Dieser Artikel stellt eine bequeme und schnelle Methode für die verschiedenen neuronalen Zellpopulationen im zentralen Nervensystem von Xenopus – Embryonen zu visualisieren mit Immunfluoreszenzanfärbung auf Abschnitte.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
In Vertebraten umfaßt die Entwicklung des zentralen Nervensystems mehrere ausgeprägteres aufeinanderfolgenden Stufen. Der erste Schritt ist neurale Induktion, wenn naive ektodermalen Zellen zu einem neuronalen Schicksals angegeben sind und nicht als epidermal Schicksal. Mehrere miteinander verbundene Regulationsmechanismen sind 1,2 in dieser Phase in Xenopus und anderen Modellsystemen beteiligt. Dieser Prozess wird in erster Linie koordiniert von sezernierten Faktoren , die von der zugrunde liegenden Mesoderm erzeugt, wie chordin, Noggin und Follistatin 3-7. Nach neurale Induktion Beenden einer Untergruppe von neuralen Vorläuferzellen in den Zellzyklus und beginnen, in einem Verfahren, das als primäre Neurogenese bezeichnet unterscheiden. Nicht alle neuronalen Vorläufern unterscheiden zu diesem Zeitpunkt. Die verbleibenden neuralen Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wodurch die Stammzellpools Aufrechterhaltung für das weitere Wachstum des zentralen Nervensystems während der Entwicklung benötigt und bis ins Erwachsenenalter.
Diese prneurale Vorläuferzellen oliferating zeichnen sich durch die Expression des SRY (Geschlecht bestimmende Region Y) -Box 3 (SOX3) Gen 8-11 aus. Die andere Population von Zellen, die Ausfahrt des Zellzyklus und zu einem differenzierten Schicksal begehen, werden durch die Expression des Differenzierungs Genmarker, Tubulin Beta 2B Klasse IIb identifiziert (tubb2b, N-Wanne) und Myelintranskriptionsfaktor 1 (Myt1) 14.12. Solche differenzierte neuronale Zellen schließlich zu unterschiedlichen Gruppen von Neuronen geben , einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Motor, inter- und sensorisch in verschiedenen Bereichen innerhalb des Neuralrohrs 15-17 positioniert Neuronen.
Während erhebliche Anstrengungen zur Aufdeckung der Regulierungsmechanismen gewidmet wurden, die die Strukturierung und das Schicksal das Bestimmen von Ereignissen in der vorderen Neuroektoderms regeln, weniger Aufmerksamkeit wurde auf die Untersuchung der neurogenen Ereignisse, die folgenden Voraussetzungen erfüllt sind dieAnfangsmusterstadium. Tatsächlich, Signaltransduktion, Transkriptions Vorschriften sowie post-translationale Modifikationen sind alle in diesem späteren Zeitpunkt beteiligt, sowohl zeitlich als auch Abstammungslinie Spezifikation während der Neurogenese 18-20 steuern. Weitere Untersuchungen in dieser Mechanismen erfordert eine zuverlässige Methode, um leicht zu visualisieren und verschiedene Populationen von neuronalen Zellen zu unterscheiden. Die oben erwähnte neurale Marker, einschließlich, SOX3, Myt1 und N-Wanne, kann ein Mittel bereitstellen , um diese verschiedenen Zellpopulationen zu identifizieren und so die notwendigen Grundlagen für die Bereitstellung 21-23 die zugrunde liegenden Mechanismen der neuronalen Differenzierung offenbaren.
Obwohl differentielle Markierung von neuronalen Zellpopulationen in anderen Modellorganismen, relativ wenige Studien , die die Xenopus – System in ihrem vollsten in dieser Hinsicht ausgenutzt nachgewiesen. Dies ist vor allem auf eine geringe Zahl kompatibler Antikörper, die zuverlässig die verschiedenen neur identifizierenonal Zellpopulationen im Neuralrohr. Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Differenzierung in frühen Xenopus – Embryonen über Immunfärbung, die für die Untersuchung von primären Neurogenese in Xenopus eine robuste und bequeme Ansatz bietet. Dieses Protokoll sollte eine ausreichende Führung für die Forscher in der frühen Entwicklung von Xenopus zentralen Nervensystems zwischen Stufe 26 und Stufe 45 interessierte geben.
Hier haben wir für die Visualisierung primären Neurogenese in Xenopus – Embryonen eine bequeme und effiziente Methode zu demonstrieren. Dieses Verfahren erlaubt die Bewertung der verschiedenen Arten von neuronalen Zellen, einschließlich der neuronalen Stammzellen und differenzierten primären Neuronen unter Verwendung von zelltypspezifischen Markern.
Das Protokoll ist in der Regel robust mit sehr hoher Reproduzierbarkeit. Für Embryonen , die in vordefinierten Schraffur Stufen sind (dh bis 28 zu Stufe), empfehlen wir manuell die Vitellinmembran vor der Fixierung zu entfernen , da diese Embryonen erlaubt vor der Fixierung vollständig zu entrollen. Dies ist besonders wichtig, wenn die Embryonen in relativ frühen Stadien (vor dem Schlüpfen) Sammeln, da gebogenen Embryonen extrem schwierig in der gewünschten Orientierung innerhalb des Montagekammer anzuordnen. Wir haben keinen Verlust an Immunogenität nach MEMFA oder PFA Fixation somit zusätzliches Antigen Retrieval Schritt ist nicht notwendig für dieses Protokoll erfahren. Darüber hinaus ist dieseimmunostaining Verfahren kann in Proben werden von chromogenen / Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung durchgeführt. In einem solchen Szenario wird empfohlen, die Protease K Behandlungsschritt während der in situ-Hybridisierungsprotokoll zu überspringen. Nach chromogenen / fluoreszierendes Substrat Reaktion können Proben mit TBS gewaschen und in Fischgelatinelösung in ähnlicher Weise eingebettet MEMFA / PFA festen Proben. Probenfläschchen kann durch Umwickeln der Phiolen in Aluminiumfolie vor Licht geschützt werden, wenn Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung wird später zusammen mit Immunofluoreszenzfärbung abgebildet werden.
In einigen Fällen kann Embryonen schrumpfen übermäßig nach Gelatine Penetration. Dies wird höchstwahrscheinlich entweder durch unzureichende Fixierung oder unzureichende TBS-Triton Extraktion verursacht. Stellen Sie sicher, dass Embryonen für mindestens 2-3 Stunden oder vorzugsweise über Nacht bei 4 ° C in PFA / MEMFA wurden behoben. Wenn das Problem weiterhin besteht, erhöhen Sie die Waschzeit von TBS-Triton bis 3 für 1 Stunde.
Während Kryo-Sectioning, variieren unterschiedliche Eigenschaften aufweisen kann die Steifigkeit des Probenblocks als verschiedene Chargen von Fischgelatine. Dieses Problem kann teilweise durch Einstellen der Temperatur des Mikrotom kompensiert werden. Eine niedrigere Temperatur wird in einem "härteren" Probenblock führen jedoch unter übermäßiger niedriger Temperatur Abschnitt der Probenblock wird knackig und schwierig. Einige Feinabstimmung oder Praxis (unter Verwendung von Mock Probenblöcke ohne Embryonen) vor jeder Schnitte kann vor von Vorteil sein, zu verwenden, um auf besonders wertvollen Proben.
Ein häufig auftretendes Problem während des Schneidens ist die dünnen Abschnitte manchmal auf die dicke Glasplatte zu kleben neigen, anstatt bleiben flach auf dem Stahl Bühne. Dies kann insbesondere dann sein, zu stören, da sie ständig den kontinuierlichen Schneidens unterbricht. Solche Fälle sind in der Regel durch eine von zwei Ursachen haben: die Profilkammer und (vor allem) die dicke Glasplatte nicht kalt genug sein, oder übermäßige statische Ladung auf der Maschine und die operator, vor allem bei trockenem Wetter. Ersteres kann durch Umklappen der Temperatur des Abschnitts Kammer und dem Verlassen der Glasplatte innerhalb extra Zeit (möglicherweise über Nacht) gelöst werden; und die letztere durch den Kryostaten richtig geerdet. Verbinden der Metalloberfläche des Kryostaten mit einem Metallhahn oder eine ähnliche Wasserrohrsystem aus Metall kann eine alternative Möglichkeit, die statische Aufladung zu lösen. Nach jedem Gebrauch sollte die dicke Glasplatte gut mit nicht-korrosive Reinigungsmittel (wie zB Geschirrspülmittel), von Reinstwasser, besprüht mit reinem Ethanol und eingewickelt im Tuch Papier gespült gewaschen werden, um die Oberfläche und Kanten vor Beschädigung zu schützen.
Die Antikörper im Protokoll aufgelistet sind in der Regel spezifisch und wir begegnen selten unspezifische Adsorption oder hohen Hintergrundsignal. Es sollte beachtet werden, dass bei Verwendung von hitzeinaktiviertem Ziege / Lammserum als Blockierungsmittel, übermäßige Hitze-Inaktivierung (wie durch die Bildung von fluffy Fällmittel im Serum sichtbar) solltenwerden, da diese Fällmittel vermieden sind sekundäre Antikörper sehr attraktiv und kann an eine Quelle hohen Hintergrund bei.
Es ist möglich und manchmal erwünscht, Doppelfärbung durchzuführen verschiedenen Populationen neuronaler Zellen gleichzeitig zu visualisieren. Solche Doppelfärbung ist möglich und führt in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse mit den folgenden Kombinationen: SOX3 / N-Wanne oder Myt1 / N-Wanne. Jedoch Doppelfärbung von SOX3 und Myt1 wird durch die Tatsache erschwert, daß die beiden Antikörper sind sowohl aus Kaninchen Ursprungs. Wir haben mehrere Antikörper direkte Markierung Kits getestet, jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse wurden beobachtet (niedriges Signal-Rausch-Pegel), möglicherweise aufgrund des Fehlens von Signalverstärkung von sekundären Antikörpern. Ein möglicher Ansatz , um dieses Problem zu umgehen , wäre zu transgenen Linien in Xenopus erhöhen, wie weiter unten erläutert.
Eine der Hauptbeschränkungen dieses Protokolls besteht darin, dass, während dieses Protokoll könnte ausreichend distinguish zwei Pools von neuronalen Zellen, nämlich die SOX3-exprimierenden neuralen Stammzellpool und die Myt1 exprimierenden differenzierten Neuronen, es fehlt die Fähigkeit, unterschiedliche Subpopulationen von differenzierten Neuronen zu offenbaren. Solche Subpopulationen, die einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, primäre Motorneuronen, Inter und sensorischen Neuronen, werden in der Regel durch ihre differentiell exprimierten Markergene 28-30 charakterisiert. Wie oben erwähnt, in dem Spalt die jüngsten Fortschritte bei der Entwicklung von Multicolor – in situ – Hybridisierung kombiniert mit Antikörper-basierte Immundetektionsverfahren in Xenopus – Embryonen füllen kann 31 diese Subpopulationen von differenzierten Neuronen für mögliche Untersuchung zu offenbaren. Alternativ, wie in Mäuse – Modell gezeigt wurde, wäre es auch , eine umfassende Reihe von zelltypspezifischen Antikörper zu erzeugen gewünscht werden , um so unterschiedliche Zellpopulationen in Xenopus unterscheiden.
Es istauch erwähnenswert , dass als Ergänzung zu dieser Methode, die jüngsten Fortschritte in der optischen Bildgebung und Bildanalyse, wie Multiphotonen – Mikroskopie, 3D – Rekonstruktion und Segmentierung kann auch nach ersten Einschätzungen angewendet werden , zu erwähnen , umfassendere Beobachtungen von Xenopus – Oozyten zu erreichen sowie frühen Embryonen, insbesondere unter einer Live – Einstellung 32,33. Daher Proliferation, Differenzierung und Bewegung von neuronalen Zellen in lebenden Tieren zu verfolgen, würde es wünschenswert sein , eine oder mehrere transgene Linien zu schaffen, die von zelltypspezifischen Promotor angetrieben fluoreszierende Proteine beherbergen Live Beobachtung solcher Zellpopulationen in der frühen Xenopus zu ermöglichen Embryonen. Die Einrichtung eines X. laevis Linie mit β-Tubulin – Promotor neurospezifische tauGFP und ihre Anwendungen fahren haben ein schönes Beispiel 23,34 zur Verfügung gestellt. Mit den vollständigen Promotor – Sequenzen von sowohl SOX3 und Myt1 in Wirbeltiere gekennzeichnet 35-37, ist es shOuld relativ leicht zusätzliche transgenen Linien in Xenopus zu etablieren , die sowohl umfassend die Xenopus – Community und einer allgemeineren Bereich der primären Neurogenese Forschung beitragen soll.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Prof. Michael Klymkowsky an der Universität von Colorado in Boulder und Prof. Nancy Papalopulu in der Universität Manchester für die freundliche anti-SOX3 und anti-Myt1 Antikörper bietet, beziehungsweise. Wir danken den Mitgliedern des Papalopulu Labor für ihre interessante Vorschläge in diesem Protokoll zu entwickeln. Diese Arbeit wurde von zwei Healing Foundation studentships zu SZ und JL unterstützt, zwei Projektförderung von der Healing Foundation SZ / EA und JL / EA jeweils ein Programm Zuschuss aus dem Wellcome Trust zu EA (WT082450MA) und eine institutionelle strategische Unterstützung Zuschuss aus dem Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |