Данная статья представляет собой удобный и быстрый способ для визуализации различных популяций клеток нейронов в центральной нервной системе Xenopus эмбрионов с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания на участках.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
У позвоночных развитие центральной нервной системы включает в себя несколько отличительных еще последовательных этапов. Первым шагом является нейронная индукция, когда наивные эктодермальные клетки определяются по отношению к нейронной судьбы, а не эпидермальной судьбы. Несколько взаимосвязанных регуляторных механизмов вовлечены во время этой стадии в Xenopus и других модельных системах 1,2. Этот процесс в основном координируется секретируемых факторов , продуцируемых нижележащей мезодермы, таких как Chordin, башке и фоллистатина 3-7. После индукции нервной, подмножеством нервных клеток-предшественников выходят из клеточного цикла и начинают дифференцироваться в процесс называется первичным нейрогенеза. Не все нейрональные предшественники дифференцироваться в это время. Остальные нервные клетки-предшественники продолжают разрастаться, тем самым поддерживая пул стволовых клеток, необходимых для дальнейшего роста центральной нервной системы на протяжении развития и во взрослую жизнь.
Эти прoliferating нейронных клеток – предшественников , характеризуются их экспрессии SRY (пол определения область Y) -Box 3 (sox3) гена 8-11. Другая популяция клеток, которые выходят из клеточного цикла и совершить дифференцированной судьбы, определяются по экспрессии маркеров генов дифференцировки, тубулина, бета – 2B Класс IIb (tubb2b, N-ванна) и миелин транскрипционный фактор 1 (myt1) 12-14. Такие дифференцированные нервные клетки в конечном счете , приводят к различным категориям нейронов , включая, но не ограничиваясь этим, мотор, меж- и сенсорные нейроны , расположенные в различных областях в пределах нервной трубки 15-17.
Несмотря на значительные усилия были посвящены выявлению регуляторных механизмов, которые регулируют структурирование и судьбу определения событий в передней нейроэктодерме, меньше внимания было сделано по расследованию нейрогенные событий, которые происходят вслед заНачальный этап формирования рисунка. Действительно, передача сигнала, транскрипционные правила, а также пост-трансляционной модификации все вовлечены в этой поздней стадии, контролируя как временную , так и во время спецификации клонов нейрогенеза 18-20. Дальнейшие исследования этих механизмов требуется надежный способ легко визуализировать и различать различные популяции нервных клеток. Вышеупомянутый нейронных маркеров, в том числе, Sox3, Myt1, и N-ванна, может служить средством для идентификации этих различных клеточных популяций, обеспечивая тем самым необходимые основы для выявления основных механизмов нейрональной дифференцировки 21-23.
Хотя дифференциальная маркировка популяций нейронов клеток были продемонстрированы в других модельных организмах, относительно мало исследований использовал систему Xenopus в ее полноте в этой связи. Это происходит главным образом из-за скудности совместимых антител, которые надежно идентифицировать различные Neurпопуляции диагональных клеток в нервной трубки. Здесь мы опишем метод визуализации дифференцировку нейронов у ранних эмбрионов Xenopus с помощью иммунологического окрашивания, которая обеспечивает надежный и удобный подход для исследования первичного нейрогенеза в Xenopus. Этот протокол должен дать достаточное руководство для исследователей , заинтересованных в раннем развитии Xenopus центральной нервной системы между стадией 26 и стадии 45.
Здесь мы показываем , удобный и эффективный способ визуализации первичного нейрогенеза в Xenopus эмбрионов. Этот метод позволяет производить оценку различных типов нейронных клеток, в том числе нейрональных стволовых клеток и дифференцированных первичных нейронах с использованием маркеров типоспецифические клеток.
Протокол, как правило, прочный с очень высоким уровнем воспроизводимости. Для получения эмбрионов , которые находятся на предварительно вылупления стадии (т.е. до стадии 28), мы рекомендуем вручную удалить желточной оболочки до фиксации , поскольку это позволяет эмбрионы полностью выпрямите перед тем фиксации. Это особенно важно при сборе эмбрионов на относительно ранней стадии (до вылупления), так как согнутые эмбрионы чрезвычайно трудно организовать в нужной ориентации внутри монтажной камеры. Мы не испытали потерю иммуногенности после MEMFA или PFA фиксации, следовательно, дополнительной стадии поискового антигена не является необходимым для этого протокола. Кроме того, этотиммунным процедура может быть проведена в образцах из хромогенного / Флуоресцентный в гибридизация. В таком случае рекомендуется, чтобы пропустить протеазы K этап обработки во время на месте протокол гибридизации. После того, как хромогенный / люминесцентная реакции субстрата, образцы могут быть смыты с TBS и заливали в растворе желатина рыбы подобным способом к MEMFA / PFA фиксированных образцов. Примеры Флаконы могут быть защищены от света, обернув флаконов в алюминиевой фольги, если флуоресцентная гибридизация будут отображены вместе с иммунофлуоресцентного окрашивания позже.
В некоторых случаях, эмбрионы могут сжиматься чрезмерно после проникновения желатина. Это, скорее всего, вызвано либо недостаточной фиксации или недостаточной экстракции TBS-тритон. Убедитесь, что эмбрионы были зафиксированы в PFA / MEMFA в течение по меньшей мере 2-3 ч, или предпочтительно в течение ночи при температуре 4 ° С. Если проблема не устранена, увеличьте время моющей TBS-Тритона до 3 в течение 1 ч.
Во время крио-Sectioнин, жесткость образца блока может изменяться в разные партии рыбьего желатина обладают различными свойствами. Эта проблема может быть частично компенсированы путем регулирования температуры микротома. Более низкая температура приведет к более "жесткой" образец блока, однако при чрезмерном низкой температуре образец блок становится четким и трудно раздел. Некоторые из тонкой настройки или практики (с использованием фиктивных блоков выборки без эмбрионов) перед каждым секционирования может быть полезным перед использованием на особо ценные образцы.
Часто встречающимся проблемой во время секционирования является тонкие секции иногда имеют тенденцию придерживаться на толстую стеклянную пластину, а не остаются плоскими на сцене стали. Это может быть особенно срыве, так как он постоянно прерывает непрерывный процесс секционирования. Такие случаи, как правило, вызваны одной из двух причин: секция камеры и (особенно) толщиной стеклянная пластина не достаточно холодно, или слишком статический заряд на машины и оperator, особенно в сухую погоду. Первый может быть решена путем поворота вниз температуру секции камеры и оставляя стеклянную пластину в течение дополнительного времени (возможно, в течение ночи); а вторые правильно заземлении криостат. Подключение к металлической поверхности криостата к металлической водопроводной или аналогичной системы воды трубки из металла может быть альтернативный способ освободить статические заряды. После каждого использования, толстая стеклянная пластина должна быть тщательно промывают неагрессивных моющих средств (например, жидкость для мытья посуды), промывать сверхчистой водой, опрыскивают чистым этанолом, и завернутый в полотенце бумаги для защиты поверхности и кромок от повреждений.
Антитела, перечисленные в протоколе, как правило, конкретными и мы редко сталкиваемся неспецифической адсорбции или высокий фоновый сигнал. Следует отметить, что, при использовании инактивированной нагреванием коза / баранина сыворотки в качестве блокирующего агента, чрезмерное тепло-инактивацию (в качестве визуализированы образованием рыхлого осадка в сыворотке) должнаследует избегать, поскольку это осадителем является весьма привлекательным для вторичных антител, и может вносить вклад в источник высокого фона.
Можно, а иногда и желательно, чтобы выполнить двойное окрашивание для визуализации различных популяций нервных клеток одновременно. Такое двойное окрашивание возможно и в целом дает удовлетворительные результаты при следующих комбинациях: Sox3 / N-ванна или Myt1 / N-ванна. Тем не менее, дважды окрашивание Sox3 и Myt1 осложняется тем фактом, что оба антитела оба из кроличьего происхождения. Мы проверили несколько антител прямые комплекты маркировки, однако не наблюдалось никаких удовлетворительных результатов (низкий сигнал-шум уровня), возможно, из-за отсутствия усиления сигнала от вторичных антител. Одним из возможных подходов , чтобы обойти эту проблему , было бы поднимать трансгенных линий в ооцитах Xenopus, как описано ниже.
Одним из основных ограничений этого протокола является то, что, в то время как этот протокол может достаточно диstinguish два основных пулов нервных клеток, а именно Sox3 экспрессирующих нейронные пул стволовых клеток и Myt1-выражающие дифференцированные нейроны, ему не хватает способности выявить различные субпопуляции дифференцированных нейронов. Такие субпопуляции, которые в том числе, но не ограничиваются ими, первичные моторные нейроны, интернейроны и сенсорные нейроны, как правило , характеризуются их дифференциально экспрессируется маркерных генов 28-30. Как уже упоминалось выше, последние достижения в развитии многоцветной гибридизация в сочетании с антителами на основе метода обнаружения иммунофлюоресценции в Xenopus эмбрионов в может заполнить пробел , чтобы выявить эти субпопуляции дифференцированных нейронов для потенциального расследования 31. В качестве альтернативы, как это было продемонстрировано в модели мышей, было бы также быть желательно , чтобы поднять более полный набор антител типа специфических клеток различать такие разные клеточные популяции в Xenopus.
этоСтоит также отметить , что, как дополнение к этому методу, последние достижения в области оптических изображений и анализа изображений, такие как многофотонной микроскопии, 3D – реконструкции и сегментации, также могут быть применены после того, как первоначальные оценки для достижения более комплексных наблюдений в Xenopus ооцитах, а также ранних эмбрионов, особенно при живой обстановке 32,33. Таким образом, для отслеживания пролиферации, дифференцировки и перемещение нейрональных клеток в живых животных, было бы желательно , чтобы создать один или более трансгенных линий , которые укрывают флуоресцентные белки движимый промотора типоспецифичной клеток , чтобы позволить живое наблюдение таких клеточных популяций в начале Xenopus эмбрионов. Создание X. Laevis линия с нейро-специфический β-тубулина промотор , запускающий tauGFP и его приложения обеспечили хороший пример 23,34. С полной последовательности промотора обоих sox3 и myt1 у позвоночных характеризуется 35-37, то шульд быть относительно легко установить дополнительные трансгенные линии в Xenopus , которые должны способствовать обширно как к сообществу Xenopus и более общей области первичного исследования нейрогенеза.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора Майкла Klymkowsky в Университете Колорадо в Боулдере и профессор Нэнси Papalopulu в Университете Манчестера за любезно предоставленные анти-Sox3 и анти-Myt1 антител, соответственно. Мы благодарим членов лаборатории Papalopulu за их содержательные предложения в процессе разработки этого протокола. Эта работа была поддержана двумя Healing Foundation Studentships до SZ и JL, два гранта по проекту от врачебного фонда до SZ / EA и JL / ЕА соответственно, грант одной программы из Wellcome Trust в EA (WT082450MA), а также один грант Institutional стратегической поддержки от Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |