Abstract
وكانت مصادر التأين المحيطة لمطياف الكتلة (MS) موضوع الكثير من الاهتمام في العقد الماضي. مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين electrospray (MALDESI) هو مثال على مثل هذه الأساليب، حيث الميزات من مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين (MALDI) (على سبيل المثال، والطبيعة نابض من الامتزاز) وتأين بالإرذاذ الإلكتروني (ESI) (على سبيل المثال، لينة التأين ) يتم الجمع. واحدة من أهم مزايا MALDESI هو تنوعها الأصيل. في التجارب MALDESI، والأشعة فوق البنفسجية (UV) أو الأشعة تحت الحمراء (IR) ليزر يمكن استخدامها لresonantly تثير مصفوفة الذاتية أو الخارجية. اختيار مصفوفة ليست تحليلها تعتمد، ويعتمد فقط على الطول الموجي الليزر المستخدمة لإثارة. في التجارب IR-MALDESI، وتودع طبقة رقيقة من الجليد على سطح العينة كما مصفوفة امتصاص الطاقة. وقد تم تحسين المصدر الهندسة IR-MALDESI باستخدام التصميم الإحصائي من التجارب (وزارة الطاقة) لتحليل العينات السائلة وكذلك بيولعينات الأنسجة ogical. وعلاوة على ذلك، تم تطوير مصدر التصوير IR-MALDESI قوي، حيث تتم مزامنة والانضباطي الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء مع الكمبيوتر التي تسيطر عليها مرحلة XY متعدية وارتفاع حل مطياف الكتلة السلطة. واجهة المستخدم الرسومية (GUI) تتيح اختيار المستخدم من معدل تكرار الليزر، وعدد من الطلقات في فوكسل، خطوة حجم المرحلة العينة، والتأخير بين الامتزاز ومسح الأحداث لمصدر. وقد استخدمت الأشعة تحت الحمراء MALDESI في مجموعة متنوعة من التطبيقات مثل تحليل الطب الشرعي من الألياف والأصباغ وMSI من أقسام الأنسجة البيولوجية. توزيع التحاليل مختلفة تتراوح من نواتج الأيض الذاتية لالاكسيوبيوتك الخارجية داخل أقسام الأنسجة يمكن قياسها كميا وباستخدام هذه التقنية. يصف بروتوكول المعروضة في هذه المخطوطة الخطوات الرئيسية اللازمة لIR-MALDESI MSI من أقسام الأنسجة في الجسم بأكمله.
Introduction
الكتلة الطيفي التصوير (MSI) في وضع مجهري ينطوي الامتزاز من العينة من السطح بواسطة شعاع (ليزر أو الأيونات) في مواقع منفصلة على سطح العينة. في كل نقطة النقطية، يتم إنشاء الطيف الكتلي وأطياف المكتسبة، جنبا إلى جنب مع الموقع المكاني الذي تم جمعها، يمكن أن تستخدم لتعيين وقت واحد العديد من التحاليل ضمن العينة. وقد ساعدت هذه الطريقة التسمية خالية من التصوير بالإضافة إلى حساسية وخصوصية قياس الطيف الكتلي MSI تصبح واحدة من المجالات المتطورة بسرعة أكبر في قياس الطيف الكتلي 1،2.
مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين (MALDI) هو الأسلوب التأين الأكثر شيوعا المستخدمة لتحليل MSI. ومع ذلك، فإن الحاجة إلى مصفوفة العضوية ومتطلبات فراغ MALDI تشكل قيودا كبيرة على التكاثر، وعينة الإنتاجية، وأنواع العينات التي يمكن تحليلها باستخدام هذه الطريقة. وهناك عدد من الضغط الجوي (ا ف ب) الإعلام والتوعيةوقد تم تطوير أساليب nization في السنوات الأخيرة إلى الالتفاف على هذه القيود 3. هذه الأساليب التأين المحيطة تسمح لتحليل العينات البيولوجية في بيئة هي أقرب بكثير إلى حالتها الطبيعية وتبسيط خطوات تحضير العينة قبل التحليل. مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين electrospray (MALDESI) هو مثال على مثل هذا 4،5 طريقة التأين.
في التجارب IR-MALDESI، وتودع طبقة رقيقة من الجليد على سطح الأنسجة مثل المصفوفة التي تمتص الطاقة. يمتص نبضة الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء من قبل مصفوفة الجليد، ويسهل الامتصاص للمواد محايدة من السطح عن طريق إثارة resonantly أوهايو وضع المياه تمتد. قسم المحايدين المستوعبة في قطرات اتهم من electrospray متعامد ووبعد المتأينة بطريقة ESI تشبه 4-6. ويفضل إضافة مصفوفة الجليد الخارجية خلال الاعتماد فقط على الماء الذاتية في الأنسجة لأنه يساعد على ميلانعد عن الاختلافات في محتوى الماء في مقصورات الأنسجة المختلفة، ولقد ثبت لتعزيز الامتزاز 6 وتحسين وفرة أيون التي كتبها ~ 15 أضعاف 7،8 في تجارب التصوير الأنسجة.
في هذا العمل، ونحن استخدام الأشعة تحت الحمراء MALDESI MSI للحصول على توزيع نواتج عبر الأجهزة المختلفة في الجسم كله الماوس حديثي الولادة. يتم إعطاء لمحة عامة عن المعلمات قابل للتعديل من مصدر الأشعة تحت الحمراء MALDESI، وأظهرت الخطوات اللازمة للتصوير الناجح للأقسام الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: بروتوكول التالي يصف كل الخطوات اللازمة لإجراء التجارب IR-MALDESI MSI. في العمق من التفاصيل حول هندسة الأمثل من مصدر الأشعة تحت الحمراء MALDESI وتزامن مع الليزر، والمسرح، ومطياف الكتلة يمكن العثور عليها في أي مكان آخر 5،6. وقد تم الحصول على عينات من الأنسجة الحيوانية المستخدمة في هذا البروتوكول وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) واللوائح جامعة ولاية نورث كارولينا.
1. نسيج التحضير
- إعداد / الجاف حمام الثلج نظير البنتان من خلال وضع ~ 200 مل من نظير البنتان في كوب نظيف داخل حاوية الثانوية من الثلج الجاف في غطاء الدخان. استخدام قفازات واقية ونظارات السلامة في جميع الأوقات عند التعامل مع / حمام الثلج الجاف نظير البنتان والأنسجة.
- الموت ببطء من العمر 2-اليوم-كله الجرو الماوس حديثي الولادة عن طريق آفيرتين جرعة زائدة من (7.5 ملغ / غرام من وزن الجسم)، ثم تجميد الأنسجة في نظير البنتان / حمام الثلج الجاف للحفاظ على بنية الأنسجة. استخدام ما قبل نظيفةإد زوج من ملقط لوضع وإزالة الجرو الماوس في cryomold من نظير البنتان / حمام الثلج الجاف. تخزين الأنسجة فلاش المجمدة في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
- استخدام القفازات الواقية، وتطبيق طبقة من درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) المتوسطة المتزايدة إلى 40 ملم القرص ناظم البرد العينة. وضع بلطف الماوس المجمد الكامل على حامل العينة أكتوبر المغلفة التمسك الماوس إلى القرص في الاتجاه المطلوب لباجتزاء.
ملاحظة: يستخدم أكتوبر فقط على الالتزام الأنسجة إلى القرص عينة لباجتزاء. لا الأنسجة تضمين تماما في أكتوبر وتجنب زيادة كما هو معروف أكتوبر أن يكون لها آثار ضارة على تحليل MSI. وسائل الإعلام الأخرى، مثل الجيلاتين، ويمكن استخدامها لالبرد تضمين الأنسجة تشريح النتيجة 9 قبل. - ضع القرص (مع أكتوبر وقسم الأنسجة) على صاحب العينة بلتيير في ناظم البرد واضغط زر الطاقة بلتيير. انتظر 10 دقيقة لعينة للتوصل إلى التوازن الحراري.
- ضع القرص العينات (مع الأنسجة التي شنت علىذلك) داخل حامل القرص، ومواجهة الأنسجة وصولا الى المطلوب الطائرة للتحليل. شريحة الأنسجة في أجزاء من سمك المطلوب عند درجة حرارة -20 درجة مئوية باستخدام مشراح الدوارة يضم داخل ناظم البرد 10.
ملاحظة: للحصول على تحليل كامل الجسم، شريحة الأنسجة إلى أقسام 25 ميكرون سميكة للحفاظ على سلامة الأنسجة. لمناطق أصغر (مثل الكبد والدماغ والكلى)، شريحة الأنسجة في المادتين 10 ميكرون سميكة.- استخدام لوحة زجاجية مكافحة لفة لمنع قسم الأنسجة شرائح من المتداول. استخدام خرطوم فراغ ناظم البرد وفرش لإزالة الحطام الأنسجة غير المرغوب فيها. بمجرد مقطوع الأنسجة، استخدم الحرس شفرة لتغطية شفرة مشراح حادة لتجنب الإصابات الشخصية.
- قسم الماوس توجيه على لوحة العينة وذوبان الجليد جبل على الزجاج شريحة المجهر تنظيفها قبل من خلال جلب الشريحة أقرب وقت ممكن إلى قسم الأنسجة، دون لمسها 10.
ملاحظة: للحصول على كمية من experi MSIالإدلاء بالبيانات، ومعطف الشريحة مع معيار الداخلية باستخدام بخاخ هوائي الآلي قبل تركيب الأنسجة، وذوبان الجليد جبل قسم الأنسجة على الشريحة المغلفة 11. - إزالة شفرة مشراح المستخدمة لباجتزاء الأنسجة باستخدام قاذف شفرة، وبأمان تجاهل شفرة في الحاوية "النفايات الحادة" المناسبة.
- حافظ على شريحة زجاجية داخل ناظم البرد حتى الخطوة 3.2 للحفاظ على الحفظ بالتبريد من الأنسجة.
2. IR-MALDESI إعداد / المعايرة
- بدوره على الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء وبدء تطبيق ليزر جهاز التحكم على الكمبيوتر. اختيار الطول الموجي المطلوب باستخدام تطبيق الرقابة الليزر الموردة من قبل الشركة المصنعة. وتجرى التجارب IR-MALDESI عادة في 2940 نانومتر.
ملاحظة: حققت التجارب الحديثة اعتماد موجات الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء ومصفوفة الجليد مع وجود اختلافات وأشار التي يبدو أنها تحليلها محددة 8. - بدوره على الأيلتحكم الإلكترونية، إطلاق برنامج مخصص تحكم المستخدم (RASTIR)، ومعايرة موقف المرحلة باستخدام زر المنزل.
- يعد حل electrospray. عادة، استخدم 50:50 (ت / ت) الميثانول / الماء مع حمض الفورميك بنسبة 0.2٪ للمذيب electrospray في وضع إيجابي أيون. حدد electrospray تكوين المذيبات وفقا للتجربة. على سبيل المثال، استخدام هيدروكسيد الأمونيوم 5 ملم ومعدل electrospray لتطبيقات التصوير في وضع الأيونات السالبة.
ملاحظة: للحصول على الاستقطاب التحول IR-MALDESI MSI، استخدم 1 ملم حمض الخليك كما المعدل. تم العثور على هذا المعدل الأمثل للحصول على إشارة مستقرة وقابلة للتكرار في كل positive- والأيونات السالبة وسائط 12. - ملء حقنة 1 مل مع المذيب electrospray، وتدفق شعري السيليكا مع مذيب الجديد.
- محاذاة ESI باعث على محور مع MS مدخل باستخدام المعلمات مصدر مثل المسافة ESI بقعة، بقعة مدخل بعد، وارتفاع العينة، ومعدل تدفق المذيبات التي تم الأمثل باستخدام DO الإحصائي E لتحليل المقاطع النسيجية 6. ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي التي تصور هذه المعايير والقيم الأمثل لMSI من أقسام الأنسجة.
- بدء electrospray وتقييم استقرارها (> 10 دقيقة) من خلال رصد أيون الحالية الإجمالي (TIC) التي، في هذه المرحلة، ويتألف فقط من المركبات المحيطة. عادة، والاختلاف عرة من <10٪ خلال 10-15 دقيقة يعتبر مؤشرا جيدا من الاستقرار.
الشكل 1. IR-MALDESI التخطيطي والمعلمات. (A) تخطيطي من الإعداد مصدر IR-MALDESI (لا لتوسيع نطاق) والمعلمات قابل للتعديل. (ب) القيم المعلمة الأمثل لتصوير المقاطع الأنسجة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- الحذر: إيقاف electrospray قبل وضع العينة على المسرح.
- وضع الأنسجة محمولة على ذوبان الجليد على لوحة عينة IR-MALDESI في عرض الكاميرا.
- تأكد من يد واضحة من باعث ESI وإعادة تشغيل electrospray.
- أغلق باب الوصول للمصدر وتطهير الضميمة IR-MALDESI مع النيتروجين الجاف لمنع التكثيف من المياه على سطح الأنسجة. وبمجرد أن الرطوبة النسبية داخل المجرى الضميمة <3٪، بدوره على امدادات التيار المستمر (~ 12 فولت) إلى لوحة بلتيير، والتي سوف تبريد لوحة عينة. ملاحظة: ناقش عملية التبريد في مرحلة تبريد بلتيير-بالتفصيل في مكان آخر (13).
- تبريد المرحلة -9 درجة مئوية، والسماح للأنسجة لنصرة يأتي إلى التوازن الحراري (~ 5-10 دقيقة).
- وقف تطهير النيتروجين وفضح الأنسجة إلى الرطوبة النسبية المحيطة عن طريق فتح باب الوصول إلى المصدر. سوف يتم إيداع طبقة رقيقة من الجليد على التعاونسطح دينار للمرحلة بلتيير وشنت قسم الأنسجة بسبب desublimation من الماء من الهواء.
ملاحظة: إذا كانت الرطوبة النسبية في المختبر أقل من 10-15٪، ووضع كوب من الماء الدافئ داخل العلبة لتسهيل تشكيل طبقة مصفوفة الجليد. - بعد أن يتم تشكيل طبقة مصفوفة الجليد، أغلق باب الوصول وإعادة تدفق النيتروجين الجاف للحد من الرطوبة النسبية إلى 10 ± 2٪. ضبط معدل تدفق النيتروجين للحفاظ على الرطوبة النسبية على هذا الصعيد، وجدت تجريبيا لتكون في ميزان تشكيل الجليد والتسامي للحفاظ على طبقة مستمرة من الجليد في كافة مراحل التجربة (6).
4. قياس الطيف الكتلي التصوير الحصول على البيانات
- باستخدام واجهة المستخدم الرسومية RASTIR (الشكل 2)، حرك مرحلة لموقف التحليل عن طريق النقر على زر "موقف LASER". استخدام الصمام الثنائي تعديل ليزر لضمان سوف يكون ذاب منطقة خارج الأنسجة. اطلاق النار ليزر في إعادة خارج النسيججيون لمعايرة الليزر تعويض فيما يتعلق كاميرا للرؤية. انقر على زر "الليزر اختبار النار" لتحديث موقف الليزر.
- العودة إلى "وضع CAMERA" وتحديث الموقف الليزر في RASTIR عن طريق وضع ليزر محاذاة الشبيكة على الفور الاستئصال بالليزر (الشكل 2-1).
- انقر فوق المنطقة زر الفائدة (ROI) وضبط حجم وموضع من العائد على الاستثمار لقسم الأنسجة التي يجري تحليلها (الشكل 2-2). إدخال المعلمات التجريبية المناسبة مثل حجم الخطوة في العاشر والاتجاهات Y (مم) (الشكل 2-3)، واسم الملف MSI في مربع "اسم المشروع" (الشكل 2-4).
- عند رسم العائد على الاستثمار، وتشمل جزء من خارج الأنسجة التي هي بمثابة السيطرة. استخدم هذا المقطع من الأنسجة لذروة قطف (الخطوة 5.4).
ملاحظة: قطر الامتزاز (حجم البقعة) من الليزر على الأنسجة هو ما يقرب من 150 ميكرون. ومع ذلك، القرارات المكانية أعلى يمكن الحصول عليها عن طريق باليودنانوغرام 14،15 أسلوب الإفراط.
- عند رسم العائد على الاستثمار، وتشمل جزء من خارج الأنسجة التي هي بمثابة السيطرة. استخدم هذا المقطع من الأنسجة لذروة قطف (الخطوة 5.4).
- حدد تردد الليزر المناسب من مربع القائمة المنسدلة، وعدد نبضات الليزر في فوكسل (قيم الأعداد الصحيحة)، والتأخير بين الزناد الليزر واكتساب إشارة مطياف الكتلة (الشكل 2-5). عادة ما تستخدم نبضات الليزر اثنين في فوكسل في 20 هرتز إلى يلتفظ تماما المواد في التجارب IR-MALDESI MSI، مع الوقت 10 مللي ثانية تأخير للسماح للأيونات ولدت للوصول إلى محلل الكتلة لقياس 5.
ملاحظة: اختيار أعلى معدل تكرار أن الليزر قادر على العمل في. وقد تبين مؤخرا أن استخدام أعلى معدل تكرار وتحسين تحليلها الكشف 16.
ويرد الشكل 2. واجهة المستخدم ل عملية IR-MALDESI MSI. لقطة من برنامج RASTIR التحكم تفحص. خطوات الأداء الإقتصادي الأداءorming تجربة MSI هي (1) تحديد مكان وجود بقعة الليزر، (2) رسم على العائد على الاستثمار، (3) اختيار حجم المرحلة خطوة (مم)، (4) إعطاء اسم للملف، (5) اختيار الرقم الصحيح من البقول في فوكسل جنبا إلى جنب مع معدل المطلوب التكرار، و (6) فحص قائمة للتصوير والإعداد MS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- اختيار المعلمات مطياف الكتلة مثل وضع التأين، electrospray الجهد، ومعدل تدفق المذيبات، ودرجة الحرارة الشعرية، والوقت حقن في البرنامج مطياف الكتلة. الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على مثال من المعايير المستخدمة في كامل الجسم الأشعة تحت الحمراء MALDESI MSI.
ملاحظة: نظرا لتعقيد العينات البيولوجية وعدم وجود طرق فصل في تحليل MSI، يقترن مصدر IR-MALDESI إلى حل السلطة عالية وعالية الدقة أداة الشامل. يمكن تحميل طريقة اكتساب لمحللة بياناتوفاق مثل رصد رد فعل مواز (PRM) 7 أو الاستقطاب التحول MSI 12. - مرة واحدة وقد تم اختيار جميع المعلمات (ليزر، والمسرح، ومطياف الكتلة)، وضع MS في وضع "المصافحة" لمزامنة، والبدء في اكتساب MS.
- باستخدام برامج التصوير RASTIR، تحقق من جميع الخطوات في المرجعية (الشكل 2-6) يتم الانتهاء من فحص الصناديق، وتحميل البرنامج. بمجرد تحميل البرنامج، سوف تكون متاحة على زر "تشغيل". اضغط تشغيل لبدء MSI اكتساب إشارة.
- عند الانتهاء من تجربة التصوير، والتوقف عن اكتساب مطياف الكتلة ووضع الجهاز في وضع الاستعداد. إيقاف تطهير النيتروجين إلى العلبة، إيقاف إمدادات الطاقة إلى لوحة بلتيير، وإيقاف وحدة تحكم مرحلة والليزر.
- فتح باب الوصول، وإزالة غيض باعث electrospray من داخل العلبة المصدر، وإزالة موسعة معدنية ساخنة MS مدخل باستخدام القفازات الواقية. تحذير: إن الموسعة والمعادن MS مدخل تكون ساخنة جدا.
- ارتداء القفازات ونظارات السلامة، وتنظيف موسعة مدخل الشعرية المعدنية بنسبة حمام بالموجات فوق الصوتية في حامض النيتريك 15٪ لمدة 10 دقيقة، ثم في الماء HPLC الصف لمدة 10 دقيقة، وأخيرا في الميثانول HPLC الصف لمدة 10 دقيقة. تجفيف مدخل الشعرية المعدنية تحت تيار من النيتروجين، وإعادة تركيبها في مرض التصلب العصبي المتعدد. ملاحظة: يجب التخلص من المذيبات في حاويات النفايات المناسبة بعد ذلك.
| معامل | القيمة |
| وضع التأين | إيجابي |
| Electrospray الجهد | R "على غرار =" العرض: 216px؛ "> 3،8-4،2 كيلو فولت|
| معدل التدفق المذيبات | 2 ميكرولتر / دقيقة |
| شعري درجة الحرارة | 275 ° C |
| نطاق المسح الضوئي | م / ض 250-1،000 |
| نوع المسح الضوئي | مسح كامل |
| حقن الوقت | 110 ميللي ثانية |
| حل السلطة | العرض: 216px؛ "> 140000
الجدول 1. المعلمات أداة تستخدم في كامل الجسم الأشعة تحت الحمراء MALDESI MSI.
تحليل 5. البيانات
- تحويل ملفات البيانات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة أداة لتنسيقات البيانات مثل mzXML 17 أو imzML 18 باستخدام البرمجيات الحرة مثل MSConvert 17 و imzML تحويل 19.
- بدء MSiReader V1.0، وهو برنامج مفتوح المصدر وضعت لتحليل وحل عالية الطاقة البيانات MSI 20، على جهاز كمبيوتر معالجة خاصة. تحميل ملف التصوير على MSiReader. واجهة المستخدم من MSiReader وبعض معالمه في البناء، انظر الشكل 3.
- توليد خرائط أيون في التحاليل من الفائدة عن طريق إدخال بهم م / ض واختيار نافذة م / ض المناسب في جزء في المليون أو طومسون (ث) (الشكل 3-1). لارتفاع السلطة (RP) أدوات حلاختر نافذة في المدى جزء في المليون منخفضة.
ملاحظة: نافذة م / ض المناسب يعتمد على البرنامج العادي والجماعية دقة القياس (MMA) الصك الذي يقترن مصدر IR-MALDESI ل. - وعلاوة على ذلك تفسير البيانات باستخدام الميزات المضمنة في مثل الاستيفاء (الشكل 3-2)، وتطبيع (الشكل 3-3)، بصري تراكب الصور (الشكل 3-4)، وذروة اختيار (الشكل 3-5) 20.
الرقم 3. واجهة المستخدم MSiReader. V1.0 20. مرة واحدة يتم تحميل ملف في البرنامج، يتم عرض الخرائط أيون في التحاليل من الاهتمام من قبل (1) طريق إدخال م / ض والتسامح في جزء في المليون أو ث. مزيد من التحليل مثل (2) الاستيفاء أو (3) تطبيع ويمكن أيضا أن يؤديها. صورة ضوئية من الأنسجة يمكن أيضا استيراد وفرضه معخرائط أيون (4) لتحسين التصور. للبدون استهداف يحلل ذروة اختيار وظيفة (5) يمكن استخدامها لاستخراج قمم الأنسجة محددة عن طريق اختيار مجال النسيج (الخط البنفسجي) ومنطقة إشارة من الأنسجة (المربع الأخضر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- استخدام وظيفة ذروة اختيار لإنشاء قائمة من القيم م / ض الأنسجة محددة باستخدام المعايير التي يحددها المستخدم. ملاحظة: يستخدم خوارزمية PeakFinder الاختلافات في متوسط الطيف الكتلي للمنطقتين. ويمكن بعد هذه القيم م / ض يتم البحث على قواعد البيانات الأيض مثل METLIN 21 أو الدهون في الخرائط. 22
- انظر الشكل 3 للحصول على مثال اختيار المنطقة استجواب الأنسجة (أرجواني المضلع ROI) وخارج نسيج المنطقة المرجعية (الأخضر المضلع ROI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الصور المعروضة في الشكل (4) تبين التوزيع المكاني للالأيض في الأجهزة المختلفة في قسم الأنسجة في الجسم بأكمله. تم العثور على قيم م فريد / ض إلى مناطق معينة من الجسم باستخدام MSiReader PeakFinder، تليها تجهيز دفعة لتوليد الصورة. تم استخدام أداة تراكب الصور (الشكل 3-4) لمحاذاة الصورة البصرية التي اتخذت قبل ترسب مصفوفة الجليد مع خرائط أيون الناتجة عن ذلك. لوحظ الكوليسترول في جميع أنواع الأنسجة كما هو متوقع من دور الهيكلي في أغشية الخلايا الحيوانية (الشكل 4A)، في حين نواتج أخرى يحمل توزيعات متميزة داخل أجهزة معينة أو المقصورات الأنسجة (الشكل 4B-D).
الشكل 4. صور الممثل IR-MALDESI MSI. م. أربعة metaboliخرائط أيون الشركة المصرية للاتصالات يتظاهرون توطين المركبات داخل قسم الماوس كله. والمشروح الطبقة الشحمية في أسفل اليمين من كل صورة. تم فرضه على الصورة البصرية للقسم الأنسجة داخل خرائط أيون من أجل مساعدة مع التصور الأعضاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول يصف فوق الخطوات الرئيسية لأداء تجربة IR-MALDESI MSI. عملية تطبيق مصفوفة (القسم 3) يأخذ ما يقرب من 20 دقيقة، والذي يشبه إلى عملية تطبيق مصفوفة نموذجية للتجارب MALDI MSI عن طريق التسامي أو رذاذ الطلاء باستخدام البخاخ الروبوتية. وعلاوة على ذلك، IR-MALDESI لا تعتمد على تقسيم التحاليل إلى بلورات المصفوفة 6، ومصفوفة الجليد يمكن أن تستخدم عالميا لجميع التحاليل بغض النظر عن خصائص الكتلة والحجم وأو الكيميائي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الثلج يلغي أيونات ذات الصلة مصفوفة في أقل نطاق م / ض لوحظ في التجارب MALDI النموذجية 23.
على الرغم من أن هناك حاجة إلى كل الخطوات ضمن تجربة لتوليد البيانات MSI الجودة والاستقرار electrospray خلال التجربة أمر ضروري لتوليد أيون قابلة للتكرار IR-MALDESI. تحتاج الرطوبة النسبية التي ينبغي مراقبتها على مدار تجربة التصوير لالحفاظ على طبقة مصفوفة الجليد ثابتة. والامتزاز IR-MALDESI منيع نسبيا لسمك الجليد 6؛ ومع ذلك، يمكن لبعض تجارب التصوير يستغرق ساعات عدة في الذي طبقة الجليد يمكن أن تصبح مزعجة إذا لم يتم رصدها. ولهذه الغاية، تم مؤخرا دمج و(PID) وحدة تحكم يتناسب-لا يتجزأ-مشابه في مصدر من أجل رصد درجات الحرارة والرطوبة النسبية داخل العلبة، وتعديلها حسب الحاجة.
منذ MSI ينطوي أخذ العينات مباشرة من التحاليل من السطوح، فصل الكروماتوغرافي لا يمكن استخدامها للحد من تعقيد الأطياف. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأيونات المحيطة الحالية في بيئة معملية تتداخل مع إشارة من الحليلة (ق) من الفائدة. تعقيد الطيفي من الأيونات المحيطة جنبا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من المركبات داخل العينات البيولوجية يتطلب اقتران IR-MALDESI (وغيرها من مصادر MSI المحيطة) إلى درجة عالية من الدقة الإعلام وعالية حل الطيف كتلة السلطة، قاوك وتلك المستخدمة في هذه التجربة، من أجل تسهيل جيل من الخرائط أيون دقيقة ومفصلة.
في هذا العمل، وكان يستخدم الأشعة تحت الحمراء للكشف عن MALDESI التوزيع المكاني لمجموعة متنوعة من المركبات الذاتية في مختلف أجهزة الماوس كله. وكانت ذروة اختيار خوارزمية في MSiReader قادرة على تحديد أكثر من 500 أيونات الأنسجة محددة، وكثير منها الدهون من فئات مختلفة. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها لرصد وقت واحد توزيع المركبات الخارجية، مثل المخدرات والأيض المخدرات، في مختلف الأجهزة 24،25. معيار الذهب للدراسات توزيع المخدرات كامل الجسم كامل الجسم تصوير الإشعاع الذاتي 24. ومع ذلك، وهذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا، ويتطلب المركبات رديولبلد، وغير قادرين على التمييز بين المخدرات الأم وعناصره لأنه لا يوفر معلومات عن التركيب الجزيئي للالتحاليل. كامل الجسم MSI مع IR-MALDESI تلتف هذه القضايا، في حين تمكن أيضاالتحليل التي يتعين القيام بها في البيئة المحيطة، دون إضافة مصفوفات العضوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IR-MALDESI Source | Custom-made | N/A | Please refer to references 4 and 12 for an in-depth discussion of IR-MALDESI source development. |
| Q Exactive Plus | Thermo Scientific | Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Methanol, HPLC Grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| Tunable mid-IR Laser | Opotek Inc. | IR Opolette | Tunable 2,700-3,100 nm IR OPO laser |
| Nitrogen Gas | Arc3 Gases | AG S-NI300-5.0 | Grade 5.0 high purity nitrogen gas cylinder (300) |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM 1950 | Cryomicrotome |
| High Profile Microtome Blades | Leica Biosystems | 3802123 | Leica DB80HS |
| Mounting Medium (OCT) | Leica Biosystems | 3801480 | Surgipath FSC 22 mounting medium |
| Cryostat Specimen Disc | Leica Biosystems | 14047740045 | 40 mm diameter |
| Glass Microscope Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, selected, pre-cleaned |
References
- Mcdonnell, L. A., Heeren, R. M. A.
- Chughtai, K., Heeren, R. M. A. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem. Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. Atmospheric Pressure Mass Spectrometry Imaging. Encycl. Anal. Chem. , (2014).
- Sampson, J. S., Hawkridge, A. M., Muddiman, D. C. Generation and detection of multiply-charged peptides and proteins by matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (12), 1712-1716 (2006).
- Robichaud, G., Barry, J. A., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. Infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) imaging source coupled to a FT-ICR mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (1), 92-100 (2013).
- Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI Mass Spectrometry Imaging of Biological Tissue Sections Using Ice as a Matrix. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
- Barry, J. A., et al. Mapping Antiretroviral Drugs in Tissue by IR-MALDESI MSI Coupled to the Q Exactive and Comparison with LC-MS/MS SRM Assay. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
- Rosen, E. P., Bokhart, M. T., Ghashghaei, H. T., Muddiman, D. C. Influence of Desorption Conditions on Analyte Sensitivity and Internal Energy in Discrete Tissue or Whole Body Imaging by IR-MALDESI. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 26, 899-910 (2015).
- Nelson, K. A., Daniels, G. J., Fournie, J. W., Hemmer, M. J. Optimization of whole-body zebrafish sectioning methods for mass spectrometry imaging. J. Biomol. Tech. 24 (3), 119-127 (2013).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194 (2007).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Nazari, M., Muddiman, D. C. Polarity Switching Mass Spectrometry Imaging of Healthy and Cancerous Hen Ovarian Tissue Sections by Infrared Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI). Analyst. 141, 595-605 (2016).
- Hsu, C. C., et al. Design and Application of a Low-Temperature Peltier-Cooling Microscope. J. Pharm. Sci. 85 (1), 70-74 (1996).
- Jurchen, J. C., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. MALDI-MS imaging of features smaller than the size of the laser beam. J. Am. Soc.Mass Spectrom. 16 (10), 1654-1659 (2005).
- Nazari, M., Muddiman, D. C. Cellular-level mass spectrometry imaging using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) by oversampling. Anal. Bioanal. Chem. 407 (8), 2265-2271 (2015).
- Rosen, E. P., Bokhart, M. T., Nazari, M., Muddiman, D. C. Influence of C-Trap Ion Accumulation Time on the Detectability of Analytes in IR-MALDESI MSI. Anal. Chem. 87, 10483-10490 (2015).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Schramm, T., et al. ImzML - A common data format for the flexible exchange and processing of mass spectrometry imaging data. J. Proteomics. 75 (16), 5106-5110 (2012).
- Race, A. M., Styles, I. B., Bunch, J. Inclusive sharing of mass spectrometry imaging data requires a converter for all. J. Proteomics. 75 (16), 5111-5112 (2012).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
- Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug. Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Res. 35, D527-D532 (2007).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J. Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Takai, N., Tanaka, Y., Inazawa, K., Saji, H. Quantitative analysis of pharmaceutical drug distribution in multiple organs by imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 26 (13), 1549-1556 (2012).
- Liu, J., Gingras, J., Ganley, K. P., Vismeh, R., Teffera, Y., Zhao, Z. Whole-body tissue distribution study of drugs in neonate mice using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (2), 185-190 (2014).
