Introduction
肝臓の正弦波は、生物にとって重要な種々の免疫活動の多数の白血球サブタイプが含まれています。例えば、また、ピット細胞として知られている肝をmarginating（MH）ナチュラルキラー（NK）細胞は、特徴づけされているとして形態学的に大顆粒リンパ球（LGLS）と機能的に血液の確立に対する肝臓の抵抗を可能に自発的な細胞傷害能を有する白血球、など負担腫瘍転移。本明細書に提示された方法の目標は、この重要かつユニークな細胞集団（および免疫コンパートメント）を研究するため、およびこれらの特定の細胞上の各種操作（ 例えば免疫活性化）の影響を解明するために、MHの白血球の選択的ハーベスティングを可能にすることです。
現像原発腫瘍を除去する免疫不全にもかかわらず、癌患者および動物モデルにおける証拠は、免疫系が腫瘍細胞、微小転移、およびthrou残存疾患、循環制御できることを示していますGH細胞性免疫（CMI）。しかし、これらのインビボでの機能の間の証明ヒトおよび動物のin vitro研究で明らかな矛盾があるほとんどの自己腫瘍細胞は、1,2-循環または脾臓白血球による細胞毒性に対して耐性があること。この矛盾は、別個の白血球亜集団、すなわちmarginating、肝臓（正弦波）白血球および活性化NK細胞、すなわちピットセル3のそれらの亜集団のin vivoで存在する、少なくとも部分的に帰することができます。実際、我々の研究室からの未発表データは、F344ラットに同系腫瘍細胞循環および脾臓白血球に耐性が認められた（MADB106）は、MH-NK細胞4によって溶解させたことを示しました。したがって、循環白血球に伝えられるところでは、「NK抵抗性」である腫瘍細胞をMH-NK細胞によって制御されてもよいです。注目すべきは、マウスにおいて、MH-NK活性の増強は、免疫in vivoで次明らかです刺激（ 例えば 、ポリIの使用により：CまたはCpG-C）5。
肝臓特異的NK細胞（MH-NK）は、内皮細胞およびクッパー細胞に付着し、正弦波の内腔の内側に位置しています。 MH-NK細胞はもっぱら生理活性物質7,8としてリソソーム酵素、およびパーフォリン及びグランザイムなどの酸性ホスファターゼを含む球状密顆粒およびロッド芯小胞6、によって特徴付けられます。 NK細胞の循環と比較して、MH-NK細胞は、顆粒及び小胞9-11のより高い数と大きさを示します。 NK細胞の循環と比較して、炎症状態下で、MH-NK細胞は、LFA-1 12のより高い発現を示すことが示されました。この増強された発現は、MH-NK細胞はNK細胞13,14を循環するよりも、特定の腫瘍細胞に対してより細胞傷害性であることにより、機構を構成している可能性があります。 nterestingly、インターロイキン（IL）-2 でビトロインキュベーション後、MH-NK細胞が肥大、およびプロFiのルリンホカイ ン活性化キラー（LAK）細胞15のと一致しているすべてのそれらの顆粒の増加の彼らの数とサイズ、。
アクティブMH白血球は、排他的に粉砕し、組織の生物学的分解に基づいており、標準的な肝白血球の収穫方法、を介して取得することはできません。本明細書中に記載の当社の灌流アプローチは、標準的なアプローチと比較して、2つの大きな利点があります。まず、灌流アプローチは、選択的に他の肝臓の区画から他の白血球による汚染を防止し、MHの白血球を収穫します。第二に、灌流技術は、より良い組織処理は、その損傷細胞に接近またはその形態を変化させるとは異なり、完全性、活性、およびMH白血球の生理的な環境を維持し、組織の損傷に起因する、著しく免疫調節種々の因子の放出を誘発しますアクティビティ。
肝臓は、癌転移aの主要な標的器官でありますさまざまな感染症の16回目。 MH電池は、ユニークな特徴を示すように、これらの病変に対して様々な条件の下で、この特定の集団を研究することが重要です。例えば、それは様々なのBRMによって、その全身の免疫活性化に注意することは価値がある（ 例えば、ポリI：CまたはCpG-C）は、白血球5を循環させるよりもMH-白血球より多くを活性化することが示されています。
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Protocol
倫理文：動物を対象とする手順は、テルアビブ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。
1.ラットプロトコル
- 準備
- ヘパリン化PBS（30単位/ ml）溶液を調製し、リン酸1ml当たり防腐剤フリーのヘパリン30単位を添加することにより、室温（RT）で使用されるように、生理食塩水（PBS）1×緩衝溶液。動物当たり35ミリリットルを計算します。
- 気泡を除去するために蠕動ポンプラインと蝶の針を介して、ヘパリン化PBSを渡します。
- （重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブ）はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、2止血、および歯組織鉗子 - 手術器具を滅菌します。
- MH-白血球の肝臓とコレクションの灌流
- 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。念のため、イソフルランを含む50 mlチューブを配置その胸腔を開くまで、ラットの頭の周り-soakedパッド。
- 呼吸の停止直後に肝臓や心肺複合体を露出させるために腹膜と胸の空洞を開きます。このプロセスを通じて出血は避けてください。
- 具体的には、内臓に損傷を与えることなく、下腹部正中ポイントで切開を開始し、斜めリブに向かって両側に進展、上胸部キャビティレベルにそれらを切断します。
- 約分以内に、注射器に右心室から（250グラムの動物から〜6ミリリットル）できるだけ多くの血液を採取。
- 灌流液の収集を可能にするために、心臓にできるだけ近い止血剤と尾部大静脈をクランプします。
- 門脈を露出させるために、実験者の権利に動物の外腸と場所を引き出します。
- 、できるだけ尾側として、門脈に、蠕動ポンプに接続された25 G IVカテーテルを挿入しかし、脾静脈の吻側。
- 止血剤の尾、下大静脈に、5ミリリットルの注射器に接続された25 Gの翼状針を挿入します。
- 約3ミリリットル/分の速度で蠕動ポンプの電源を入れ、ゆっくりとシリンジに血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを集めます。灌流液の色はターンが赤色（約3〜5 ml）を淡いなるまで続けます。肝臓の色は淡褐色に向かって変化していることに注意してください。
- 蠕動ポンプを停止させることなく、20ミリリットル収穫シリンジで5ミリリットルの収穫シリンジを交換し、灌流の高速（最大4 ml /分）を用いた肝灌流液の少なくとも20ミリリットルを集めます。継続的に収集シリンジに灌流液の流れを監視し、（大静脈壁を崩壊を通して針を詰まらせる可能性がある）強すぎる真空を避けます。
- 肝臓の色は淡褐色になると灌流を終了します。
- 白血球の抽出
- 上清を吸引
- 10 mlのPBS、10分間、400×gで遠心分離器を追加し、上清を吸引除去します。研究の目標に基づいて、あるとして準備を使用するか、または追加の精製（ 例えば 、密度勾配分離）を実施しています。
- 具体的には、層50 ccのポリプロピレン遠心分離管中の密度勾配分離の質量の4ミリリットルを超える灌流液の4ミリリットル。ブレークオフで30分間、754×gで、室温でチューブをスピン。
- 、手動ピペッティングにより密度勾配分離上清界面での単核層を得るPBSで洗浄し、5ミリリットルチューブに挿入します。
2.マウスプロトコル
- 準備
- 調製ヘパリン化PBS（30単位/ ml）リン酸1ml当たり防腐剤フリーのヘパリン30単位を添加することにより、室温（RT）で使用する溶液は、緩衝生理食塩水（PBS）1X solution個。動物当たり20ミリリットルを計算します。
- 気泡を除去するために蠕動ポンプラインと蝶の針を介して、ヘパリン化PBSを渡します。
- （重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブ）はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、2止血、および歯組織鉗子 - 手術器具を滅菌します。
- MH-白血球の肝臓とコレクションの灌流
- 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。念のため、その胸腔を開くまで、マウスの頭の周りイソフルランに浸したパッドを含む15mlチューブを配置します。
- ベッドにマウスの四肢を修正しました。
- 無傷の横隔膜の下側面を維持し、肝臓や呼吸の停止時にすぐに心肺複合体を露出させるために腹膜と胸の空洞を開きます（排水胸腔プールを作成します）。このプロセスを通じて出血は避けてください。
- 具体的には、下で切開を開始腹部正中内臓に損傷を与えることなく、ポイント、および斜めリブに向かって両側に進展、上胸部キャビティレベルにそれらを切断します。
- 門脈を露出させるために、実験者の権利に動物の外腸と場所を撤退。
- 脾静脈への門脈吻側に蠕動ポンプに接続された30グラムの針を挿入します。
- 胸腔からの灌流液の排液および回収を可能にするために、振動板の上に下大静脈をカット。
- 約3ミリリットル/分の速度で蠕動ポンプの電源を入れ、軽く胸腔プールからの血液で汚染された灌流液の最初の3ミリリットルを集めます。
- この灌流液を捨てます。必要に応じて生理食塩水を使用することにより、再びこのような洗浄を繰り返し、その後にのみ肝灌流液の収集を開始。
- 再起動するまで4ミリリットル/分の速度で灌流し、そして使用して胸腔から灌流液の10ミリリットルを集めます注射器に接続されている蝶。
- 肝臓の色は淡褐色になると灌流を終了します。
- 白血球の抽出
- 遠心分離機400×gで10分間の灌流液。
- 上清を吸引除去します。
- 10 mlのPBS、10分間、400×gで遠心分離器を追加し、学習目標に基づいて上清を吸引、あるとして準備を使用するか、または追加の精製（ 例えば 、密度勾配分離）を実施しています。
- 具体的には、層50 ccのポリプロピレン遠心分離管中の密度勾配分離の質量の4ミリリットルを超える灌流液のすべての4ミリリットル。ブレークオフで30分間、754×gで、室温でチューブをスピン。
- 、手動ピペッティングにより密度勾配分離上清界面での単核層を得るPBSで洗浄し、5ミリリットルチューブに挿入します。
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Representative Results
F344ラットでは、肝組織の機械的粉砕以下全体の肝細胞集団の細胞毒性に（強制的な肝臓灌流による肝臓類洞から収集）MH-NK細胞の細胞毒性を比較して、循環白血球の細胞毒性です。すべての細胞調製物は、免疫学的アッセイにおけるルーチンとして、少なくとも3回洗浄し、そして標的細胞株として、我々は、同種異系YAC-1または同系MADB106標的細胞株を使用しました。 図1に示されるように- MH-NK細胞は、（それぞれ〜80％ 及び100％まで）MADB106およびYAC-1標的細胞株に対する深刻な細胞毒性を示したのに対し、図4に示すように 、両方の全体の肝細胞集団（ 図1）と循環白血球（ 図2及び3）は、細胞毒性の深く低いレベルを示さず、そして同系MADB106標的細胞株に対してほとんど殺害。同じrelati機械的に処理された肝臓はまた、洗浄及び密度勾配分離（ 図4）、文献で 典型的であるレベルを受けたときに、細胞毒性の低いレベルが明らかであったVEの。したがって、MH-NK細胞をF344ラットにおける細胞毒性の一意的に高いレベルを示します。 FACS分析を実施し、以下の細胞亜集団の組成の顕著な相違が明らかになった：単球（CD161dim）、NK細胞（CD161明るい）、T細胞（CD3）、B細胞（CD45）を、およびNKT（CD161およびCD3）細胞。成熟プロファイルの主な違い（のCD11b / CD27）は、異なる区画（ 図5）との間に明らかでした。
図1：MH-コンパートメントthrouから収穫全体の肝細胞集団の細胞毒性（YAC-1標的細胞株）にMH-NK細胞の細胞毒性の比較、MH-NK細胞（。肝臓の機械的な処理によって収穫全体の肝細胞集団は、最小レベル（p <0.05）を表示しながら、YAC-1標的細胞株に対する深刻な細胞傷害活性を示した）本明細書に記載の手法をGH。 X軸は、エフェクター対標的細胞の比率を表します。データは、平均±SEMとして提示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 白血球（YAC-1標的細胞株を）循環の細胞毒性にMH-NK細胞の細胞毒性の比較、。循環白血球は細胞毒性の最小レベルを表示しながら、（本明細書に記載のアプローチを介してMH区画から収穫）MH-NK細胞は、YAC-1標的細胞株に対して深遠な細胞毒性を示しました（P <0.05）。 X軸は、エフェクター対標的細胞の比率を表します。データは、平均±SEMとして提示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：。（本明細書に記載されたアプローチを通じてMH-区画から収穫） 白血球（MADB106標的細胞株）MH-NK細胞を循環の細胞毒性にMH-NK細胞の細胞毒性の比較は、同系MADB106に対して深遠な細胞毒性を示しました循環白血球は細胞毒性の最小レベル（p <0.05）を表示しながら、細胞株を標的とします。 X軸は、エフェクター対標的細胞の比率を表します。データは、平均±SEMとして提示されています。 こちらをクリックしてくださいトンOこの図の拡大版を表示します。
図4： 密度勾配分離（YAC-1標的細胞株）を経て洗浄し、濃縮された肝臓全体のリンパ球の細胞毒性にMH-NK細胞の細胞毒性の比較、MH-NK細胞は（MH-から収穫洗浄して）密度勾配分離により濃縮され、機械加工、以下の肝臓全体のリンパ球が（、まで（細胞傷害性の有意に低いレベルを示しながら、本明細書に記載されたアプローチを通してコンパートメント）は、YAC-1標的細胞株に対する深遠な細胞毒性を示しました文献における典型的な30％）（P <0.05）。 X軸は、エフェクター対標的細胞の比率を表します。データは、平均±SEMとして提示されている。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：単球（CD161dim）、NK細胞： 循環単核、MH-単核、および肝臓全体単核細胞から単核細胞サブセットとNK細胞サブセットの比較 FACS分析は、次の細胞亜集団の組成の明確な違いを示しています（CD161明るい）、T細胞（CD3）、B細胞（CD45）、およびNKT（CD161およびCD3）細胞ならびに異なるコンパートメント間の成熟プロファイル（のCD11b / CD27）の違い。 拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。
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Discussion
本明細書に提示肝灌流法は、肝白血球をmarginatingのユニークな人口の選択的ハーベスティングと勉強を可能にします。またピットセル3と呼ばれる肝臓のNK細胞は、肝臓の類洞に存在する独特のNK細胞集団を構成しています。それらは、ラット、マウス17およびヒト18,19に見出されます。単離された末梢NK細胞と比較して、ピット細胞は、LFA-1の12のように、より小さな細胞質顆粒のより高い番号20、および表面抗原の高い発現を有することが示された、YAC-1およびCC531s標的細胞株に対して高い細胞毒性20を示し。さらに、単離された血液NK細胞とは異なり、ピット細胞はNK耐性P815細胞を溶解することができます。ラットと同様のピット細胞、ヒト肝NK細胞は、NK細胞18,19の循環に比べNK感受性K562標的細胞に対して高い細胞毒性を有し、そして溶解するNK耐性標的細胞18に示されました。 Overal肝臓が具体的かつユニークに様々な疾患に関与するようにlは、免疫がこの器官内検討すべき、とMH区画の細胞は実質、クッパー、および星状細胞と区別されるべきです。
はじめに詳述したように、私たちの灌流アプローチは、選択的にMH白血球を採取し、より良いに整合性、活動、およびMH白血球の生理的環境の保存に一般的な機械研削/生物学的分解の手順よりも有利です。実際、NK細胞毒性を評価し、我々のアプローチを通じて収穫MH白血球は、NK細胞の類似の数にもかかわらず、機械的粉砕手順によって採取した白血球よりも著しく高いNK細胞毒性を示しました。
肝灌流法は、動物試験においてのみ動作可能です。しかし、免疫区画の間にマークの違いについては、このアプローチから得られた具体的な洞察は、生物学的に質問することができますアルともっぱら循環白血球に基づいて、観察の臨床的意義。異なる免疫区画における免疫の指標を測定する動物試験は、循環中の各免疫学的指標は、反射またはMH区画内のそのレベルと相関する程度を示唆しているかもしれません。興味深い観察は、灌流MH-NK細胞は唯一の動物21の先験的免疫刺激後の標的細胞に対して有意な細胞傷害活性を示すであろうマウスでこの技術を採用することをいいます。
技術のいくつかの重要な側面を示すべきです。ラットとマウスの両方で、胸腔は、呼吸の完全な停止、次、および最小限の出血で広くすぐに開かれるべきです。ラットでは、心臓の血液の最大量は、灌流の前に引き出されることをお勧めします。それは門脈に血圧を低下させるようにしたマウスでは、それは、心臓から採血にはお勧めしませんし、処理を続行するためにそれを介して針を挿入することが難しくなります。 1は、針が安定した位置にあるために肝臓への門脈の入口まで挿入からの距離が十分であることを確認したい、すべてのことができるように、この針挿入は、脾静脈に隣接するが吻側なされるべきです灌流取得するローブ。針は、その表面に平行ながら門脈に挿入されるべきであるので、血管壁の破裂の危険性が最小限に抑えられます。ラットでは、灌流液の収集のために尾部大静脈に針を挿入している間、灌流液の潜在的な漏れを避けるために、できるだけ狭い入口点を維持することが重要です。マウスでは、不必要な血液の汚染を回避するために、他の血管または肺を破壊することなく、胸腔内部の大静脈を切断早期にすることが重要です。蠕動ポンプを使用することの主な利点は、内との間、灌流速度にわたって安定した制御であります動物。門脈の破裂を避けるために、全体の手順の間に低流量を維持することが重要です。肝灌流液の最初のミリリットルを血液で汚染されているように示されているように、彼らは破棄されるべきです。動物間の標準化を達成するために、MHの灌流液の収集を開始するための基準は暗褐色から（むしろ特定のボリュームのコレクションより）淡褐色への色変化に基づいています。
手順を行うに沿って、いくつかの誤動作が発生することがありますが、ほとんどは可逆的です。 PBSは、肝臓に輸血され、それを通して針が抜け出した場合、蠕動ポンプを停止することをお勧めします、（より良い可視性を実現するために）消化管の周囲を浸し、やや頭側の位置に針を再挿入ポンプを再起動してください。
本明細書中に記載の肝灌流技術はかなり単純なプロセスでMHの白血球集団の選択的ハーベスティングを可能にします。与えられましたときに実行可能な他の区画からの白血球がMH人口のプロファイルを反映していない可能性として、この集団は、他の免疫区画からの白血球に比べて顕著な特徴を表示し、生物への生物学的および臨床的意義を有することができることは、我々は、このメソッドを使用することをお勧めします。この技術はヒトでなんとかではないとして加えて、我々はさらに、特に肝臓関連のプロセスと疾患を研究MH特性と相関する特定の循環バイオマーカーを、明確にするために動物でそれを採用する示唆しています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G.
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
