Abstract
多能性幹細胞からの心筋細胞の集団を生成するためのプロトコルが開発されてきたが、これらは一般に、混合表現型の細胞をもたらします。特定の筋細胞のサブタイプを含む研究を追求することに興味の研究者は、より多くの有向分化アプローチが必要。 Grem2、 インビボでの心房室形成するために必要な分泌BMPアンタゴニストによるマウス胚性幹（ES）細胞を処理することによって、心房表現型を有する心臓細胞の多数を生成することができます。操作MYH6-のDsRed-のNuc多能性幹細胞株の使用は、識別、選択、および心筋細胞の精製を可能にします。このプロトコルでは胚様体は、ハンギングドロップ法を用いて、MYH6-たDsRed-のNuc細胞から生成され、分化4日目（D4）まで懸濁状態に維持しました。 D4セルでGrem2で処理され、ゼラチンコーティングしたプレート上にプレーティング。 D8-D10大型契約エリア間の培養で観察し、拡大を続けるとメートルされていますD14を通してature。分子は、組織学的およびelectrophysiogical分析はGrem2処理細胞における細胞は、心房心筋細胞の生物学および様々な薬理学的薬剤に対するそれらの応答を研究するためのin vitroモデルを提供心房のような特徴を獲得示しています。
Introduction
多能性幹細胞は、特にヒト1-5に、基礎研究および前臨床研究のための組織にアクセスすることは困難での宿主から細胞を生成し、研究するための強力なツールです。発達シグナル伝達経路の適切な調節は、所望の表現型の運命への多能性幹細胞の分化を指示することができます。多くのプロトコルは、多能性幹細胞から心筋6-14（CMS）を生成するために開発されています。これらのプロトコルは、一般的にTFGβスーパーファミリー（アクチビン、BMP、およびTGFβ）およびWnt外因性の成長因子および/ または小分子10,12-15の時限添加による経路の調節を伴います。これらのプロトコルは、一般のCMとなる細胞の割合を増加させるのに有効であるが、心房、心室、及び結節/伝導系の系統を示す細胞の混合集団を生成し、特異性を欠きます。特定の心臓を研究するために、より導か分化アプロサブタイプACHが必要です。
Gremlin2（ダンと短いためケルベロスまたはPRDCに関連Grem2、とも呼ばれるタンパク質）は、ゼブラフィッシュ16で心臓発生時に適切な心臓分化および心房室形成するために必要な分泌BMPアンタゴニストです。ただ、中胚葉マーカーT-ブラキュリと1のようなケルベロスのピーク発現させた後、分化4日目にGrem2との差別化胚性幹細胞を処理する、のCMの歩留まりを向上させ、主に心房系統14の細胞のプールを生成します。
組換えGrem2は分化細胞を治療するために使用され、標準的なタンパク質生産技術17を用いて作製することができるか、または商業的に購入することができます。これは、水溶液中で高度に可溶性であり、所望の時点で培養物に外因的に添加されてもよいです。
分化マーカーの代表的な発現を定量するためにRT-定量PCRを使用して追跡することができます心臓血管前駆細胞、心臓前駆体、および確定のCM。免疫蛍光法は、心臓の細胞型の空間的な分布を特定し、可視化するために使用することができます。
CMを同定および単離するためのレポーター系を使用する場合、純粋な集団を必要とするアプリケーションは、より容易に行われます。この目的のために、我々はαMHC-DsRedNucはマウスCGR8 ES細胞株14内に構築し導入しています。 CGR8細胞が拡大および分化アッセイ18を容易に 、フィーダー細胞なしで成長し、多能性のままです。 ES細胞株は、遺伝子プロモーター（MHCまたはMYH6α）心臓特異的アルファミオシン重鎖の下で核局在化シグナルとDsRedの蛍光タンパク質をコードする配列が含まれています。これらの細胞を用いて、CMは容易に特定し、定量化、細胞選別、電気生理学、薬物スクリーニング、および心房分化のメカニズムを研究するため、単離することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
細胞培養培地、ソリューション、および試薬の調製。
- （孔径0.2μm）445 mlのグラスゴー最小必須培地（GMEM）を50mlの熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を混合し、滅菌濾過することによって、マウス胚性幹細胞を500ml（MESC）培地を調製5mlの100Xは、L-濃縮しました1mlあたり1×10 7単位、および1.43μlのβ-メルカプトエタノール（最終濃度は、50μMである）のグルタミンの置換、5μlの組換えマウス白血病抑制因子（LIF）。使用する準備ができるまで4℃で保存してください。
- 391 mlのイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、FBS不活化100 mlの熱を混合し、滅菌濾過することによって胚様体（EB）分化培地を500mlを調製5mlの100Xを5mlの100Xは非必須アミノ酸を濃縮し、L-グルタミンの置換を濃縮しました（NEAA）、および2.86μlのβ-メルカプトエタノール（最終濃度は100μMです）。使用する直前まで4˚Cで保存。
- 0.2％のワットを準備濾過し、蒸留H 2 O 500mlで1gのブタ皮膚ゼラチン粉末を混合してゼラチン/ v溶液オートクレーブ滅菌します。ゼラチンは、室温で水に完全に可溶性ではないかもしれないことに注意してください。ゼラチンをオートクレーブした後に完全に溶解する必要があります。使用する準備ができるまで室温で保管してください。
- 0.5μg/μlのストック溶液を作製するために、0.1％BSAを補充した100μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で凍結乾燥Grem250μgのペレットを溶解することによりGrem2組換えタンパク質のアリコートを準備します。使用する直前までで-80˚C 5滅菌1.5ミリリットル遠心チューブとストアに小分けし、このストック溶液20μlを。
- 10Xストックとして公開されたプロトコルまたは購入に応じてPBSを用意し、希釈19を作業1Xを作るために、ろ過し、蒸留H 2 Oで1:10に希釈します。使用前にオートクレーブによりPBSを滅菌します。使用する準備ができるまで室温で保管してください。いくつかのステップでは、カルシウムのないDPBS 2+およびMg 2+使用されています。これはPUです1Xソリューションとしてrchased。注文情報は、試薬の表に含まれています。
ゼラチンの調製は、10cmの組織培養皿をコーティングしました
- 滅菌組織培養フード内でコーティングするための各10cmの組織培養皿に0.2％ゼラチン溶液5mlを加えます。少なくとも30分間、または4日までの37℃のインキュベーターに皿を置きます。
ゼラチンの調製6ウェル組織培養プレートをコーティング
- 滅菌組織培養フード内で6ウェル組織培養プレートの各ウェルに0.2％ゼラチンを1ml加えます。少なくとも30分間、または4日間まで37℃のインキュベーターに入れプレート。
4.胚性幹細胞培養
- 解凍されたmESC
- 滅菌組織培養フード内で室温まで温めることによりMESCメディアを準備します。ゼラチン被覆10cmディッシュに10ミリリットルRTメディアを追加します。
- から約1×10 6個の細胞を含むたmESCの1バイアルを削除凍結保存。トングとクリオバイアル保持、37℃の水浴中で場所。細胞懸濁液を解凍しただけの小さな氷の結晶がバイアルの中心部に残るまで、慎重に渦巻きます。使い捨てリントフリーワイプ、70％エタノールで消毒してバイアルをオフに乾かします。
- 滅菌組織培養フードで凍結バイアルからP1000チップを使用して解凍した細胞を除去し、4.1.1で製造した10cmディッシュ）に移します。
- 5％CO 2で37℃の加湿細胞培養インキュベーターに10cmの皿を置き、均等に左右に、その後、緩やかにバックアップする板の前面を移動することによって、細胞を配布します。細胞は、O / Nまたは少なくとも6時間をプレートに取り付けることができるようにします。
- まず最初に、明視野顕微鏡を使用して取り付けるための翌朝チェック細胞。いくつかの細胞残屑および死細胞を培地中で観察されます。これは正常です。皿から吸引メディアとは、10ミリリットルの新鮮なMESCメディアと交換してください。
- 分化を防止するために、毎日細胞上のメディアを変更し続けています。
- 継代細胞ときに百分の60から70コンフルエント。メディアを吸引およびMgCl 2およびCaCl 2をせずに5ミリリットル滅菌1X DPBSですすぐことにより継代のために細胞を準備します。 2ミリリットル0.05％トリプシン-EDTA溶液を追加します。 5分間37℃のインキュベーター内に置きます。
- 細胞をインキュベートしている間に、ゼラチン溶液を吸引し、RT MESC培地を10mlを添加することによって、新しい10cmディッシュを準備します。 5分後、剥離のための細胞をチェックしてください。細胞が付着したままならば、完全に切り離されるまでの時間で2分間37℃でインキュベートし続けています。
- MESC培地を3mlを添加することによりトリプシン-EDTAを急冷。ペレットに5分間200×gで15ミリリットルの遠心管とスピンに細胞懸濁液を転送します。吸引ペレットからメディアと10ミリリットルMESC培地に再懸濁します。
- 目的のスプリット比に応じて、ステップ4.2.2で調製した各ディッシュに細胞懸濁液0.5〜1.0 mlを加え）。インキュベーターに皿を置き、均等に優しく、再び前面に左右に移動させることによって、細胞を配布します。すべてOW細胞は、O / Nまたは少なくとも12時間付着させます。
注：1：10の分割比 - 1：20が最もMESCラインのための共通です。この比率は、新しいディッシュに使用されるライン、継代数、および所望の合流点に依存して変化し得ます。新たに調製したゼラチン被覆10cmディッシュで9ミリリットルMESCメディアとプレートに細胞懸濁液の1時10分割比転送のための1ミリリットル。
胚様体の5準備
注：遠心分離以外のすべてのステップは、無菌の組織培養フード内で行っています。
- EBメディア中の細胞懸濁液の調製
- 70％の集密度（通常24〜48時間後に通過）されると、EB形成のための細胞を使用しています。 4.2.3） - 取り外しとセクション4.2.1）に応じてペレット化することにより、EB形成のための細胞を準備します。
注：（。 例えば 、非常に少ない細胞死、無汚染、適切な形態）これは、少なくとも1時間解凍後継代細胞に最善であると健康をチェックし、力強い成長（ 電子。グラム。すべての24〜48時間に発生する、集団倍加）のEBを作るために使用する前に。 - 5ミリリットルEB培地でペレットを再懸濁します。血球計又は自動化細胞カウンターを用いて細胞を数えます。
- 25細胞/μL（または2.5×10 3細胞/ ml）の最終濃度にするEB培地の必要量に細胞懸濁液を希釈します。ペトリ皿の各蓋は約60のEBを保持し、細胞懸濁液の約1.3ミリリットルを必要とすることに注意してください。このステップでは、EBの所望の数を生成するために、細胞懸濁液の十分な量を調製します。 240 EBを実験に必要とされる場合、例えば、2.5×10 3細胞/ mlに5.2 mlで調製します。
注：EB形成のために使用されていないたmESCはMESC媒体に再懸濁させ、セクション4.2で説明したように、メッキ、スピンダウンして、将来の実験のために使用することができます。
- 70％の集密度（通常24〜48時間後に通過）されると、EB形成のための細胞を使用しています。 4.2.3） - 取り外しとセクション4.2.1）に応じてペレット化することにより、EB形成のための細胞を準備します。
- 胚様体の作成
- Eの底に1X PBSの2ミリリットルを追加することにより、滴形成を掛けるために滅菌10センチメートルに細菌ペトリ皿を準備ACH。
- 滅菌溶液流域にステップ5.1）からEB懸濁液を転送します。
- 準備されたペトリ皿から蓋を外し、慎重に内面にEB懸濁液の60、20μlの滴を付着させます。 6先端を取り付けたマルチチャンネルピペットを使用して効率的にこれを達成します。各20μlの低下は現在500個のセルを有します。
- ゆっくり懸滴を落とさないように注意しながら、細菌ペトリ皿の下半分に蓋を交換してください。 2日後、37˚℃で細胞培養インキュベーターに皿を置き、細胞は5.3で説明したように）ダウン洗浄する準備が整いました。
- 胚様体のウォッシュダウン
注：すべてのウォッシュダウンのステップは、無菌組織培養フード内で行われています。- 2日後、EBのダウン洗浄のための準備ができていると6センチメートル細菌ペトリ皿に移します。 RTへのペトリ皿当たりEBメディアのプレ暖かい3ミリリットル。各6センチメートル細菌シャーレを効果的に懸滴の価値は2蓋を保持することができます。
注：非コートシャーレFを使用してくださいまたは、このステップ（材料表を参照してください）。細胞接着を促進し、組織培養皿または任意の他の表面を使用しないでください。 EBは、第6章で説明したように準備をメッキするまでメディアに懸濁ままにしてください。 - インキュベーターから10cmペトリ皿を取り外し、無菌組織培養フード内に配置します。慎重のEBでふたを取り外し、45度の角度で傾けます。
- RT EB培地の3ミリリットルを含む5ミリリットル血清学的ピペットを使用して、静かに蓋の下部にあるプールにEBSを洗います。慎重に表面に付着し、必要に応じて再すすぎされたEB用の蓋を検査します。
- 6cmペトリ皿にすべてのEBの転送を洗浄した後。
- 繰り返しは、すべてのEBのため）-5.3.4）5.3.2を繰り返します。各6センチメートルシャーレは、2つの10センチ蓋からのEBを含むべきです。 2日以上のために戻って37℃のインキュベーターにすべての料理を置きます。
注：あまりに懸濁液に接近しているEBを一緒に付着し、大きな凝集体を形成してもよいです。これは、負の心臓分化効率に影響を与えることができますだけでなく、大幅に利用可能なEBの数を減らします。凝集を防止するために、EBを、その後側が左右に、毎日チェックし、静かに前後に移動することにより、分離されるべきです。初期の分化段階における細菌の皿の使用は皿にEBの付着を防止し、EBを懸濁液中で成長させることが必要です。
- 2日後、EBのダウン洗浄のための準備ができていると6センチメートル細菌ペトリ皿に移します。 RTへのペトリ皿当たりEBメディアのプレ暖かい3ミリリットル。各6センチメートル細菌シャーレを効果的に懸滴の価値は2蓋を保持することができます。
Grem2とEBの6めっきと治療
- 1-5 / mlの最終希釈のためGrem2 RT EB培地に株式の十分な量（0.5μgの/μl）を追加することにより、Grem2の処理媒体を準備します。
注：EBの治療のための有効濃度は、細胞株およびGrem2の現在のロットの比活性に依存して変化します。投与量を使用する前には、最大の有効性を見つけるために滴定されることをお勧めします。 CGR8 MESCラインのために我々は日常Grem2の3-5 / mlのを使用します。心房筋細胞の生成のためのGrem2の有効濃度は、間急速に収縮する細胞を生成します各ウェル全体に普及している日7-8。請負表現型が処理した培養物で観察されていない場合には、Grem2が示された範囲内で滴定することが線量ことをお勧めします。 - 各ウェルからのゼラチンコーティング溶液を吸引し、RT Grem2処理媒体を2mlを添加することにより、6ウェル組織培養プレートを準備します。インキュベーターからのEBを削除し、無菌組織培養フード内に配置します。
- 各ウェルに6センチメートルペトリ皿から100μlの転送30のEBに設定P1000を使用しました。場所のEBをインキュベーターへと均等には、静かに戻し前面に左右にプレートを移動させることにより分散させます。
- EBをした後、コーティングしたウェルをゼラチン10日後10日目まで2日毎Grem2メディアを交換し、Grem2処理を中止し、健康な細胞を維持するために、2日ごとに新鮮なEBのメディアを追加するために取り付けられています。
注：接続した後、EBを塗装板の表面に沿って平らにします。
- EBをした後、コーティングしたウェルをゼラチン10日後10日目まで2日毎Grem2メディアを交換し、Grem2処理を中止し、健康な細胞を維持するために、2日ごとに新鮮なEBのメディアを追加するために取り付けられています。
RT-qPCRのANALY 7.細胞解離妹
- トリプシンEDTAで細胞解離
- 各ウェルから培地を吸引し、そして滅菌DPBSマイナスのCa 2+およびMg 2+のウェルあたり1ミリリットルで二回すすいでください。
- 細胞は収集されるから、各ウェルに0.5ミリリットル、0.25％滅菌トリプシン-EDTA溶液を追加します。
- 5分間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
- 解離のための5分のチェックセルの後。細胞がまだ残っている場合は軽く緩めウェルタップの底部に取り付けられています。タッピングは、細胞を緩めていない場合は、バックインキュベーターに置き、細胞が完全に分離されるまで、2分ごとに監視します。
- 各ウェルに0.5 mlのEB培地を添加することによりトリプシン-EDTA溶液を中和します。
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液の全体の1ミリリットルを転送します。
- 300×gで5分間、卓上遠心機でスピンすることにより細胞をペレット化。
- 吸引ペレットからメディアや溶解のための準備ができるまで-70℃ですぐに溶解またはストアペレットに移動します。長期ターこれはRNAの分解につながる可能性としてペレットのm個のストレージは推奨されません。
- 細胞溶解および分子生物学的解析
- この時点で、細胞は、市販のカラム抽出キットを用いて、または（材料の表を参照）の製造業者により供給されたプロトコールに従ってRNA抽出試薬を使用して、RNA単離の準備ができています。分離された後、転写されたRNAを逆にし、標準的な技術20、21を用いてRT-qPCR分析のためのcDNAを使用しています。
注：RT-qPCRのために、このラボで使用されるプライマーは、表1心房アイデンティティに記載されていますが、レコードの活動電位持続時間（セクション8を参照）に、心房と心室の遺伝子の発現および電気生理学を見てRT-qPCRのの組み合わせを使用して確認されました。遺伝子の選択は、信頼性の心房と心室のマーカーの例として、このプロトコルに含まれています。多能性幹細胞の分化の状況において、心房と心室の遺伝子発現についてのさらなる情報は、参照14で見られます。</李>
- この時点で、細胞は、市販のカラム抽出キットを用いて、または（材料の表を参照）の製造業者により供給されたプロトコールに従ってRNA抽出試薬を使用して、RNA単離の準備ができています。分離された後、転写されたRNAを逆にし、標準的な技術20、21を用いてRT-qPCR分析のためのcDNAを使用しています。
8.電気生理学的解析
- コラゲナーゼによる細胞解離
- 各ウェルの滅菌PBSウェルあたり1ミリリットルで二回すすぎから培地を吸引。
- 各ウェルに1mg / mlのコラゲナーゼ溶液の0.5ミリリットルを追加します。
- 10分間、37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
- 解離のための5分のチェックセルの後。細胞がまだ残っている場合は軽く緩め互いにまたはウェルタップの底部に取り付けられています。さらに、P1000で穏やかに粉砕することにより細胞を解離します。
注：単一細胞懸濁液が達成されるまで細胞が磨砕されるべきパッチクランプ記録を容易にするために。 - 各ウェルに0.5ミリリットルEB培地を加え、ピペッティングにより混合します。
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液の全体の1ミリリットルを転送します。
- 300×gで5分間、卓上遠心機でスピンすることにより細胞をペレット化。
- 細胞ペレットから培地を吸引。
- 500での再懸濁細胞単一細胞懸濁液に粉砕するようにしてくださいされ、10％FBSを含むPBSをμlです。
- 電気生理学的キャラクタリゼーション。
注：多くの優れたプロトコルは、細胞膜電位を測定するために、単一細胞パッチクランプを使用して、この雑誌に掲載されています。単一細胞パッチは、初心者のリーダーをクランプ実行する方法の詳細については、これらのプロトコル21-24と呼ばれます。以下は、経験豊富な電気生理学者が準備し、MESCは、サブタイプの特徴付けのためのCMを導出処理するのに役立ちます。このプロトコルのための具体的な情報が含まれています。- 10mMのHEPES緩衝液、5 mMのをMgATP、2mMのEGTA、110mMのグルタミン酸カリウム、10mMのKClと10mMのNaClを次から成る細胞内記録液を準備します。 NaOHを用いて7.2のpHにソリューションを調整します。
- 2 mMのHEPES、10 mMグルコース、1mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2を、5.4 mMのKClと137：以下で構成される細胞外記録（浴）溶液を調製しますNaCl。 NaOHを用いて7.4のpHにソリューションを調整します。
- フィラメントと標準ホウケイ酸ガラスを用いた記録液を充填したときに2-5MΩの抵抗を測定したガラスピペットを準備します。
- 転送P200を用いて、細胞外記録溶液を含有する記録チャンバーに懸濁した細胞を100μl。
注：細胞は、懸濁液中でパッチを適用してもよいし、取り扱いを容易にし、薬物治療および/または灌流アッセイのために使用する）8.2.5に概説されるように、ゼラチンコーティングしたカバースリップ上に播種してもよいです。 - 6ウェルプレートの各ウェルに直径10mmのガラスカバースリップを配置し、このプロトコルの）セクション3.1に記載されているようにゼラチン溶液で被覆することにより、ゼラチンでコーティングされたガラスカバースリップを準備します。
- 少なくとも30分間吸引ゼラチン溶液の後少なくとも2時間、または細胞が付着するまでインキュベーターに全体の6ウェルプレートをカバースリップし、配置するために直接懸濁された細胞の100μlを添加します。細胞が付着した後、R細胞外記録溶液でチャンバーを記録中emoveカバースリップと場所。
注：αMHC-DsRedの蛍光心臓レポーターMESCラインを使用している場合、CMはその赤色蛍光核によって同定することができます。心臓レポーターラインを使用していない場合は、自発的に収縮する細胞を観察することができ、測定のために単離しました。 CMに由来する多能性幹細胞は、完全に形成された成人の心筋細胞の特徴的な長方形の形態を欠いている、通常より小さく、より丸みを帯びています。
- 少なくとも30分間吸引ゼラチン溶液の後少なくとも2時間、または細胞が付着するまでインキュベーターに全体の6ウェルプレートをカバースリップし、配置するために直接懸濁された細胞の100μlを添加します。細胞が付着した後、R細胞外記録溶液でチャンバーを記録中emoveカバースリップと場所。
- 37℃ですべての記録を行います。 2-5MΩ抵抗のホウケイ酸ガラスピペットで、電流クランプモードで全細胞クランプを使用して単一細胞にパッチを適用します。全細胞のアクセスを取得する前にギガオームのシールを達成するために穏やかな負圧を使用してください。膜を破裂させ、膜電位を記録する前に、細胞全体のアクセスを獲得するための迅速な負圧を適用します。
- 現在の注射を脱分極4ミリ秒を使用して活動電位を呼び起こします。
注意：PSC由来のCMの再現性活動電位を誘発するのに必要な電流の量が変化してもよいです。最適な閾値電流を見つけるために、比較的低い電流で開始し、再現性の活動電位が得られるまで段階的に電流振幅を誘発増加。
注：Grem2誘発性心房筋細胞のための活動電位持続時間は20-40ミリ秒の範囲で通常であり、プラトー期（ 図6B）を欠きます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
分化前に、多能性幹細胞は、コンパクトかつ自発的分化の自由であるべきです。 図1（a）に示す細胞が単数化およびプロトコルセクション5.1で説明したように液滴を掛けるために使用される準備ができています。 図1（b）に示す細胞が自然に分化していると懸滴の調製のために使用すべきではありません。
パネルは、図2に含ま分化2日目品質のEBでのショー正常に形成されたEBは、一般的に、図2に示すように最善内に均等に間隔をあけ、よく丸い吊り下がる形成している。分化2日目では、EBを球状の手配などの肉眼で見えるはずですハンギングドロップ（ 図2）の先端に幹細胞を分化させます。プロトコルセクション5.3で説明するように、これらのEBは、ウォッシュダウンの準備ができています。
日2-4中、懸濁液中の洗浄ダウンEBは、サイズに成長し続けなければなりません。 4日目に、よく形成されたEBは、サイズと形状（ 図3）に浮動自由かつ均質であるべきです。 図3に示したEBは、プロトコルセクションの6.1から6.3に記載されているようにプレートを事前にコーティングし、Grem2で処理するために転送される準備ができています。
メッキされると、細胞が組織培養プレートの表面にEBからの移行として、EBは平らにする必要があります。分化8日（左パネル）および10（右パネル）で正しく接続EBの例を図4に示されています。細胞は、それらが付着したまま確認するために、下記のように心臓分化を確認するために毎日監視し続ける必要があります。
CMの存在を示す、細胞収縮、日早くとして観察することができます6日9一般的のように後半には、収縮する細胞は、分化の8日目に存在することになります。 Grem2で比較的速い契約率でウェルに大きなパッチを扱わながら、各ウェルの収縮する細胞の数は、（ビデオS1）小さな、ゆっくりと収縮するパッチが観察された非処理対照ウェルに分化14日目を通して増加し続けなければならない（一般的ですビデオS2）。時折、心臓分化は起こりません。このような場合にはGrem2治療、タンパク質の活性、および分化に先立って、細胞の状態のタイミングは、このプロトコル（説明を参照）で説明したように、これらの各条件が最適化されていることを確認するために再評価されるべきです。
典型的なGrem2処理培養および未処理の対照の図5の結果を示します。プロトコルセクションの7.1から7.2に記載されているように収集し、溶解した細胞における遺伝子発現のRT-qPCR分析は、典型的には、高レフを明かしますGrem2で処理した培養物（ 図5A）で心臓の構造および調節遺伝子のELS。 αMHC-のDsRed-のNuc細胞株が使用されている場合、CMSの増加した収率はGrem2処理したウェル中のDsRed標識核の高い数（ 図5B、下段パネル）のように視覚的に観察することができます。
CMの数の増加を生成することに加えて、Grem2処理は、表現型のように、心房に向かって分化を付勢します。心房の表現型は、通常、2つの方法で確認されています。まず、プロトコルセクションの7.1から7.2に記載されているように収集された細胞のRT-qPCR分析は、心室遺伝子が（ 図6A）ダウンレギュレートされている間、心房のCMの特徴的な遺伝子がアップレギュレートされていることを明らかにしている必要があります。第二に、（プロトコルセクションの8.1から8.2に記載されているように）携帯活動電位持続時間のパッチクランプ測定は、短い、心房様作用電位がGrem2 treateの間で優勢ことが明らかになりました D細胞（ 図6B）。
図1.代表的マウス胚性幹細胞（たmESC）。多能性マウス胚性幹細胞の前特性に大きな核、コンパクトなコロニー形成形態（A、黒矢印）、および白の相境界線（A、オレンジの矢印）とEB形成します。マウスES細胞の自発的分化が大きく、単一コロニー（B、黒矢印）から分離された細胞コロニーの周りの相境界の損失（B、オレンジの矢印）で示されています。倒立位相差顕微鏡を用いて撮影した画像。スケールバーは50μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
分化の2日目図2.胚様体（EB）。シャーレのふたから吊り下げハンギングドロップ（左、スケールバーは2センチ）サイズで等間隔と均質です。懸滴中のEBを各液滴の中心にコンパクトな球体として観察された（右、スケールバーは1mmである）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
分化の4日目に、懸濁液中の図3. EBは。理想的なEBは、サイズが均一で、最小限の互いへの付着またはプレートの底で形作るべきです。画像は、無菌条件下で解剖スコープを使用して捕捉しました。スケールバーは100μmで表します。ロード/ 53919 / 53919fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
分化の図4.典型的なEB日 8時。メッキのEBをメッキした後の形態 （左）と10（右）。 EBをゼラチン化プレートに取り付けるように、彼らは平らにし、細胞のますますコンフルエントな単層に囲まれたとして密なセンターを表示されます。細胞を収縮の小さなポケットは、一般的にEBの中央付近に6-8分化日の周りに観察されます。これらのポケットは、周囲の単層中の細胞を収縮の大きいシートを形成するために分化プロトコルを通じて拡大を続けています。画像は、倒立位相差顕微鏡を用いて捕獲しました。スケールバーは200μmで表す。 拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。
Grem2処理および非処理対照ウェル中の図5.心臓分化。心臓マーカーのqPCR分析は、早ければ6日目と分化（A）の10日目まで継続としてGrem2で処理したEBにおける心臓遺伝子発現の増加を示しています。工学αMHC-のDsRed-のNuc細胞株はGrem2対非処理コントロール（B、上）（B、下）で処理した培養物中のDsRed標識のCMの大きなプールを示しています。数値は14から許可を得て適応します。エラーバーは、少なくとも3回の反復実験からSEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
6 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 53919 / 53919fig6.jpg "/>
心房のような心臓表現型の図6.キャラクタリゼーション。qPCR分析は、心房の遺伝子とGrem2処理サンプル（A）中の心室のCMに関連する遺伝子のダウンレギュレーションの発現の増加を示しています。 Grem2による治療は心房筋細胞（B）の短い活動電位持続時間特性を有する細胞集団を生成しながら、対照培養物は、心房と心室の細胞の活動電位持続時間特性とのCMを生成します。サンプルは、スチューデントのt検定を用いて比較しました。 *、P <0.05。 ***はp <0.001 数値は14から許可を得て適応します。エラーバーは、少なくとも3回の反復実験からSEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ビデオS2。 Grem2-処理したウェル（右クリックしてダウンロード） 。 Grem2処理した細胞で観察された典型的な結果。素早く収縮する細胞の大規模なパッチはメッキEBを通して観察されます。ビデオは、分化10日目に採取しました。
| 遺伝子 | | リバースプライマー（5 'から3'） | |
| アクチン | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| GATA4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| MYH6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| Tnnt2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
定量PCRプライマー配列の表1のリスト。プライマー配列は、遺伝子名のアルファベット順にリストされています。配列は、 図5および図6に分析した全ての遺伝子について、5 'から3'が設けられています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、日常的に心房系統の特徴であるのCMの割合が高いと文化を生成します。任意の分化プロトコルと同様に、分化に先立ったmESCの品質は、特に注意を与えられるべきです。たmESCは、日常的に適切な形態（ 図1A）を監視する必要があります。前EBの形成に発生した自発的な分化が厳しく心臓の効率を制限すると（ 図1B）を継代する前に削除する必要があります。 EBサイズも心臓に影響を与えます。 200とEBあたり1,000〜出発細胞数は、テストされているとEBあたり500個の細胞は、日常のCMの最高の数字を生成します。前日EB形成に継代された細胞はまた、より効率的に差別化する傾向があります。
「ハンギングドロップ」法は、このプロトコル25にEBSを生成するために使用されます。心臓分化ヘクタールのために使用したEBを作製するための他の方法26-29を報告されまし。 「ハンギングドロップ」の方法は、簡単で安価、容易に共通の細胞培養装置・材料と任意の実験室で採用され、細胞培養の経験があれば誰でもすることにより行うことができます。これは、簡単に操作移し、メッキ、またはRNAは研究者のニーズに応じて分析のために収集することができるEBSを生成する、また多目的あります。これは、必要に応じてEBの小規模または大規模な番号を生成し、また、スケーラブルです。
プロトコルは、分化の4日目で、ゼラチンコーティングしたプレート上にEBのメッキを指示します。このステップでは、組織培養に共通するより典型的な単層形式にしたEBを分化に変換します。場合によっては、むしろめっきよりも懸濁液中のEBを残して、より便利で、または必要であり得ます。サスペンションのEBは、下流の応用に好まれている場合、細胞は、分化過程を通して懸濁液中に残されてもよい代わりのウィットを治療する場合、4日目でメッキされています時間Grem2は、EBは1.5ミリリットルの遠心分離管に入れ、重力によって沈降させます。培地を注意深くEBの吸引を防止するために後ろに少量を残し、P1000で除去し、1.5mlのGrem2培地をチューブに添加します。この懸濁液を6センチメートルペトリ皿に移し、37℃で戻されます。培地は2日毎に上記に示したマイクロ遠心チューブ法を用いて変更されます。
分化の4日目は、一般的に、主要な発生事象に関連する遺伝子の発現解析に基づいGrem2での細胞の処理のために選択しました。 1のような原腸形成のマーカー遺伝子Tブラキュリとサーベラスのピーク発現後、そのようなNkx2-5などの心臓前駆細胞マーカーの発現の開始時Grem2の添加は、心臓と心房仕様の両方にとって重要です。これらの遺伝子の発現ピークは、細胞株の間で若干異なる場合がありますので、それをdの間に、これらの遺伝子の発現をモニターすることをお勧めしますGrem2の添加のための最適なタイミングを決定するifferentiation。このプロトコルのためにテストした株のうち、ほとんどの日4及び分化の5の間Grem2での治療に反応しました。
任意の組換えタンパク質と同様に、Grem2の活性はロット毎に異なります。したがって、Grem2、同一ロットからの一貫性を維持するために、実験の各セットのために使用されることをお勧めします。新しいロットを購入したときに、有効1-5 / mlの範囲で投与量を滴定することによって評価することができます。このプロトコルは、分析と文化のために十分な数の心房系統からのCMをもたらします。このプロトコルを使用して生成される細胞は、フローサイトメトリーを介して、生細胞アッセイで使用するための電気生理学、RT-qPCRに、または再培養を分析することができます。培養後αMHC-のDsRed-のNucレポーターラインをのCMの同定および単離を容易にするために開発され、日常的に我々の研究室で使用されます。
このプロトコルは、健康的なCEを維持するために血清を使用しています分化プロセスを通してLL文化。このプロトコルは、日常堅牢生産しているが、心房のような心臓分化は、血清の使用は、分化過程に未定義の要素を紹介します。これは、より多くの定義されたメディアが必要とされる場合にはプロトコルの有用性を制限することができます。以上の定義されたメディアの準備が必要な場合、血清ノックアウト血清代替30に置き換えてもよいです。定義された培地に切り替えるときには、すでにこのセクションで説明するようにGrem2処理のタイミングと濃度が再最適化されることをお勧めします。
RT-qPCRのは、心房と心室筋細胞に特異的な遺伝子の発現を定量するために使用されます。心室の遺伝子の発現に影響する調節下かながらGrem2治療は、心房特異的遺伝子の誘導をもたらします。この結果は、Grem2誘発性のCMのために典型的です。心房の同一性を評価するための遺伝子の推奨セットは、このプロトコルに含まれています。遺伝子の拡張セットsおよびそれらの関連性についての議論は、このプロトコル14,16によって参照される作品で見つけることができます。フィールドが進化し続け、心臓分化の我々の理解が向上したように、心房と心室のアイデンティティマーカーのこのリストを評価し、必要に応じて改訂されることをお勧めします。
CMの均質な文化を生成することは、特定の心臓のサブタイプに影響を与え、脊椎動物の心の中に室仕様のメカニズムを理解することに焦点を当て、基礎研究のためのモデルシステムを提供することが知られている疾患に焦点を当てた臨床研究の取り組みを促進します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品は、NIHでサポートされていた「循環器病のメカニズムにプログラム：調査研修」HL083958とHL100398（AKH）と2T32HL007411-33を付与（JB）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
