senso orario / antiorario per garantire la parità di distribuzione delle cellule attraverso fondo di vetro.

2. Transient trasfezione con adenovirale vettore di trasporto D1SR Ca ²⁺ Indicatore

1. Dopo aggiunta di medium e la soluzione cellulare per ogni piastra, lasciano piastre ad incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ alimentazione per almeno 1 ora per permettere alle cellule di allegare correttamente vetro sul fondo di piatti. Controllare piastre al microscopio a intervalli di 15 minuti fino a quando le cellule sono chiaramente allegati.
2. Recupera adenovirus-D1SR un'aliquota da stoccaggio -80 ° C e tenere in bagno di ghiaccio mobili per il trasporto di cabina di sicurezza biologica.
3. Pipetta dose desiderata (molteplicità di infezione di 100) di D1SR refrigerate per ciascuna piastra.
   NOTA: Il calcolo del volume di soluzione adenovirale necessaria per piastra dipende dal titolo del virus nella soluzione di riserva originale, che si presenta come unità formando la placca (PFU). Sulla base della nostra esperienza, si consiglia una molteplicità di infezione (MOI) di 100, che viene interpretato come le particelle numero o virali necessari per infettare una cellula muscolare liscia (SMC) nella piastra di coltura.
4. Incubare le cellule infettate a 37 ° C con 5% di CO ₂ di alimentazione O / N.
5. Il giorno dopo, ricostituire le cellule con 1 ml di DMEM fresco più 10% NCS.
6. Incubare le piastre in un incubatore umidificato a 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.

3. Misurazione della SR Luminal Ca ²⁺ Utilizzando FRET-based Imaging confocale

1. Seguendo O / N incubazione, rimuovere il terreno di coltura dalla piastra.
2. Lavare la piastra di coltura con 1 ml caldo tampone fisiologici HEPES-PSS contenente (in mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glucosio 10, KCl 5, Hepes 5, CaCl ₂ 1.5 e MgCl ₂ 1 (pH 7,4) per tre volte.
3. Aggiungere 1 ml caldo tampone HEPES-PSS fresco immediatamente prima dell'inizio della registrazione.
4. Eseguire l'imaging iniziale utilizzando l'applicazione FRET SE (sensibilizzato Emission) (o una funzione analoga) sul software associato del microscopio confocale.
   1. Una volta che l'applicazione è aperta, fare clic nella scheda "Setup" per regolare le impostazioni per ottenere condizioni sperimentali desiderati.
   <li> cambiare manualmente le impostazioni del canale in modo che le cellule siano eccitati in sequenza a 440 nm (per il donatore e ti agiti canali) e 513 nm (per il canale accettore). Raccogliere le lunghezze d'onda di emissione a 488 nm (per donatore) e 535 nm (per il tasto e accettore).
   2. Impostare l'intensità della luce in trasmissione il 15%, con 150 ms di eccitazione tempo di esposizione di cellule (tempo di registrazione per tre sequenziale donatore CFP, FRET e canali accettori YFP) e intervalli di 10 sec tra le esposizioni.
5. Stabilizzare piatto sul palco microscopio.
6. Utilizzare il pulsante "Live" per controllare la risoluzione delle immagini. Modificare le impostazioni ulteriormente fino a raggiungere risoluzione desiderata.
7. Ancora sotto la scheda "Impostazioni", scattare una foto del campione utilizzando il pulsante "Cattura immagine".
8. Passando alla scheda "Valutazione", scegliere il metodo appropriato per calcolare l'efficienza FRET per gli esperimenti stato fatto. Metodo 3, utilizzando il calcolo Raziometrico [E _A (i) = B / A], È consigliato per gli esperimenti che coinvolgono Cameleons quali l'indicatore D1SR.
9. Passare alla scheda "Grafico" per essere in grado di osservare i valori di intensità in fase di registrazione in forma grafica durante l'esperimento.
10. Disegnare un ROI nel visualizzatore di immagini per osservare la corrispondente intensità media di questa area di interesse sul grafico con il procedere dell'esperimento.
    NOTA: Investigator può anche scegliere di disegnare più ROI e hanno corrispondente intensità essere registrati e visualizzati contemporaneamente sul grafico. In alternativa, gli investigatori possono delineare una singola ROI per la registrazione iniziale, e procedere a delineare più ROI in un secondo momento aprendo il file esperimento su una versione di analisi orientata dei dati del software.
    NOTA: Per ulteriori dettagli sui passi necessari per impostare esperimenti FRET-based si possono trovare nei manuali guidata applicazione FRET. Se il microscopio non è dotato il FRET guidata, il seguente protocollo può essere utilizzato per impostare i parametri permanualmente la registrazione.
11. Inizia registrazione e poter rilevare i dati per almeno 3 minuti per assicurare una registrazione basale costante del segnale prima di introdurre l'agente di interesse.
12. Introdurre Ca ²⁺ agente -moving (es 2 mM thapsigargin; 100 nm endotelina-1) come strumento per esaurire SR Ca ^2+, pipettando manualmente la dose predeterminata direttamente nella piastra in un posto più vicino alla regione di interesse dell'essere registrata possibile. Continuare la registrazione per un trattamento post tempo desiderato.
13. Cattura raziometrico FRET immagini seriali (512 x 512 pixel) con un obiettivo ad immersione in olio 63X del microscopio invertito confocale utilizzando l'applicazione FRET SE.
14. Raccogliere i dati risultanti dalle immagini da un gruppo di 5-10 SMC in ciascuna regione di interesse (ROI) e successivamente formattare e analizzare le statistiche utilizzando il software-based.
    1. Per salvare i dati per un uso successivo, tasto destro del mouse sopra la traccia registrata e scegliere l'opzione "Esporta" per Save il foglio di calcolo con intensità di segnale registrati medi sul disco scelto dello sperimentatore.
    2. Normalizzare i dati provenienti da ciascun esperimento dividendo ciascun punto di dati per il valore di intensità partire osservato a punto di tempo 0 sec.
    3. Importa dati normalizzati da fogli di calcolo in un file di progetto programma statistico copiando e incollando le righe di dati rilevanti dal loro foglio di calcolo / sec originale manualmente.
    4. Generazione automatica di grafici corrispondenti alle serie di dati incollate nel programma.
       NOTA: Le impostazioni di default del programma generano grafici lineari da dati importati. Tipo di grafico visualizzato può essere modificata facendo clic sul pulsante "Scegli un altro tipo di grafico" sotto il "Change" Intestazione trovato all'interno della barra degli strumenti principale.
    5. dati del pool che rappresentano più prove indipendenti all'interno di un gruppo più ampio di esperimenti identici in un unico foglio di dati per produrre una traccia media per il test specifico effettuato.
4. Preparazione del citoplasmatica di Ca ²⁺ Indicatore
1. Sciogliere 0,0125 g Acido Pluronic (PA) in 1 ml di dimetilsolfossido (DMSO) in una provetta nero (può essere necessario riscaldare il tubo in bagnomaria cellulare per aiutare a sciogliere PA).
2. Recuperare un tubo (50 ug) del citoplasmatica di Ca ²⁺ colorante indicatore (Fluo-4 AM) da stoccaggio -20 ° C.
3. Avvolgere il tubo di colorante in un foglio di proteggere il più possibile il contatto con la luce.
4. Pipettare 45 ml di soluzione di DMSO + PA nella provetta contenente il colorante. Avvolgere soluzione DMSO + PA in un foglio e conservare a temperatura ambiente.
5. Mescolare contenuto della provetta accuratamente pipettando soluzione giù più volte su e. In alternativa, il tubo sonicare tintura per 10 min.
   NOTA: Entrambi i metodi di fondo distribuzione del colorante nella soluzione DMSO + PA sarà sufficiente; si tratta semplicemente di una questione di preferenza del ricercatore. Se investigatore sceglie di sonicare soluzione,dovrebbe essere fatto in un luogo isolato / stanza dove gli altri non saranno interessati dal rumore. Sperimentatore deve inoltre utilizzare silenziatori pesanti per proteggere le orecchie.
   1. Se sonicating soluzione, inserire il tubo stagnola avvolto contenente il colorante all'interno di un titolare di tubo di schiuma e posto all'interno del bagno completo sonicatore 2/3 (con dH ₂ O).
   2. Luogo bagno sonicatore in luogo isolato / camera e macchina di potere su (garantire copricapo protettivo è a posto prima di iniziare processo di sonicazione). Lasciare spazio e lasciare macchina in funzione per 10 minuti prima di chiudere fuori e recuperare il tubo (tenere avvolto in un foglio al riparo dalla luce per più a lungo possibile).
6. Aliquota della soluzione ora accuratamente miscelati in provette da microcentrifuga scuri (5 ml per provetta, dovrebbe essere in grado di fare 10 tubi totale).
7. Avvolgere ogni tubo aliquota in un foglio. Etichettare le provette e conservare in essiccante a -20 condizioni ° C fino all'utilizzo.

5. Misura della citoplasmatica di Ca ²⁺

1. Seguire i passaggi a 1,1-1,12 per preparare piastre di coltura di SMC aortico di ratto.
2. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra in cultura post 48 ore.
3. Rimuovere l'aliquota precedentemente preparata di citoplasmatica indicatore di Ca ²⁺ (5 ml) da stoccaggio -20 ° C e mantenere in bagno di ghiaccio mobili fino al momento dell'uso.
4. Lavare la piastra di coltura con 1 ml caldo tampone fisiologici HEPES-PSS contenente (in mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glucosio 10, KCl 5, Hepes 5, CaCl ₂ 1.5 e MgCl ₂ 1 (pH 7,4) per tre volte.
5. Mescolare l'indicatore di 1 ml di HEPES warm-PSS e caricarlo sulla piastra di coltura.
6. Incubare SMCs con l'indicatore per 1 ora a RT (24 ° C).
7. Rimuovere l'indicatore dalla piastra di coltura e lavare con 1 ml caldi fisiologici HEPES-PSS tampone per tre volte.
8. Aggiungere 1 ml caldo tampone HEPES-PSS fresco immediatamente prima dell'inizio della registrazione.
9. Cattura immagini seriali (512 x 512 pixel) con un 63X oobiettivo il-immersione del microscopio invertito confocale.
   1. Modificare manualmente le impostazioni in modo che le cellule sono eccitati a 488 nm, e le lunghezze d'onda di emissione sono raccolti a 555 nm con una velocità di scansione di 700 Hz.
   2. Impostare l'intensità della luce di trasmissione 15%, con 150 msec tempo di esposizione eccitazione delle cellule (la quantità di tempo che le cellule sono esposte alla luce ad intervalli di tempo indicati durante la registrazione) e 5 sec intervalli tra le esposizioni.
10. Stabilizzare piatto sul palco microscopio e avviare la registrazione.
11. Record per almeno 3 minuti per assicurare una registrazione basale costante del segnale prima di introdurre l'agente di interesse.
12. Introdurre Ca ²⁺ -moving agente (ad esempio 2μM tapsigargina) come strumento per la deplezione SR Ca ²⁺ (come descritto al punto 3.16) e continuare la registrazione per quantità desiderata di trattamento post tempo.
13. intensità del segnale di registrazione utilizzando il software specifico per microscopio a fluorescenza media sisegnal (F / F ₀₎ da un gruppo di 5-10 SMCs in ciascuna regione di interesse (ROI). Raccogliere, il formato, e analizzare i dati derivanti dalle immagini utilizzando il software di analisi dei dati. Vedere i passaggi 3.18.1-3.18.5 per la descrizione di raccolta e analisi dei dati utilizzando questo software.

Representative Results

Questa sezione fornisce esempi dei risultati che si possono ottenere con il metodo descritto per acquisire dati di concentrazione SR luminali di Ca ^2+, rispetto al modo comunemente impiegato per misurare indirettamente modifiche organelli concentrazioni negozio Ca ²⁺ osservando fluttuazioni citoplasmatica di Ca ²⁺ .

La figura 1A mostra un'istantanea di una regione di interesse (ROI) della cultura SMC transfettate con adenovirus D1SR nel canale YFP (514 nm di eccitazione / 535 nm di emissione). Come mostrato, anche se tutti CML sono positivi per l'espressione D1SR, è evidente che i livelli di espressione di indicatore D1SR variano tra cellule diverse all'interno della stessa ROI. Figura 1B mostra una proiezione 2-D di una immagine di fluorescenza di un SMC trasfettate con il D1SR adenovirus (canale YFP), che presenta un quadro chiaro di Ca ²⁺ distribuzioneall'interno della rete luminale SR espansiva. Figura 1C presenta la distribuzione indicatore D1SR nel SMC usando PCP (440/488 nm), FRET (440/535 nm), e YFP (514/535 nm) filtri passa-banda.

Mostriamo anche esempi di Ca ²⁺ tracce segnale ottenuto dal monitoraggio del movimento di questo ione mirata nel SR, utilizzando la chiara prova di esposizione acuta delle cellule di un agente SR svuotamento thapsigargin (2 mM) (Figura 2). Come mostrato in figura 2A e 2B, thapsigargin induce un calo SR contenuto di Ca ²⁺ ([Ca ^2+] _SR).

Nella Figura 3A, abbiamo mostrato immagini rappresentative di SMC coltivate caricati con l'indicatore citoplasmatica Ca ²⁺ trattati con SR svuotamento thapsigargin agente (2 mM). Il picco transitorio osservato nei registrato ²⁺ segnale Ca ( 2+ nel citoplasma della SMC, anche se la sorgente di Ca ²⁺ transitori non può essere identificato in modo esplicito.

Figura 4A mostra istantanee rappresentativi di SMC in coltura esprimenti l'indicatore D1SR SR calcio e trattati con 100 nm di endotelina-1. Come mostrato in entrambe le figure 4A e 4B, endotelina-1 induce una goccia lenta, ma costante contenuto di calcio SR misurata da un calo del segnale D1SR FRET. Come evidente, il protocollo FRET raziometrico permette importante studio di Ca ²⁺ movimenti direttamente connesse con la modalità di azione dell'agente utilizzato. Direttamente misurare il movimento di questo ione nel / dal più grande negozio di Ca2 ⁺ nella cella in questo modo è utile nel fornire risultati rappresentante di Ca ²⁺ dinamiche di competenza di azioni del SR oa causa di cambiamenti s in ambiente lume SR.

Figura 1. Distribuzione della SR Ca ^{2 +} indicatore D1SR nel ratto SMC aortica. (A) immagine Rappresentante raffigurante cultura SMC transfettate con D1SR vettore andenoviral a livello post infezione 48 ore. (B) la proiezione 2-D di un immagine di fluorescenza di distribuzione D1SR in un SMC colta utilizzando il canale YFP (514 nm di eccitazione / 535 nm di emissione). (C) snapshot Rappresentante di un SMC transfettate con indicatore D1SR usando CFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm), e YFP (514/535 nm) filtri passa-banda. Barre di scala = 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. tapsigargina provoca un calo significativo in [Ca ^2+] _SR. (A) in tempo reale istantanee PseudoColor (canale FRET) di coltura di ratto SMC aortica transfettate con D1SR e trattati con 2 mM di thapsigargin con una diminuzione dell'intensità del segnale che indica un calo significativo SR Ca ²⁺ contenuti dovuta al rilascio tapsigargina indotto da Ca ^2+. (B) traccia Rappresentante per F / F ₀ valore nel SMC colture trattate con 2 mM tapsigargina confermando un calo significativo in [Ca ^2+] _SR. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. tapsigargina causa un aumento significativo citoplasmatica Ca ^{2 +} ([Ca ^2+] _i). (A) istantanee rappresentativi di coltura di ratto SMC aortica carichi di citoplasmatica indicatore di Ca ^2+, e trattati con 2 mM di thapsigargin. Come mostrato, thapsigargin provoca un notevole aumento dell'intensità del segnale all'interno del citoplasma a causa del rilascio di Ca ²⁺ dal SR. (B) traccia Rappresentante per F / F ₀ valore nel SMC in coltura trattati con 2 mM di thapsigargin. L'aumento raffigurato in Ca ²⁺ segnale è considerato proporzionale alla quantità di Ca ²⁺ rilasciato dalla SR. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. L'endotelina-1 provoca un calo significativo in [Ca ^2+] _SR. (A) in tempo reale istantanee PseudoColor (canale FRET) di coltura di ratto SMC aortica transfettate con D1SR e trattati con 100 nm endotelina-1 che mostra un lento ma costante diminuzione dell'intensità del segnale che indica un calo significativo SR contenuto di Ca ²⁺ dovuta al rilascio di endotelina-indotta Ca ²⁺ per la SR. (B) traccia Rappresentante per F / F ₀ valore nel SMC in coltura trattati con 100 nm di endotelina-1. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo descrive la transfezione di VSMCs con l'adenovirus D1SR per studiare Ca ²⁺ concentrazioni all'interno del lume del SR. Questo metodo consente la misura diretta di Ca ²⁺ all'interno di questo organello nonché il suo movimento in / out della SR in conseguenza dell'applicazione di diversi agenti calcio-movimento. Questo metodo ha molti vantaggi per gli investigatori che lavorano per una comprensione completa di come i cambiamenti a SR e citoplasmatici di Ca ²⁺ livelli influenzano la salute cellulare generale e come questi cambiamenti sono collegati tra loro. L'osservazione tradizionale intracellulare movimento Ca ²⁺ comporta il monitoraggio delle modifiche ai soli citoplasmatici di Ca ²⁺ livelli. Un importante vantaggio derivante dall'utilizzo dei D1SR o simili costrutti, quindi, è la capacità di controllare il movimento di questo ione coinvolge un organello specifico come il SR, anziché dover trarre conclusioni vaghi sull'effetto degli agonisti sulla SR byindirettamente osservando modifiche citoplasmatici di Ca ²⁺ livelli indotti da tale manipolazione. Lungo la stessa linea, gli agenti che servono per influenzare SR Ca ²⁺ specificamente possono essere utilizzate in modo più efficiente per valutare i loro effetti sia degli organelli cellulari e Ca ²⁺ concentrazioni a livello di cellule-e la salute generale. E 'a causa di questi vantaggi che trasfezione di cellule in coltura con D1SR fornisce un più diretto, così come gratuiti, metodo di misurazione modifiche endoluminali SR Ca ²⁺ livelli. Altrettanto importante è il fatto che questo modello fornisce uno strumento per misurare variazioni di Ca ²⁺ concentrazione all'interno della rete SR in risposta ad agenti farmacologici o fisiologici che sono noti per indurre stress cellulare o risposte funzionali specifici. Ciò sarà possibile generando una curva di calibrazione per indicatore D1SR in qualsiasi cella di interesse. Concentrazione di calcio all'interno del ER / SR può quindi essere calcolato calibrando rapporto D1SR normalizzato (F / F ₀) Contro la curva di calibrazione standard come precedentemente descritto ^{10, 11.}

Una limitazione del protocollo descritto qui è la mancanza di informazioni disponibili sull'uso del costrutto D1SR in altri tipi di cellule. Questo metodo si è finora dimostrato di successo per SMC ratti nei nostri studi più volte ^13-15, anche se il suo utilizzo con altri tipi di cellule è stato finora limitato. Per il successo di questo metodo, è essenziale che siano prese tutte le precauzioni per garantire la progressione sano dei passaggi di coltura cellulare. È quindi importante utilizzare un materiale appropriato che permette la crescita delle cellule su piastre, come le molte sostanze gelatinose a base di proteine ​​disponibili per l'acquisto che hanno dimostrato di promuovere la crescita sufficiente di CML dell'aorta di ratto su lastre microscopia fondo di vetro. La variabilità nel successo di trasfezione con D1SR e successiva delle immagini può essere osservato se le cellule non sono preparati durante i loro passaggi ottimale e ad alto confluenza. Modifiche a phenotype inerente uso prolungato della stessa linea cellulare può provocare trasfezione subottimale e segnale debole essendo ottenuti durante la fase di imaging. Le limitazioni implicati nell'utilizzo di questo metodo sono quindi principalmente quelle rese inevitabile dal lavoro coltura cellulare desiderata, come esperimenti usando il costrutto D1SR devono essere preparati per almeno 36-48 ore prima dell'esecuzione per garantire confluenza di cellule per l'imaging e tempo sufficiente per l'incubazione di crescere cellule con l'adenovirus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.