Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

Published: March 24, 2016 doi: 10.3791/53942
Automatic Translation
1, 1, 1
1W. M. Keck FTMS Laboratory for Human Health Research, Department of Chemistry, North Carolina State University

Abstract

מקורות יינון אמביינט עבור ספקטרומטריית מסה (MS) כבר נכתבו תלי תלים של עניין רב בעשור האחרון. יינון electrospray desorption לייזר בסיוע מטריקס (MALDESI) היא דוגמה של שיטות כאלה, שבו תכונות של יינון / desorption לייזר בסיוע מטריקס (MALDI) (למשל, טבע פעמו של desorption) ו יינון electrospray (ESI) (למשל,-יינון רך ) משולבים. אחד היתרונות הגדולים של MALDESI הוא צדדי הטבוע בו. בניסויים MALDESI, גידול אולטרה סגול (UV) או אינפרא אדום (IR) לייזר יכול לשמש כדי לרגש עמוק ומהדהד מטריצה ​​אנדוגני או אקסוגני. הבחירה של מטריקס אינו אנליטי תלויה, ותלוי אך ורק על אורך גל לייזר המשמשים עירור. בניסויים IR-MALDESI, שכבה דקה של קרח מופקד על פני השטח מדגם כקובץ מטריקס ספיגת אנרגיה. הגיאומטריה מקור IR-MALDESI בצורה מיטבית באמצעות תכנון ניסויים (DOE) עבור ניתוח של דגימות נוזלי, כמו גם Biolדגימות רקמה ogical. יתר על כן, מקור הדמיה חזק IR-MALDESI פותח, שבו מתכונן ליזר אמצע IR מסונכרן עם במת translational XY מבוקרת מחשב ו ספקטרומטר מסת מתח גבוה לפתרון. ממשק המשתמש הגרפי מותאם אישית (GUI) מאפשר בחירת המשתמש של שיעור החזרה של הלייזר, מספר יריות לכל voxel, צעד בגודל של הבמה מדגם, והעיכוב בין desorption ולסרוק אירועים המקור. IR-MALDESI נעשה שימוש במגוון רחב של יישומים כגון ניתוח משפטי של סיבים וצבעים ו MSI סעיפי רקמה ביולוגיים. הפצה של analytes שונים הנעים בין מטבוליטים אנדוגני xenobiotics אקסוגניים בתוך קטעי רקמה ניתן למדוד לכמת באמצעות טכניקה זו. הפרוטוקול המובא בכתב היד הזה מתאר שלבים עיקריים הדרושים IR-MALDESI MSI סעיפים רקמות הגוף כולו.

Introduction

הדמיה ספקטרומטריית מסה (MSI) במצב microprobe כרוך desorption של המדגם מתוך שטח על ידי קרן (ליזר או יונים) במקומות דיסקרטיים על פני השטח של מדגם. בכל נקודת סריקה, ספקטרום המוני מופק ואת ספקטרום רכשה, יחד עם המיקום המרחבי שממנו הם נאספו, ניתן להשתמש בו כדי למפות analytes רבים בו זמנית בתוך המדגם. ללא תווית זו אופן הדמיה מצמידים את הרגישות והסגוליות של ספקטרומטריית מסה סייעו MSI להיות אחד התחומים המתפתחים בקצב מהיר ביותר ב ספקטרומטריית מסה 1,2.

desorption הליזר בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) הוא שיטת היינון הנפוצה ביותר בשימוש עבור מנתח MSI. עם זאת, הצורך מטריקס אורגני ואת דרישות ואקום של MALDI לדגמן מגבלות משמעותיות על שחזור, התפוקה מדגם, ועל סוגי דגימות כי ניתן לנתח באמצעות השיטה. מספר בלחץ אטמוספרי (AP) ioשיטות nization פותחו בשנים האחרונות לעקוף הגבלות אלו 3. שיטות יינון סביבה אלו מאפשרות ניתוח של דגימות ביולוגיות בסביבה היא הרבה יותר קרוב למצב הטבעי שלהם ולפשט צעדי הכנת מדגם לפני הניתוח. יינון electrospray desorption לייזר בסיוע מטריקס (MALDESI) הוא דוגמה 4,5 שיטת יינון כזה.

בניסויי IR-MALDESI, שכבה דקה של קרח מופקדת על פני שטח הרקמות כמו מטריקס ספיגת אנרגיה. דופק ליזר אמצע IR נספג על ידי מטריקס הקרח, ומקל desorption של חומרים ניטראליים מפני השטח על ידי עמוק ומהדהד שרגשה את OH מתיחת מצב של מים. המחיצה הניטראלית desorbed לתוך הטיפין הטעונות של electrospray מאונך והם שלאחר המיונן באופן ESI-כמו 4-6. התוספת של מטריקס קרח אקסוגניים עדיפה על פני הסתמכות על המים אנדוגני ברקמות מאז זה עוזר acלספור עבור וריאציות תכולות מים בתאי רקמות שונים, הוכח כדי לשפר desorption 6 ולשפר שפע יון ידי ~ 15-לקפל 7,8 בניסויי הדמית רקמות.

בעבודה זו, אנו מנצלים IR-MALDESI MSI לעורר חלוקת מטבוליטים על פני איברים שונים בגוף בילוד העכבר כולו. סקירה של פרמטרים מתכווננים של מקור IR-MALDESI ניתן, ואת הצעדים הנדרשים עבור הדמיה מוצלחת של קטעי רקמה הם הפגינו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את כל הצעדים דרושים לביצוע ניסויי IR-MALDESI MSI. מעמיק פרטים על הגיאומטריה אופטימיזציה של מקור IR-MALDESI וסינכרון שלו עם לייזר, הבמה, ספקטרומטר מסה ניתן למצוא במקום אחר 5,6. דגימות בעלי חיים רקמות בשימוש בפרוטוקול זה התקבלו על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) וצפון קרוליינה תקנות סטייט.

1. רקמות הכנה

  1. כן אמבט קרח איזופנטאן / יבש על ידי צבת ~ 200 מיליליטר של איזופנטאן בכוס נקיה בתוך מכולה משנית של קרח יבש במנדף. יש להשתמש בכפפות מגן ומשקפי בטיחות בכל עת בעת טיפול איזופנטאן / באמבט קרח יבש הרקמה.
    1. להרדים גור עכבר בילוד כולה בת 2 ימים על ידי יתר Avertin (משקל גוף 7.5 מ"ג / g), ולאחר מכן להקפיא את הרקמות באמבטית קרח איזופנטאן / היבשה לשמר מבנה רקמות. השתמש טרום נקיזוג מלקחי ed למקום ולהסיר את גור עכבר cryomold מאמבטית קרח איזופנטאן / היבשה. אחסן את רקמת פלאש-קפואים ב -80 ° C עד הניתוח.
  2. שימוש בכפפות מגן, למרוח שכבה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) הרכבה בינונית לדיסק דגימת cryostat 40 מ"מ. הנח בעדינות את העכבר הקפוא כולו על בעל דגימה צופה אוקטובר לדבוק עכבר לדיסק בכיוון הרצוי עבור חתך.
    הערה: Oct משמש אך ורק לדבוק הרקמה לדיסק הדגימה עבור חתך. אל תטמיע רקמות לחלוטין ב אוקטובר ולהימנע עודף כפי אוקטובר הוא ידוע כבעל השפעות מזיקות על ניתוח MSI. תקשורת נוספים, כגון ג'לטין, שניתן להשתמש בהם כדי קריו להטביע את הרקמה לפני פריסתו זה 9.
  3. מניחים את הדיסק (עם אוקטובר וסעיף רקמות) על בעל מדגם פלטייה ב לחצן ההפעלה פלטייה cryostat ולחץ. חכה 10 דקות עבור מדגם לבוא שיווי משקל תרמי.
  4. מניח את דיסק הדגימות (עם הרקמה רכובה עלזה) בתוך מחזיק דיסק, ופונה אל הרקמות למטה למישור הרצוי לניתוח. פורס את הרקמה למקטעים של לעובי הרצוי ב -20 ° C באמצעות microtome הסיבובית שוכנה בתוך cryostat 10.
    הערה: כל הגוף מנתח, פורסים את הרקמה לתוך סעיפים 25 מיקרומטר עבה כדי לשמור על שלמות רקמות. עבור אזורים קטנים יותר (למשל, כבד, מוח, כליות), פורס את הרקמה למקטעים של 10 מיקרומטר בעובי.
    1. השתמש צלחת זכוכית אנטי-רול למנוע קטע רקמה פרוס להידרדר. השתמש צינור ואקום cryostat ומברשות כדי להסיר שאריות רקמה רצויות. לאחר הרקמות מחולקות, השתמש להב השומר כדי לכסות את להב microtome חד כדי למנוע פגיעות גוף.
  5. סעיף עכבר אוריינט על צלחת הדגימה להפשיר הר לשקופית מיקרוסקופ זכוכית מראש לנקות על ידי הביא את השקופית הקרובה ככל האפשר אל קטע הרקמה, מבלי לגעת בו 10.
    הערה: התנסות כמותית MSIמפעלים, מעיל השקופית עם תקן פנימי באמצעות מרסס פנאומטי אוטומטי לפני הרכבה הרקמה, ולהפשיר-הר קטע רקמה בשקופית מצופה 11.
  6. הסר את להב microtome נהג חתך ברקמת באמצעות מפליט להב, ובבטחה להתעלמות להב במיכל "חדה פסולת" המתאים.
  7. שמור את השקופית זכוכית בתוך cryostat עד שלב 3.2 לשמור cryopreservation של הרקמה.

2. IR-MALDESI הכנה / כיול

  1. הפעל את הלייזר אמצע IR והפעל את יישום השליטה לייזר במחשב. בחר את אורך הגל הרצוי באמצעות יישום שליטה לייזר מסופק על ידי היצרן. ניסויי IR-MALDESI בדרך כלל מבוצעים 2,940 ננומטר.
    הערה: בניסויים שנערכו לאחרונה חקרו את התלות של אורכי גל ליזר אמצע IR ומטריצת הקרח עם הבדלים ציינו המופיעים להיות אנליטי 8 ספציפיים.
  2. הפעל את הצביבקר דואר, להפעיל את תוכנית בקרת משתמש מותאם אישית (RASTIR), ולכייל את עמדת הבמה באמצעות כפתור הבית.
  3. כן פתרון electrospray. בדרך כלל, להשתמש 50:50 (v / v) מתנול / מים עם 0.2% חומצה פורמית עבור הממס electrospray במצב חיובי יון. בחר את הרכב ממס electrospray פי הניסוי. למשל, להשתמש אמוניום הידרוקסיד 5 מ"מ כמו המשתנה 'electrospray עבור יישומי הדמיה במצב שלילי-יון.
    הערה: קוטביות מיתוג IR-MALDESI MSI, להשתמש חומצה 1 מ"מ אצטית כמו הצירוף. משנה זה נמצא אופטימלי עבור קבלת אות יציבה לשחזור בשני מצבי positive- ושלילי-יון 12.
  4. ממלאים מזרק 1 מ"ל עם ממס electrospray, ולשטוף את נימי סיליקה עם ממס החדש.
  5. יישר פולט ESI על ציר עם כניסת MS באמצעות פרמטרי המקור כגון מרחק ESI-spot, ספוט כניסת מרחק, גובה מדגם, וקצב זרימת ממס כי כבר אופטימיזציה באמצעות DO הסטטיסטי E לניתוח סעיפי רקמות 6. הערה: ראה איור 1 עבור מתאר סכמטי פרמטרים וערכים אלה אופטימיזציה עבור MSI סעיפי רקמות.
  6. הפעל את electrospray ולהעריך את יציבותו (> 10 דקות) על ידי ניטור הנוכחי יון הכולל (עוית) אשר, בשלב זה, מורכב תרכובות הסביבה בלבד. בדרך כלל, וריאציה TIC של <10% לעומת 10-15 דקות הוא אינדיקציה של יציבות טובה.

איור 1
באיור 1. IR-MALDESI סכמטי ופרמטרים. (א) סכמטי של התקנת מקור IR-MALDESI (לא בקנה מידה) ואת הפרמטרים מתכווננת. (ב) ערכי פרמטרים אופטימליים עבור הדמיה של קטעי רקמה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כותרת "> 3. הפקדה של הקרח מטריקס

  1. זהירות: כבו את electrospray לפני הצבת מדגם על הבמה.
  2. הנח את רקמת רכוב הפשרה לצלחת מדגם IR-MALDESI בתוך תצוגת המצלמה.
  3. להפוך את הידות בטוחות ברורות של פולט ESI ולהפעיל מחדש את electrospray.
  4. סגור את דלת הגישה של מתחם IR-MALDESI המקור ויקיא עם חנקן יבש כדי למנוע התעבות של מים על פני השטח של הרקמה. לאחר הלחות היחסית בתוך מגיע במארז <3%, להדליק את אספקת החשמל DC (~ 12 V) לצלחת פלטייה, אשר תקרר את צלחת המדגם. הערה: תהליך הקירור בשלב מקורר פלטייה נדון בפירוט במקום אחר 13.
  5. מצנן את הבמה כדי -9 ° C, לאפשר לרקמות הרכובות לבוא שיווי משקל תרמי (~ 5-10 דקות).
  6. עצור טיהור חנקן לחשוף את הרקמה על הלחות היחסית הסביבה על ידי פתיחת דלת גישת המקור. שכבה דקה של קרח תופקד על השיתוףמשטח ld הבמה פלטייה רכוב קטע רקמה עקב desublimation מים מהאוויר.
    הערה: אם רמת הלחות היחסית במעבדה היא מתחת 10-15%, במקום כוס מים חמים בתוך המארז כדי להקל על ההיווצרות של שכבת מטריקס קרח.
  7. לאחר שכבת מטריקס הקרח נוצר, לסגור את דלת הגישה ולהפעיל מחדש את זרימת חנקן יבש כדי להפחית את הלחות היחסית ל 10 ± 2%. התאם את קצב זרימת החנקן לשמור על הלחות יחסית ברמה זו, נמצא באופן אמפירי להיות יתרת היווצרות קרח סובלימציה לשמור על שכבה מתמדת של קרח לאורך כל הניסוי 6.

4. קליטת נתוני הדמיה ספקטרומטריית מסה

  1. באמצעות GUI RASTIR (איור 2), להזיז את הבמה למצב ניתוח על ידי לחיצה על כפתור "LASER עמדה". השתמש דיודה התאמת לייזר כדי להבטיח האזור מחוץ רקמות יהיה ablated. לירות אפילו ירייה לייזר בתוך מחדש מחוץ רקמותגיון לכייל את הלייזר לקזז ביחס תצוגת המצלמה. לחצו על כפתור ה "אש מבחן לייזר" כדי לעדכן את המיקום לייזר.
  2. חזור אל "מיקום המצלמה" ולעדכן את העמדה לייזר RASTIR ידי הצבת reticle יישור לייזר על המקום אבלציה לייזר (איור 2-1).
  3. לחץ על האזור של עניין (ROI) כפתור ולהתאים את הגודל והמיקום של ROI עבור קטע רקמה להיות מנותח (איור 2-2). פרמטרי קלט ניסיוני מתאימים, כגון גודל צעד X ו- Y כיוונים (במ"מ) (איור 2-3), ואת שם קובץ MSI בתיבת "שם פרויקט" (איור 2-4).
    1. כאשר ציור החזר על השקעה, כולל חלק מחוץ רקמות המשמשות שליטה. השתמש בסעיף מחוץ רקמה זו לקטיף השיא (שלב 5.4).
      הערה: הקוטר desorption (גודל נקודה) של הלייזר על הרקמה הוא כ 150 מיקרומטר; עם זאת, החלטות מרחבית גבוהה ניתן להשיג על ידי using 14,15 השיטה לדגימת יתר.
  4. בחר את תדירות לייזר המתאים מהתיבה הנפתחת, מספר פעימות לייזר לכל voxel (ערכים שלמים), ואת עיכוב בין ההדק לייזר ורכישת אות ספקטרומטר מסה (איור 2-5). בדרך כלל משתמשים בשני פעימות לייזר לכל voxel ב 20 הרץ עד desorb חומר לחלוטין בתוך ניסויים IR-MALDESI MSI, עם זמן השהיה של 10 מילי-שניות כדי לאפשר יונים שנוצר להגיע מסת Analyzer למדידת 5.
    הערה: בחר את שיעור החזרה הגבוה ביותר כי לייזר הוא מסוגל לפעול. זה לאחרונה הוצג ששימוש שיעור החזרה גבוה ישפר detectability אנליטי 16.

איור 2
ממשק משתמש איור 2. לתפעול IR-MALDESI MSI. מסך של תוכנית בקרת סריקה RASTIR מוצג. הפעולות שיש לבצע כדי Performing ניסוי MSI הם (1) איתור המקום לייזר, (2) ציור ההחזר על ההשקעה, (3) בחירת גודל הבמה צעד (במ"מ), (4) מתן שם לקובץ, (5) בחירת המספר הנכון של דפקי voxel יחד עם שיעור החזרה הרצוי (6) בדיקת רשימת הדמית התקנת MS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. בחר פרמטרים ספקטרומטר מסה כגון מצב יינון, מתח electrospray, קצב זרימה ממס, טמפרטורת נימים, ואת זמן ההזרקה בתוכנת ספקטרומטר מסה. עיין בטבלה 1 דוגמה של הפרמטרים המשמשים כל הגוף IR-MALDESI MSI.
    הערה: בשל המורכבות של דגימות ביולוגיות וחוסר שיטות הפרדת MSI מנתח, מקור IR-MALDESI הוא מצמיד את כושר הפרדה גבוה מכשיר דיוק מסה גבוה. שיטת רכישה ניתן לטעון עבור analyses כגון ניטור תגובה מקביל (PRM) 7 או קוטביות מיתוג 12 MSI.
  2. לאחר כל הפרמטרים (לייזר, הבמה, ספקטרומטר מסה) נבחרו, למקם את MS במצב "לחיצת יד" לסינכרון, והתחל רכישת MS.
  3. באמצעות תוכנת הדמיה RASTIR, לאמת את כל השלבים checklist (איור 2-6) הושלמו על ידי סימון התיבות, וטען את התוכנית. לאחר התוכנית נטענה, על הלחצן "הפעל" יהיה זמין. לחץ על הפעל כדי להתחיל רכישת אות MSI.
  4. עם השלמת הניסוי הדמיה, לעצור רכישת ספקטרומטר מסה ומניחים המכשיר במצב המתנה. בטל טיהור חנקן אל המתחם, את אספקת כוח צלחת פלטייה, ומכבה את הבקר הבמה ליזר.
  5. פתח את דלת הגישה, להסיר את הקצה הפולט electrospray מתוך מתחם המקור, ולהסיר את כניסת MS מתכת מחוממת הארוכה באמצעות כפפות מגן. זהירות: המורחבת מתכת MS הכניסה תהיה חמה מאוד.
  6. לבישת כפפות ומשקפי בטיחות, לנקות את כניסת נימי מתכת המוגברת שיש באמבטיה קולה חומצה חנקתית 15% במשך 10 דקות, ולאחר מכן במי HPLC כיתה במשך 10 דקות, ולבסוף מתנול HPLC כיתה במשך 10 דקות. ייבש את כניסת מתכת נימים תחת זרם של חנקן, והכנס לתוך MS. הערה: השלך הממס מכולות פסולת המתאים לאחר מכן.
R "style =" width: 216px; "> 3.8-4.2 kV רוחב: 216px; "> 140,000
פָּרָמֶטֶר ערך
מצב יינון חִיוּבִי
מתח electrospray
מרכך קצב הזרימה 2 μl / min
טמפרטורת נימים 275 ° C
טווח סריקה מ '/ z 250-1,000
סוג סריקה סריקה מלאה
זמן הזרקה 110 msec
כושר ההפרדה

לוח 1. פרמטרים כלי המשמש כל הגוף IR-MALDESI MSI.

ניתוח 5. נתונים

  1. המר קבצי הנתונים הגולמיים שנוצרו על ידי המכשיר לפורמטי נתונים כגון mzXML 17 או 18 imzML בתוכנה חופשית כגון MSConvert 17 imzML ממיר 19.
  2. התחל v1.0 MSiReader, תוכנת קוד פתוח שפותחה עבור ניתוח של מתח גבוה-בפתרון נתוני MSI 20, במחשב עיבוד ייעודי. טען את קובץ הדמיה על MSiReader. עבור ממשק המשתמש של MSiReader וכמה תכונות מובנית שלה, ראה איור 3.
  3. צור מפות יון של analytes של הריבית על ידי המזינים m / z שלהם ולבחור חלון המתאים m / z חלקים למיליון (ppm) או תומסון (Th) (איור 3-1). לקבלת כושר הפרדה גבוהה (RP) מכשיריםלבחור חלון בטווח נמוך עמודים לדקה.
    הערה: חלון m / z המתאים תלוי RP ודיוק מדידת מסה (MMA) של המכשיר כי מקור IR-MALDESI מצמיד.
  4. בהמשך לפרש את הנתונים באמצעות תכונות מובנות כגון אינטרפולציה (איור 3-2), נורמליזציה (איור 3-3), כיסוי תמונה אופטי (איור 3-4), ואת שיא קטיף (איור 3-5) 20.

איור 3
איור 3. ממשק משתמש של MSiReader; v1.0 20. לאחר שקובץ נטען לתוך התוכנה, יון מפות של analytes עניין מוצגות על-ידי (1) המזין את m / z וסובלנות עמודים לדקה או Th. ניתוח נוסף כגון (2) ביון או (3) נורמליזציה יכול להתבצע גם. תמונה אופטית של הרקמות יכולה גם להיות מיובאת גבי עםמפות היון (4) עבור ויזואליזציה טובה יותר. לקבלה ממוקדת מנתח את השיא לקטוף פונקציה (5) ניתן להשתמש כדי לחלץ פסגות רקמות ספציפיות על ידי בחירת האזור של רקמה (קו אדום) ואזור התייחסות מחוץ רקמות (קופסא ירוקה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. השתמש בפונקציה לקטוף השיא כדי ליצור רשימה של ערכים רקמות ספציפיות m / z באמצעות קריטריונים המוגדרים על ידי המשתמש. הערה: אלגוריתם PeakFinder משתמש הבדלי ספקטרום מסה ממוצע של שני אזורים. ערכי m / z אלה ניתן לחפש אז מול מסדי נתונים המטבוליט כגון METLIN 21 או MAPS ליפיד. 22
    1. עיין איור 3 עבור דוגמא בחירה באזור רקמות נחקרת (ROI מצולע מגנט) ובאזור התייחסות מחוץ רקמות (ROI מצולע הירוק).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התמונות המוצגות איור 4 מראה את הפריסה המרחבית של מטבוליטים באיברים שונים בקטע רקמות הגוף כולו. ערכי m / z הייחודי לאזורים ספציפיים בגוף נמצאו באמצעות MSiReader PeakFinder, ואחריו עיבוד יצווה עבור דור תמונה. כלי שכבת תמונה (איור 3-4) שמש כדי ליישר את התמונה האופטית נלקחה לפני בתצהיר מטריצת קרח עם מפות היון שהתקבלו. כולסטרול הוא ציין בכל סוגי הרקמות כצפויים מהתפקיד המבני שלה קרום תא חי (איור 4 א), ואילו מטבוליטים אחרים תערוכת הפצות נפרדות בתוך איברים ספציפיים או תאים ברקמות (איור 4 ב-ד).

איור 4
איור 4. נציג IR-MALDESI תמונות MSI; לספירה. ארבעה metaboliמפות יון טה הוכחת לוקליזציה של תרכובות בתוך קטע עכבר כולו. כיתת השומנים היא מבוארת בפינה הימנית התחתונה של כל תמונה. התמונה האופטית של קטע הרקמה כבר גבי בתוך מפות יון על מנת לסייע עם להדמיה של איברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול לעיל מתאר את השלבים העיקריים לביצוע ניסוי MSI IR-MALDESI. תהליך יישום מטריקס (סעיף 3) לוקח כ 20 דקות, אשר דומה תהליך יישום מטריקס טיפוסי לניסויים MALDI MSI ידי סובלימציה או תרסיס ציפוי באמצעות מרסס רובוטית. יתר על כן, IR-MALDESI אינו מסתמך על חלוקה של analytes לתוך קריסטלים מטריקס 6, ומטריצת הקרח ניתן להשתמש אוניברסלית לכל analytes קשר המוני, גודלם, או התכונות הכימיות. בנוסף, שימוש קרח מבטל את היונים הקשורות מטריקס בטווח m / z נמוך שנצפה בניסויי MALDI טיפוסיים 23.

למרות כל הצעדים במסגרת הניסוי נדרשים כדי להפיק נתוני MSI איכות, יציבות electrospray במהלך הניסוי חיונית דור IR-MALDESI יון לשחזור. הלחות היחסית צריכה להיות במעקב במהלך ניסוי הדמיהלשמור על שכבת מטריקס קרח קבועה. Desorption IR-MALDESI הוא יחסית אטום בעובי של קרח 6; עם זאת, כמה ניסויי הדמיה יכולים לקחת שעות מרובות שבו שכבת קרח יכולה להיות בעייתית אם לא פיקוח. לשם כך, בקר פרופורציונאלי-נפרדות-נגזרות (מח"ש) שולב לאחרונה למקור כדי לנטר את הטמפרטורה ולחות יחסית בתוך המארז, ולהתאים אותם לפי צורך.

מאז MSI כרוך דגימה ישירה של analytes ממשטחים, הפרדות chromatographic לא יכול לשמש כדי להפחית את המורכבות של הספקטרום. בנוסף, סביבת יונים נוכחות בסביבת המעבדה יכולים להפריע אות מ אנליטי (הים) של עניין. מורכבות הרפאים מן יוני סביבה בשילוב עם מגוון רחב של תרכובות בתוך דגימות ביולוגיות דורשות הצימוד של IR-MALDESI (ומקורות MSI סביבה אחרים) ברמת דיוק מסה גבוהה ספקטרומטרים המונית מתח גבוהה לפתרון, such לזו שבוצעה בניסוי זה, על מנת להקל על הדור של מפות יון מדויקות ומפורטות.

בעבודה זו, IR-MALDESI שמש לחשוף את הפריסה המרחבית של מגוון מטבוליטים אנדוגני באיברים שונים של עכבר כולו. השיא לקטוף אלגוריתם MSiReader הצליח לזהות יותר מ -500 יוני רקמות ספציפיות, שרבים מהם היו שומנים ממעמדות שונות. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לפקח על חלוקת תרכובות אקסוגניים בו זמנית, כגון סמי מטבוליטים תרופה, באיברים שונים 24,25. תקן הזהב עבור מחקרים כגון פיזור התרופה בגוף הגוף כולו הוא הגוף כולו autoradiography 24. עם זאת, שיטה זו היא גוזלת זמן דורשת תרכובות רדיואקטיבי, ולא ניתן להבחין בין תרופת הורה מטבוליטים שלו מאז הוא אינו מספק מידע על המבנה המולקולרי של analytes. MSI של כל הגוף עם IR-MALDESI עוקף בעיות אלה, תוך שהיא מאפשרתהניתוח להתבצע בסביבת הסביבה, ללא תוספת של מטריצות אורגניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IR-MALDESI Source Custom-made N/A Please refer to references 4 and 12 for an in-depth discussion of IR-MALDESI source development.
Q Exactive Plus  Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer
Water, HPLC Grade Burdick & Jackson  AH365-4
Methanol, HPLC Grade Burdick & Jackson  AH230-4
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
Tunable mid-IR Laser Opotek Inc. IR Opolette Tunable 2,700-3,100 nm IR OPO laser
Nitrogen Gas Arc3 Gases AG S-NI300-5.0 Grade 5.0 high purity nitrogen gas cylinder (300)
Cryostat Leica Biosystems CM 1950 Cryomicrotome
High Profile Microtome Blades Leica Biosystems 3802123 Leica DB80HS
Mounting Medium (OCT) Leica Biosystems 3801480 Surgipath FSC 22 mounting medium
Cryostat Specimen Disc Leica Biosystems 14047740045 40 mm diameter
Glass Microscope Slides VWR 48312-003 Frosted, selected, pre-cleaned

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mcdonnell, L. A., Heeren, R. M. A. Imaging Mass Spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 26, 606-643 (2007).
  2. Chughtai, K., Heeren, R. M. A. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem. Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
  3. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. Atmospheric Pressure Mass Spectrometry Imaging. Encycl. Anal. Chem. , (2014).
  4. Sampson, J. S., Hawkridge, A. M., Muddiman, D. C. Generation and detection of multiply-charged peptides and proteins by matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (12), 1712-1716 (2006).
  5. Robichaud, G., Barry, J. A., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. Infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) imaging source coupled to a FT-ICR mass spectrometer. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (1), 92-100 (2013).
  6. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI Mass Spectrometry Imaging of Biological Tissue Sections Using Ice as a Matrix. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
  7. Barry, J. A., et al. Mapping Antiretroviral Drugs in Tissue by IR-MALDESI MSI Coupled to the Q Exactive and Comparison with LC-MS/MS SRM Assay. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
  8. Rosen, E. P., Bokhart, M. T., Ghashghaei, H. T., Muddiman, D. C. Influence of Desorption Conditions on Analyte Sensitivity and Internal Energy in Discrete Tissue or Whole Body Imaging by IR-MALDESI. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 26, 899-910 (2015).
  9. Nelson, K. A., Daniels, G. J., Fournie, J. W., Hemmer, M. J. Optimization of whole-body zebrafish sectioning methods for mass spectrometry imaging. J. Biomol. Tech. 24 (3), 119-127 (2013).
  10. Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (3), e194 (2007).
  11. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  12. Nazari, M., Muddiman, D. C. Polarity Switching Mass Spectrometry Imaging of Healthy and Cancerous Hen Ovarian Tissue Sections by Infrared Matrix-Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI). Analyst. 141, 595-605 (2016).
  13. Hsu, C. C., et al. Design and Application of a Low-Temperature Peltier-Cooling Microscope. J. Pharm. Sci. 85 (1), 70-74 (1996).
  14. Jurchen, J. C., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. MALDI-MS imaging of features smaller than the size of the laser beam. J. Am. Soc.Mass Spectrom. 16 (10), 1654-1659 (2005).
  15. Nazari, M., Muddiman, D. C. Cellular-level mass spectrometry imaging using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (IR-MALDESI) by oversampling. Anal. Bioanal. Chem. 407 (8), 2265-2271 (2015).
  16. Rosen, E. P., Bokhart, M. T., Nazari, M., Muddiman, D. C. Influence of C-Trap Ion Accumulation Time on the Detectability of Analytes in IR-MALDESI MSI. Anal. Chem. 87, 10483-10490 (2015).
  17. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  18. Schramm, T., et al. ImzML - A common data format for the flexible exchange and processing of mass spectrometry imaging data. J. Proteomics. 75 (16), 5106-5110 (2012).
  19. Race, A. M., Styles, I. B., Bunch, J. Inclusive sharing of mass spectrometry imaging data requires a converter for all. J. Proteomics. 75 (16), 5111-5112 (2012).
  20. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
  21. Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug. Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
  22. Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Res. 35, D527-D532 (2007).
  23. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J. Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
  24. Takai, N., Tanaka, Y., Inazawa, K., Saji, H. Quantitative analysis of pharmaceutical drug distribution in multiple organs by imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 26 (13), 1549-1556 (2012).
  25. Liu, J., Gingras, J., Ganley, K. P., Vismeh, R., Teffera, Y., Zhao, Z. Whole-body tissue distribution study of drugs in neonate mice using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (2), 185-190 (2014).

Tags

Bioengineering גיליון 109 הדמיה ספקטרומטריית מסה IR-MALDESI בדיקת רקמות הדמיה של כל הגוף מטבוליטים ליפידים
הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nazari, M., Bokhart, M. T.,… More

Nazari, M., Bokhart, M. T., Muddiman, D. C. Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI). J. Vis. Exp. (109), e53942, doi:10.3791/53942 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter