Abstract
对于质谱（MS）的环境电离源已在过去的十年中很大兴趣的主题。基质辅助激光解吸电喷雾电离（MALDESI）是这样的方法，一个例子，其中基质辅助激光解吸/电离（MALDI）（ 例如，解吸的脉冲性质）和电喷雾电离（ESI）（ 例如，软电离的特征）组合。之一的MALDESI的主要优点是其固有的多功能性。在MALDESI实验中，紫外线（UV）或红外线（IR）激光可用于共振激发内源或外源矩阵。矩阵的选择不是分析物依赖性的，并且仅取决于用于激发的激光波长。在IR-MALDESI实验中，冰的薄层沉积在样品表面作为能量吸收基质上。对IR-MALDESI源几何已经使用的试验设计（DOE），用于液体样品的分析统计设计以及生物化学优化ogical组织标本。此外，一强大的红外MALDESI成像源已被开发出来，其中，可调谐的中红外激光器用计算机控制的XY平移阶段和高的分辨能力质谱仪同步。自定义的图形用户界面（GUI）允许激光的重复频率的用户选择，每像素镜头，样品台的步长，和解吸之间的延迟和扫描源的事件的数目。红外MALDESI已在多种应用中被使用，如生物组织切片的纤维和染料和MSI的取证分析。不同的分析物，从内源性代谢物的组织切片中的外源外源物的分布可以被测量，并使用这种技术进行定量。在这个手稿介绍的协议详细描述了全身组织切片的IR-MALDESI MSI主要步骤。
Introduction
在微探针模式质谱成像（MSI）通过在样品的表面上的离散位置的光束（激光或离子）涉及从表面样品的解吸。在每个栅格点，则产生的质谱和所获取的光谱，与从它们被收集的空间位置一起，可以用来同时映射样本内的许多分析物。此无标记耦合到灵敏度和质谱特异性成像的方式帮助微星成为质谱1,2-最快速发展的领域之一。
基质辅助激光解吸/电离（MALDI）是用于MSI分析中最常见的电离方法。然而，需要一种有机基质和MALDI的真空要求姿势上再现性，样品通量，并且可以使用该方法分析的样品的类型显著局限性。许多大气压力（AP）的IOnization方法已被开发，近年来，以规避这些限制3。这些环境电离方法允许生物样品的分析中是更接近自然状态，并简化分析前样品制备步骤的环境。基质辅助激光解吸电喷雾电离（MALDESI）是这样一种电离法4,5的一个例子。
在IR-MALDESI实验中，冰的薄层沉积在组织表面作为能量吸收基质上。中红外激光脉冲由冰基质吸收，并促进中性材料的解吸从由共振激励OH表面伸展的水模式。解吸的中立分区为正交电的带电滴，并且后电离在ESI状方式4-6。外源性冰矩阵的加法优于在组织上的内源性水单靠，因为它有助于交流算用于在不同组织区室含水量的变化，并且已显示通过〜15倍的组织成像实验7,8，以提高解吸6和提高离子丰度。
在这项工作中，我们采用了IR-MALDESI MSI引发的新生小鼠全身不同器官的代谢产物的分布。对IR-MALDESI源的可调节的参数的概况给出，并且对组织切片的成功的成像必要的步骤被证明。
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Protocol
注：以下协议描述的所有执行IR-MALDESI MSI实验的必要步骤。深入可以在其他地方5,6-找到关于红外MALDESI源的优化几何形状及其与激光，阶段同步和质谱仪的信息。在这个协议中使用的动物组织样品按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）和北卡罗莱纳州立大学的规定取得。
1.组织准备
- 通过在通风橱中放置〜200毫升异戊烷在干净的烧杯干冰的次级容器内制备异戊烷/干冰浴。在任何时候都处理异戊烷/干冰浴和组织时，使用防护手套和护目镜。
- 通过安乐死过量溴乙醇2日龄整个新生小鼠小狗（7.5毫克/克体重），然后冻结组织中的异戊烷/干冰浴保持组织结构。使用一个预清洁编对镊子来放置，并从异戊烷/干冰浴移开鼠标小狗中cryomold。在-80℃直至分析存储快速冷冻组织。
- 使用防护手套，应用最佳切割温度（OCT）安装介质的层至40mm的低温恒温器试样圆盘。冷冻整个鼠标轻轻放置到华侨城涂层试样架坚持鼠标光盘在所需方向进行切片。
注意：OCT用于仅粘附的组织，以在试样圆盘用于切片。不要完全嵌入组织中OCT和华侨城是已知有MSI分析不利影响避免过剩。其他媒体，例如明胶，可用于冷冻嵌入组织切片它9之前。 - 放在珀尔帖样品架光盘（与华侨城和组织切片）的低温恒温器，按佩尔蒂埃电源按钮。等待10分钟样品来热平衡。
- 放置标本盘（与组织安装在它）该盘片保持器内，并面对组织向下到用于分析期望的平面。切片组织成使用容纳在低温恒温器10内的旋转式切片机在-20℃下所需厚度的部分。
注意：对于全身分析，切片组织成25微米厚的部分，以保持组织完整性。为更小的区域（ 例如 ，肝，脑，肾），切片组织成10微米厚的切片。- 使用防倾玻璃板，以防止切片组织切片从滚动。使用低温恒温器真空软管和刷子去除不需要的组织碎片。一旦组织切片，用刀片护罩覆盖锋利的切片机刀片，以免造成人身伤害。
- 对试样板东方鼠部分和通过使滑动尽可能靠近于组织部分解冻贴装到预清洗的玻璃显微镜玻片，而不触及它10。
注：对于定量MSI experiments，涂层用自动气动喷雾器安装所述组织之前，与内部标准的幻灯片，和解冻贴装上涂布的载玻片11上的组织切片。 - 删除习惯使用刀片喷射器切片组织切片机刀片，并安全地丢弃在适当的“锐利废物”容器中的刀片。
- 保持低温恒温器内部的载玻片，直到步骤3.2，以保持组织的冷冻保存。
2.红外MALDESI准备/校准
- 打开中红外激光发射计算机上的激光控制中的应用。选择使用由制造商提供的激光控制应用所需的波长。红外MALDESI实验在2940纳米下进行。
注：最近的实验研究中红外的激光波长的依赖和冰矩阵这似乎是具体 的分析指出8差异。 - 打开雄鹿E控制器，启动自定义用户控制程序（RASTIR），和校准使用home键的舞台上的地位。
- 准备电的解决方案。通常情况下，使用以50:50的比例（体积/体积）甲醇/水含0.2％甲酸在正离子模式电喷雾溶剂。根据实验选择电溶剂组合物。例如，使用5毫米氢氧化铵在负离子模式成像应用电改性剂。
注意：对于极性转换红外MALDESI微星，使用1mM的乙酸作为改性剂。这种改性剂被发现最适合于在两个正，负离子模式12获得稳定的和可重复的信号。 - 填充1ml注射器具有电溶剂，并冲洗用新溶剂中的二氧化硅毛细管。
- 使用源的参数，如：ESI-光点距离对齐ESI发射极上轴与MS入口，点进距离，样品的高度，并溶剂流速已使用统计DO优化 E代表组织切片6的分析。注：参见图1示意描绘这些参数的优化值组织切片的MSI。
- 启动电和评价通过监测总离子电流（TIC）其中，在这一点上，仅由环境化合物其稳定性（> 10分钟）。典型地，<10％以上10〜15分钟的TIC变化是稳定的良好指示。
图1. IR-MALDESI原理和参数。（A）IR-MALDESI源设置（不按比例）和可调节参数的示意图。 （ 二 ）优化参数值组织切片成像。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 注意：将样品在舞台前，关闭电。
- 放置解冻上的组织到摄像机视野内的红外MALDESI样品板。
- 确保手是明确ESI发射器并重新启动电。
- 关闭红外MALDESI源和净化机箱的访问门用干燥的氮气，以防止水凝结所述组织的表面上。一旦外壳到达内部的相对湿度<3％，打开直流电源（〜12V）到珀耳帖板，其将冷却所述样品板。注意：在珀耳帖冷却阶段的冷却过程是在别处详细13讨论。
- 冷却阶段-9℃，并允许上的组织，以达到热平衡（〜5-10分钟）。
- 停止氮气吹扫，并且通过打开源接入门暴露组织的环境相对湿度。冰的薄层将沉积在共珀尔帖阶段的LD表面和安装组织部分由于来自空气的水凝华。
注意：如果在实验室的相对湿度低于10％-15％，将温水的烧杯中的外壳内以促进冰基质层的形成。 - 形成在冰基质层后，关闭检修门，并重新启动干氮气的流动，以相对湿度降低至10±2％。调整氮气流量，以保持相对湿度在这个水平上，经验上发现的冰的形成和升华的平衡整个实验6保持冰的恒定层。
4.质谱成像数据采集
- 使用RASTIR GUI（ 如图2），点击“LASER位置”按钮，移动舞台分析位置。使用激光的调整二极管以确保离组织区域将被消融。火场外的组织重新激光射击祗园校准激光相对于摄像机视图所抵消。点击“激光测试火”按钮，更新激光位置。
- 返回到“相机位置”，并通过将激光对准十字线的激光烧蚀点（ 图2-1）更新RASTIR激光位置。
- 点击感兴趣区域（ROI）按钮的区域和调整ROI的大小和位置的组织切片被分析（ 图2-2）。输入相应的实验参数，如X和Y方向（单位mm）（ 图2-3）步长，并命名在“项目名称”框（ 图2-4），MSI文件。
- 当绘制ROI，包括了组织，充当控制的一部分。使用高峰采摘这一关，组织切片（步骤5.4）。
注意：在组织中的激光的解吸直径（点尺寸）大约为150微米;然而，更高的空间分辨率可以通过USI获得纳克过采样方法14,15。
- 当绘制ROI，包括了组织，充当控制的一部分。使用高峰采摘这一关，组织切片（步骤5.4）。
- 选择从下拉框中，每像素的激光脉冲（整数值）的数目，以及激光触发器和质谱仪信号采集（ 图2-5）之间的延迟的适当的激光频率。通常使用每像素两个激光脉冲在20赫兹到在IR-MALDESI微星实验完全解吸材料，具有10毫秒的延迟时间，以允许产生到达质量分析器测量5离子。
注：选择最高的重复率使激光能够在操作。这是最近表明，使用较高的重复率将提高分析物探测16。
图2.用户界面IR-MALDESI MSI操作。在RASTIR扫描控制程序的截图呈现。对于PERF的步骤orming一个微星实验是：（1）定位的激光点，（2）绘制的ROI，（3）在选择阶段步长大小（单位mm），（4）赋予的名称到该文件，（5）选择正确的数每个像素脉冲与所需的重复率，（6）检查列表成像和MS设置沿。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 选择质谱仪的参数，如电离模式下，电压，溶剂流速，毛细管温度，并在质谱仪软件喷射时间。参考表1对在全身的IR-MALDESI微星使用的参数的一个例子。
注意：由于在生物样品和缺乏微星分析分离方法的复杂性，对IR-MALDESI源耦合到一个高分辨力和高的质量准确度的仪器。采集方法可以加载analysES如平行反应监测（PRM）7或极性切换MSI 12。 - 一旦所有参数（激光，舞台，和质谱仪）已被选定，将在MS同步“握手”模式，并启动MS采集。
- 使用RASTIR成像软件，验证所有步骤清单（ 图2-6）通过检查框完成，加载程序。一旦程序被加载，“运行”按钮将变为可用。按Run启动MSI信号采集。
- 一旦成像实验完成后，停止质谱仪采集并放置在待机状态下在仪器。关闭氮气吹扫到机箱，关掉电源，珀耳帖板，并关闭级控制器和激光。
- 打开检修门，从源头机箱内取出电发射头，并使用防护手套删除扩展加热的金属质谱入口。注意：扩展金属质谱入口会很烫。
- 戴手套和护目镜，清洗在15％的硝酸经超声波浴中的扩展金属毛细管入口10分钟，然后在HPLC级水10分钟，最后在HPLC级甲醇10分钟。擦干金属毛细管入口在氮气流中，并重新插入MS。注：在适当的废物容器后处置溶剂。
| 参数 | 值 |
| 电离模式 | 正面的 |
| 电电压 | R“的风格=”WIDTH：216px;“> 3.8-4.2千伏|
| 溶剂流速 | 2微升/分钟 |
| 毛细管温度 | 275℃ |
| 扫描范围 | M / Z 250-1000 |
| 扫描类型 | 全扫描 |
| 注射时间 | 110毫秒 |
| 解析力 | 宽度：216px;“> 14万
在全身IR-MALDESI微星采用表1.仪器参数。
5.数据分析
- 由仪器生成的原始数据文件转换为数据格式，如mzXML 17或18 imzML使用免费软件如MSConvert 17和imzML转换器19。
- 开始MSiReader V1.0，高分辨力MSI数据20的分析制定，有专门的处理计算机上的开源软件。加载映像文件到MSiReader。对于MSiReader的用户界面和它的一些内置的功能，参见图3。
- 通过输入其M / Z生成的目标分析物离子地图，选择百万分之适当的M / Z窗口（PPM）或汤姆森（TH）（ 图3-1）。对于高分辨率（RP）仪器选择在低ppm范围内的一个窗口。
注：将合适的M / Z窗口取决于仪器即IR-MALDESI源耦合到的RP和质量的测量精度（MMA）。 - 进一步解释使用内置的功能，如插补（ 图3-2），标准化（ 图3-3），光学图像叠加（ 图3-4），和峰值采摘（ 图3-5）20的数据。
图3. MSiReader的用户界面; V1.0 20。一旦一个文件被加载到软件中，感兴趣分析物的离子映射由（1）输入ppm或钍的M / Z和公差显示。还可以执行诸如（2）内插或（3）归一化进一步分析。组织的光学图像也可以导入并叠加离子的地图（4）为更好的可视化。对于不相关的分析峰的拾取功能（5）可用于通过选择组织（品红色线）的区域和参考区域外组织（绿盒）提取组织特异性的峰值。 请点击此处查看大图这个数字。
- 使用峰拾取函数生成使用用户定义的标准组织特异性m / z值的列表。注：PeakFinder算法使用两个区域平均质谱差异。然后，这些m / z值可以搜索针对代谢物数据库如METLIN 21或脂质MAPS 22
- 参考图3为选择一个询问组织区域（品红多边形ROI），并关断组织的参考区域（绿色多边形ROI）的一个例子。
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Representative Results
在图4中呈现的图像显示在不同器官中的全身组织切片的代谢物的空间分布。使用MSiReader PeakFinder发现独特m / z值到身体的特定区域，接着通过分批处理的图像生成。图像叠加工具（ 图3-4）被用来对准所得离子地图冰基质沉积之前拍摄的光学图像。胆固醇是在所有组织类型观察到如从动物细胞膜（ 图4A）其结构的作用预期的，而其他的代谢物显示出特定的器官或组织隔室（ 图4B-D）的范围内不同的分布。
图4.代表性的IR-MALDESI MSI图像; AD四个 Metaboli游戏TE离子的地图展现着整个鼠标部分的化合物的本地化。脂质类在每幅图像的右下角注释。组织切片的光学图像是为了与器官的可视化，以帮助叠加离子的地图范围内。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
上述协议描述为执行IR-MALDESI MSI实验的关键步骤。矩阵应用程序（第3节）大约需要20分钟，这是通过升华或类似的用于MALDI微星实验的典型矩阵应用过程使用机器人喷雾器喷涂。此外，红外MALDESI不依赖于分析物的分配到基质晶体6和冰基质可普遍用于所有分析物，无论它们的质量，大小，或化学性质的。此外，利用冰的消除了在典型的MALDI实验23观察到较低的m / z范围的矩阵相关的离子。
虽然在实验中的所有步骤都需要产生质量MSI数据，在实验的过程中，电稳定性是可重复的IR-MALDESI离子发生是至关重要的。相对湿度需要在成像实验的过程中要监视保持恒定的冰基质层。对IR-MALDESI解吸是相对不透冰6的厚度;然而，一些成像实验可以采取多个小时，如果不能监控的冰层可能成为麻烦。为此，一个比例 - 积分 - 导数（PID）控制器最近被集成到源，以便监视机箱内的温度和相对湿度，并根据需要进行调整。
因为微星涉及从表面分析物的直接取样，色谱分离不能用来减小谱的复杂性。此外，目前在实验室环境中的环境的离子可以与来自目的分析物信号干扰。从环境离子光谱与复杂多样化的生物样品内的化合物的组合需要IR-MALDESI（和其他环境MSI源）以质量高精确度和高分辨率质谱仪耦合，SUCH在该实验中使用的，为了方便代准确和详细的离子地图之一。
在这项工作中，使用的IR-MALDESI揭示了多种在整个小鼠的各个器官内源性代谢物的空间分布。高峰在MSiReader采摘算法能够识别超过500个组织特异性离子，其中许多人来自不同的类脂质。该协议也可以用于同时监测外源化合物，例如药物和药物代谢产物的分布，在不同的器官24,25。黄金标准全身药物分布研究是全身放射自显影24。然而，该方法是耗时的，需要放射性标记的化合物和母体药物及其代谢物不能区分，因为它不提供有关分析物的分子结构的信息。全身微星与IR MALDESI规避这些问题，同时也使在周围环境中执行的分析，不加入有机基质。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR-MALDESI Source | Custom-made | N/A | Please refer to references 4 and 12 for an in-depth discussion of IR-MALDESI source development. |
| Q Exactive Plus | Thermo Scientific | Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Methanol, HPLC Grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| Tunable mid-IR Laser | Opotek Inc. | IR Opolette | Tunable 2,700-3,100 nm IR OPO laser |
| Nitrogen Gas | Arc3 Gases | AG S-NI300-5.0 | Grade 5.0 high purity nitrogen gas cylinder (300) |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM 1950 | Cryomicrotome |
| High Profile Microtome Blades | Leica Biosystems | 3802123 | Leica DB80HS |
| Mounting Medium (OCT) | Leica Biosystems | 3801480 | Surgipath FSC 22 mounting medium |
| Cryostat Specimen Disc | Leica Biosystems | 14047740045 | 40 mm diameter |
| Glass Microscope Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, selected, pre-cleaned |
References
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