מאמר זה מציג שיטה נוחה ומהירה המאפשר הדמיה אוכלוסיות תאים עצביים שונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus באמצעות מכתים immunofluorescent על הסעיפים.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
בבעלי חוליות, התפתחות מערכת העצבים המרכזית מורכבת מכמה שלבים ייחודיים עדיין רצופים. הצעד הראשון הוא אינדוקציה עצבית, כאשר תאי ectodermal נאיביים מפורטים כלפי גורל עצבי ולא גורל אפידרמיס. מספר מנגנוני ויסות מחוברים מעורבים בשלב זה ב Xenopus ומערכות מודל אחר 1,2. תהליך זה מתואם בעיקר על ידי גורמים מופרשים המיוצרים על ידי mesoderm הבסיסי, כגון chordin, שגולגולת, ו follistatin 3-7. לאחר אינדוקציה עצבית, קבוצת משנה של אבות עצביים לצאת ממעגל התא מתחיל להבחין בתהליך המכונה נוירוגנזה ראשוני. לא כל מבשרי נוירונים להבדיל בשלב זה. התאים העצביים מבשרי הנותרים ממשיכים להתרבות, ובכך לשמר את הברכה תא גזע הדרושים להמשך צמיחה של מערכת עצבים המרכזית ברחבי פיתוח לבגרות.
אלה יחסי ציבורoliferating תאים עצביים מבשר מאופיינים הביטוי שלהם של Sry (Y באזור בקביעת מין) -box 3 (sox3) גן 8-11. אוכלוסיית אחרים של תאים, אשר היציאה מחזור התא ומתחייבים גורל הבדיל, מזוהים על ידי הביטוי של סמנים גן בידול, טובולין, בטא 2B בכיתה IIb (tubb2b, N-גיגית) ו גורם שעתוק המיאלין 1 (myt1) 12-14. כזה תאים עצביים הבדיל בסופו של דבר להצמיח קטגוריות שונות של נוירונים כולל, אך לא רק, מנוע, הבין, ואת עצב סנסורי ממוקם באזורים נפרדים בתוך הצינור העצבי 15-17.
בעוד מאמצים משמעותיים הוקדשו לחשוף את מנגנוני ויסות ששולטים דפוסי גורל קביעת אירועי neuroectoderm הקדמי, פחות תשומת לב נעשה על בחקירת אירועי נוירוגנית המתרחשים בעקבותבשלב דפוסים ראשוני. ואכן, הולך אותות, תקנות תעתיק, כמו גם שינויים שלאחר translational מעורבים כולם בפעילות בשלב מאוחר זה, זה לשלוט מפרט עיתוי שושלת במהלך הנוירוגנזה 18-20. בדיקות נוספות לתוך המנגנונים האלה דורשות שיטה אמינה לדמיין בקלות להבחין אוכלוסיות שונות של תאים עצביים. הנ"ל סמנים עצביים, כולל, Sox3, Myt1, ו- N-האמבטיה, יכולה לספק אמצעי לזיהוי אוכלוסיות תאים שונים אלה, ובכך לספק את היסודות הדרושים חושף את המנגנון הבסיסי של בידול עצבי 21-23.
למרות תיוג הפרש של אוכלוסיות תאים עצביות הודגם באורגניזמים מודל שניים, מחקרים מעטים יחסית נצלו את מערכת Xenopus במלואם בעניין זה. זאת בעיקר בשל מחסור של נוגדנים תואמים באופן מהימן לזהות את neur השונהאוכלוסיות תאים onal בצינור העצבי. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשר הדמיה והבחנה עצבית בעוברי Xenopus מוקדם באמצעות immunostaining, המספק גישה חזקה ונוחה לחקירת נוירוגנזה עיקרי Xenopus. פרוטוקול זה אמור לתת הדרכה מספקת לחוקרים המעוניינים בהתפתחות המוקדמת של מערכת העצבים המרכזית Xenopus בין שלב 26 ושלב 45.
כאן אנו מדגימים שיטה נוחה ויעילה המאפשרת הדמית נוירוגנזה עיקרית בעוברי Xenopus. שיטה זו מאפשרת הערכה של סוגים שונים של תאים עצביים, כולל תאי גזע עצביים ועל נוירונים העיקרי מובחן באמצעות סמנים סוג תא ספציפי.
הפרוטוקול הוא איתן בדרך כלל עם רמה גבוהה מאוד של שחזור. עבור עוברים נמצאים בשלבים טרום בקיעה (כלומר עד לשלב 28), אנו ידניים ממליצים להסיר את קרום vitelline לפני הקיבוע כמו זו מאפשרת עוברת כדי ליישר באופן מלא לפני הקיבעון. זה חשוב במיוחד בעת איסוף עוברים בשלבים מוקדמים יחסית (לפני הבקיעה), מאז עוברים כפוף קשה מאוד לארגן את הכיוון הרצוי בתוך החדר גובר. אנחנו לא חווינו אובדן של immunogenicity לאחר קיבוע MEMFA או PFA ומכאן צעד יחזור אנטיגן נוסף אינו הכרחי בפרוטוקול זה. בנוסף, זההליך immunostaining יכול להתבצע דגימות chromogenic / ניאון הכלאה באתרה. בתרחיש כזה, מומלץ לדלג על שלב הטיפול K פרוטאז במהלך הפרוטוקול הכלאה באתרו. לאחר תגובת מצע chromogenic / פלורסנט, דגימות ניתן לכבס עם TBS ו מוטבעות פתרון ג'לטין דגים בצורה דומה דגימות קבועות MEMFA / PFA. בקבוקונים לדוגמא יכולים להיות מוגנים מפני אור על ידי עטיפת הבקבוקונים בנייר אלומיניום אם ניאון הכלאה באתרו יהיה צלם יחד עם מכתים immunofluorescent מאוחר יותר.
במקרים מסוימים, עובר עלולים להתכווץ בצורה מוגזמת אחרי חדירת ג'לטין. זו נגרמת ככל הנראה על ידי אחד קיבעון מספיק או מיצוי TBS-טריטון מספיק. ודא כי עוברי תוקנו PFA / MEMFA לפחות 2-3 שעות או רצוי לילה ב 4 מעלות צלזיוס. אם הבעיה נמשכת, להגדיל את זמן הכביסה של TBS-טריטון 3 עבור שעה 1.
במהלך קריו-sectioנינג, הנוקשות של לחסום מדגם עשוי להשתנות כמו קבוצות שונות של ג'לטין דגים יש מאפיינים שונים. בעיה זו ניתן לפצות באופן חלקי על ידי התאמת הטמפרטורה של microtome. טמפרטורה נמוכה יותר תגרום גוש "קשה" מדגם אולם מתחת לטמפרטורה נמוכה מוגזמת בלוק הדגימה נעשה פריך וקשה סעיף. חלק כיוונון עדין או בפועל (באמצעות בלוקי מדגם מדומים ללא עוברי) לפני כל חתך עשויה להועיל לפני השימוש על במיוחד דגימות יקרות.
בעיה בדרך נתקלה במהלך החתך היא החלקים הדקים לפעמים נוטים להדביק על צלחת זכוכית העבה ולא להישאר שטוחים על במת הפלדה. זה יכול להיות במיוחד לשבש שכן הוא כל זמן קוטע את תהליך החתך הרציף. במקרים כאלה בדרך כלל נגרמים על ידי אחת משתי סיבות: תא הסעיף ו (בעיקר) צלחת הזכוכית העבה לא להיות קר מספיק, או מוגזם מטען סטטי על המכונית ואת operator, במיוחד במזג אוויר יבש. הראשון ניתן לפתור על ידי לכבות את הטמפרטורה של חדר הסעיף ולהשאיר צלחת הזכוכית בתוך תוספת זמן (אולי הלילה); ואת האחרון על ידי הארקת cryostat כראוי. חיבור משטח המתכת של cryostat לברז מתכת או מערכת צינורות מים דומה עשויה מתכת יכולה להיות דרך חלופית כדי לשחרר את המטענים סטטיים. לאחר כל שימוש, צלחת זכוכית עבה יש לשטוף היטב עם חומר ניקוי שאינו מאכל (כגון נוזל כלים), שטופים במים ultrapure, ריססו עם אתנול טהור, עטוף בנייר מגבת כדי להגן על פני השטח ואת הקצוות מפגיעה.
הנוגדנים המפורטים בפרוטוקול הם ספציפיים בדרך כלל רק לעתים נדירות אנו נתקלים ספיחה לא ספציפית או אות רקע גבוהה. יצוין כי, אם באמצעות מומת חום בסרום עיזים / טלה כסוכן חסימה,-איון חום מוגזם (כמו דמיינו כתוצאה מהיווצרותם של נמהר פלאפי בנסיוב) צריךלהימנע ככל נמהר זה מאוד אטרקטיבי כדי נוגדנים משני ועשוי לתרום מקור רקע גבוה.
זה אפשרי, ולפעמים רצוי, כדי לבצע מכתים כפול לדמיין אוכלוסיות שונות של תאים עצביים בו זמנית. כזה מכתים כפול אפשרי ובאופן כללי נותן תוצאות משביעות רצון עם השילובים הבאים: Sox3 / N-אמבט או Myt1 / N-אמבט. עם זאת, פעמים המכתימות של Sox3 ו Myt1 מסתבך בשל העובדה כי שני נוגדנים הם ממקור ארנב. בדקנו כמה ערכות תיוג ישירות נוגדנים, אולם לא נצפו תוצאות משביעות רצון (אות לרעש ברמה נמוכה), ככל הנראה בשל חוסר הגברת אות מ נוגדנים משני. גישה אפשרית אחת לעקוף בעיה זו תהיה להעלות קווים מהונדסים Xenopus, כמפורט להלן.
אחת המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה הוא, כי בעוד פרוטוקול זה יכול מספיק distinguish שתי ברכות עיקריות של תאים עצביים, כלומר, ברכת תא גזע העצבית להביע Sox3 ואת נוירונים הבדילו להביע Myt1, היא חסרו את היכולת לחשוף תת-אוכלוסיות שונות של נוירונים בדיל. כזה תת אוכלוסיות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, הנוירונים מוטוריים עיקריים, interneurons, ואת עצב סנסורי, בדרך כלל מאופיינים הגנים סמנו דיפרנציאלי הביע שלהם 28-30. כאמור, התקדמות בפיתוח ססגוניות הכלאה באתרו בשילוב עם שיטת זיהוי immunofluorescence מבוסס נוגדנים בעוברי Xenopus יכולה למלא את הפער לחשוף תת-אוכלוסיות אלו של נוירונים בדיל לחקירת פוטנציאל 31. לחלופין, כפי הודגם במודל עכברים, זה היה גם להיות רצוי להעלות מערך מקיף יותר של נוגדנים מסוג התא ספציפי להבחין אוכלוסיות תאים שונות כגון Xenopus.
זהגם ראוי להזכיר כי, כתוספת בשיטה זו, התקדמות הדמיה אופטיות ניתוח תמונה, כגון מיקרוסקופיה multiphoton, שחזור 3D, ופילוח, ניתן ליישם גם לאחר הערכות ראשוניות להשיג תצפיות מקיפות יותר של ביציות Xenopus וכן עוברי מוקדם, במיוחד תחת חיה הגדרת 32,33. לכן, כדי לעקוב אחר התפשטות, בידול, ותנועה של תאים עצביים בבעלי חיים, זה היה להיות רצוי להקים אחד או יותר קווים מהונדסים כי נמל חלבוני ניאון מונעים על ידי אמרגן סוג תא ספציפי כדי לאפשר תצפית חיים של אוכלוסיות תאים כאלה בתחילת Xenopus עוברי. הקמת X. laevis קו עם אמרגן נוירו-ספציפי β טובולין נהיגת tauGFP ושימושיה ספק דוגמא יפה 23,34. עם רצפי אמרגן מלאים הוא sox3 ו myt1 המאופיין בבעלי חוליות 35-37, זה shולד להיות יחסי קל להקים קווי מהונדס נוספים Xenopus שאמור לתרום בהרחבה לשתי קהילת Xenopus ושדה כללי יותר של מחקר נוירוגנזה העיקרי.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים פרופ 'מיכאל Klymkowsky באוניברסיטת קולורדו בבולדר ופרופ' ננסי Papalopulu באוניברסיטת מנצ'סטר למתן חביב אנטי Sox3 ואנטי Myt1 נוגדנים, בהתאמה. אנו מודים לחברים במעבדת Papalopulu לקבלת הצעות תובנה שלהם בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי שני קרן ריפוי Studentships כדי SZ ו JL, שתי מלגות הפרויקט מטעם קרן ריפוי כדי SZ / EA ו JL / EA בהתאמה, מענק תוכנית אחת של קרן Wellcome כדי EA (WT082450MA), ומענק אחד אסטרטגית לתמיכה מוסדית מן קרן Wellcome [097,820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |