यह लेख वर्गों पर immunofluorescent धुंधला का उपयोग Xenopus भ्रूण के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विभिन्न न्यूरोनल सेल आबादी visualizing के लिए एक सुविधाजनक और तेजी से विधि प्रस्तुत करता है।
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
रीढ़ में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास के कई विशिष्ट अभी तक लगातार चरणों शामिल हैं। पहले कदम के तंत्रिका प्रेरण, जब भोली बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं को एक एपिडर्मल भाग्य के बजाय एक तंत्रिका भाग्य की ओर निर्दिष्ट कर रहे है। कई परस्पर विनियामक तंत्र Xenopus और अन्य मॉडल प्रणाली 1,2 में इस चरण के दौरान शामिल कर रहे हैं। इस प्रक्रिया में मुख्य रूप से इस तरह के chordin, नोगिन, और follistatin 3-7 के रूप में अंतर्निहित mesoderm द्वारा उत्पादित secreted कारकों द्वारा समन्वित है। तंत्रिका प्रेरण के बाद, तंत्रिका progenitors के एक सबसेट सेल चक्र से बाहर निकलें और एक प्रक्रिया के रूप में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस करने के लिए भेजा में अंतर करने के लिए शुरू करते हैं। सभी न्यूरोनल व्यापारियों के इस समय में अंतर नहीं। शेष तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत जिससे स्टेम सेल पूल विकास भर में और वयस्कता में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के निरंतर विकास के लिए आवश्यक बनाए रखने में बढ़ना जारी है।
ये जनसंपर्कतंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत oliferating sry (लिंग का पता लगाने क्षेत्र वाई) -box 3 (sox3) जीन 8-11 की उनकी अभिव्यक्ति की विशेषता है। कोशिकाओं के अन्य आबादी है, जो बाहर निकलने के सेल चक्र और एक विभेदित भाग्य के लिए प्रतिबद्ध है, भेदभाव जीन मार्कर, tubulin की अभिव्यक्ति, बीटा द्वारा पहचाने जाते हैं 2 बी वर्ग IIB (tubb2b, एन टब) और माइलिन प्रतिलेखन कारक 1 (myt1) 12-14। इस तरह के अलग-अलग neuronal कोशिकाओं अंततः सहित न्यूरॉन्स की विभिन्न श्रेणियों को जन्म देते हैं, लेकिन करने के लिए, मोटर सीमित नहीं है, अंतर है, और न्यूरल ट्यूब 15-17 के भीतर अलग-अलग क्षेत्रों में तैनात संवेदी न्यूरॉन्स।
जबकि महत्वपूर्ण प्रयास नियामक तंत्र है कि patterning और भाग्य पूर्वकाल neuroectoderm में घटनाओं का निर्धारण शासन को उजागर करने के लिए समर्पित कर दिया है, कम ध्यान तंत्रिकाजन्य कि घटनाओं के बाद हो जांच पर किया गया हैप्रारंभिक चरण patterning। दरअसल, संकेत पारगमन, ट्रांसक्रिप्शनल नियमों, साथ ही बाद translational संशोधनों यह सब बाद में मंच में शामिल कर रहे हैं, न्यूरोजेनेसिस 18-20 के दौरान दोनों समय और वंश विनिर्देश को नियंत्रित। इन तंत्रों में आगे की जांच के लिए एक विश्वसनीय विधि की आवश्यकता को आसानी से कल्पना और neuronal कोशिकाओं के विभिन्न आबादी भेद करने के लिए। उपर्युक्त सहित Sox3, Myt1 तंत्रिका मार्कर, और एन टब, इन अलग सेल आबादी की पहचान करने, इस प्रकार neuronal भेदभाव 21-23 की अंतर्निहित तंत्र खुलासा करने के लिए आवश्यक नींव प्रदान करने के लिए एक साधन प्रदान कर सकते हैं।
हालांकि न्यूरोनल सेल आबादी के अंतर लेबलिंग अन्य मॉडल जीवों में प्रदर्शन किया गया है, अपेक्षाकृत कुछ अध्ययनों से इस संबंध में अपनी पूरी करने के लिए Xenopus प्रणाली का शोषण किया है। इस संगत एंटीबॉडी के एक कमी है कि मज़बूती से विभिन्न Neur की पहचान करने के लिए मुख्य रूप से की वजह से हैन्यूरल ट्यूब में onal सेल आबादी। यहाँ, हम immunostaining, जो Xenopus में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस की जांच के लिए एक मजबूत और सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है के माध्यम से जल्दी Xenopus भ्रूण में neuronal भेदभाव visualizing के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल चरण 26 और 45 के बीच मंच Xenopus केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्रारंभिक विकास में रुचि शोधकर्ताओं के लिए पर्याप्त मार्गदर्शन देना चाहिए।
यहाँ हम Xenopus भ्रूण में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस visualizing के लिए एक सुविधाजनक और कुशल विधि का प्रदर्शन। इस विधि तंत्रिका कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, न्यूरोनल स्टेम कोशिकाओं और विभेदित प्राथमिक न्यूरॉन्स सेल प्रकार विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर के आकलन सहित परमिट।
प्रोटोकॉल आम तौर पर reproducibility के बहुत ही उच्च स्तर के साथ मजबूत है। भ्रूण कि पूर्व अंडे सेने के चरणों में हैं (यानी अप चरण के लिए 28), हम स्वयं निर्धारण करने से पहले पीतक झिल्ली को हटाने की सिफारिश के रूप में इस भ्रूण को पूरी तरह से निर्धारण से पहले फहरना करने के लिए अनुमति देता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब अपेक्षाकृत प्रारंभिक अवस्था में भ्रूण का संग्रह (सेने से पहले), के बाद से मुड़े भ्रूण बढ़ते कक्ष के अंदर वांछित अभिविन्यास में व्यवस्था करने के लिए बेहद मुश्किल हो जाता है। हम MEMFA या पीएफए निर्धारण इसलिए अतिरिक्त प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम के बाद प्रतिरक्षाजनकता की हानि का अनुभव नहीं है इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक नहीं है। इसके अलावा, इसimmunostaining प्रक्रिया सीटू संकरण में chromogenic / फ्लोरोसेंट से नमूने में बाहर किया जा सकता है। ऐसे परिदृश्य में, यह बगल में संकरण प्रोटोकॉल के दौरान प्रोटीज कश्मीर उपचार कदम को छोड़ सिफारिश की है। chromogenic / फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के बाद, नमूने टीबीएस से धोया और MEMFA / पीएफए तय नमूने के लिए एक समान तरीके से मछली जिलेटिन समाधान में एम्बेड किया जा सकता है। नमूना शीशियों एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर शीशियों यदि सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट बाद में immunofluorescent धुंधला के साथ एक साथ imaged किया जाएगा द्वारा प्रकाश से सुरक्षित किया जा सकता है।
कुछ मामलों में, भ्रूण जिलेटिन प्रवेश के बाद जरूरत से ज्यादा हटना सकता है। यह सबसे अधिक संभावना या तो अपर्याप्त निर्धारण या अपर्याप्त टीबीएस ट्राइटन निकासी के कारण होता है। सुनिश्चित करें कि भ्रूण या कम से कम 2-3 घंटे के लिए पीएफए / MEMFA में तय किया गया है अधिमानतः 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर। समस्या बनी रहती है, 1 घंटे के लिए 3 को बढ़ाने टीबीएस ट्राइटन के समय धुलाई।
क्रायो धारा के दौराननिंग, नमूना ब्लॉक की कठोरता भिन्न हो सकते हैं मछली जिलेटिन के रूप में विभिन्न बैचों अलग गुण होते हैं। इस समस्या को आंशिक रूप से microtome का तापमान समायोजन करके मुआवजा दिया जा सकता है। एक कम तापमान एक "कठिन" नमूना ब्लॉक हालांकि अत्यधिक कम तापमान के तहत नमूना ब्लॉक कुरकुरा और इस खंड के लिए मुश्किल हो जाता है में परिणाम होगा। कुछ ठीक ट्यूनिंग या अभ्यास प्रत्येक सेक्शनिंग से पहले (भ्रूण के बिना नकली नमूना ब्लॉकों का उपयोग) लाभकारी विशेष रूप से महत्वपूर्ण नमूनों पर उपयोग करने से पहले हो सकता है।
सेक्शनिंग के दौरान एक अधिक सामना करना पड़ा समस्या पतली वर्गों कभी कभी मोटी कांच की प्लेट पर छड़ी करने के बजाय स्टील मंच पर फ्लैट रहने के लिए करते हैं। यह विशेष रूप से बाधा पहुँचा के बाद से यह लगातार निरंतर सेक्शनिंग प्रक्रिया बीच में आता है हो सकता है। खंड कक्ष और (विशेष रूप से) मोटी कांच की प्लेट मशीन और ओ पर काफी ठंडा, या अत्यधिक स्थिर प्रभार नहीं किया जा रहा है: इस तरह के मामलों में आमतौर पर दो कारणों से एक के कारण होता हैperator, विशेष रूप से शुष्क मौसम में। पूर्व नीचे अनुभाग चैम्बर के तापमान मोड़ और अतिरिक्त समय (संभवतः रातोंरात) के लिए भीतर कांच की प्लेट छोड़ने करके हल किया जा सकता है; और ठीक से cryostat ग्राउंडिंग द्वारा उत्तरार्द्ध। एक धातु नल या इसी तरह पानी ट्यूबिंग प्रणाली धातु से बना करने के लिए cryostat की धातु की सतह कनेक्ट स्थिर प्रभार जारी करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका हो सकता है। प्रत्येक उपयोग के बाद, मोटी कांच की थाली, गैर संक्षारक डिटर्जेंट (जैसे तरल dishwashing के रूप में), ultrapure पानी से rinsed के साथ अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए शुद्ध इथेनॉल के साथ छिड़काव किया, और हानिकारक से सतह और किनारों की रक्षा के लिए तौलिया कागज में लिपटे।
प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध एंटीबॉडी आम तौर पर विशिष्ट हैं और हम शायद ही कभी अविशिष्ट सोखना या उच्च पृष्ठभूमि संकेत मुठभेड़। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, अवरुद्ध एजेंट, अत्यधिक गर्मी निष्क्रियता (के रूप में सीरम में शराबी तेज़ के गठन के द्वारा कल्पना) के रूप में गर्मी निष्क्रिय बकरी / भेड़ के बच्चे के सीरम का उपयोग करता है, तो चाहिएइस तेज़ रूप में बचा जाना अत्यधिक माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए आकर्षक है और उच्च पृष्ठभूमि का एक स्रोत के लिए योगदान कर सकते हैं।
यह संभव है, और कभी कभी, वांछित एक साथ neuronal कोशिकाओं के विभिन्न आबादी कल्पना करने के लिए डबल-धुंधला करने के लिए। ऐसे डबल धुंधला संभव है और आम तौर पर निम्नलिखित संयोजन के साथ संतोषजनक परिणाम देता है: Sox3 / एन-टब या Myt1 / एन-टब। हालांकि, Sox3 और Myt1 की डबल धुंधला तथ्य यह है कि दो एंटीबॉडी खरगोश मूल से दोनों कर रहे हैं से जटिल है। हम संभवतः माध्यमिक एंटीबॉडी से संकेत प्रवर्धन की कमी के कारण, कई एंटीबॉडी प्रत्यक्ष लेबलिंग किट, लेकिन कोई संतोषजनक परिणाम मनाया गया (कम संकेत करने वाली शोर स्तर) का परीक्षण किया है। इस समस्या को नाकाम करने के लिए एक संभव दृष्टिकोण के रूप में नीचे चर्चा की, Xenopus में ट्रांसजेनिक लाइनों को बढ़ाने के लिए किया जाएगा।
इस प्रोटोकॉल के मुख्य प्रतिबंध की है कि है, जबकि इस प्रोटोकॉल सकता है पर्याप्त di हैneuronal कोशिकाओं के दो मुख्य पूल stinguish, अर्थात्, Sox3 व्यक्त तंत्रिका स्टेम सेल पूल और Myt1 व्यक्त विभेदित न्यूरॉन्स, यह भेदभाव न्यूरॉन्स के विभिन्न उप आबादी को प्रकट करने की क्षमता का अभाव है। इस तरह के उप आबादी है, जो भी शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स, इन्तेर्नयूरोंस, और संवेदी न्यूरॉन्स, आम तौर पर उनके विभिन्न व्यक्त मार्कर जीन 28-30 की विशेषता है। जैसा कि ऊपर कहा, सीटू Xenopus भ्रूण में एंटीबॉडी आधारित immunofluorescence पहचान पद्धति के साथ संयुक्त संकरण में बहुरंगा के विकास में हाल के अग्रिमों के संभावित जांच के लिए 31 विभेदित न्यूरॉन्स की इन उप आबादी प्रकट करने के अंतराल में भर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, के रूप में चूहों मॉडल में प्रदर्शन किया गया है, यह भी Xenopus में इस तरह के अलग सेल आबादी भेद करने के लिए सेल प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी के एक अधिक व्यापक सेट को बढ़ाने के लिए वांछित किया जाएगा।
यह हैयह भी उल्लेख के लायक है कि इस विधि के लिए एक अतिरिक्त के रूप में, इस तरह के multiphoton माइक्रोस्कोपी, 3 डी पुनर्निर्माण, और विभाजन के रूप में ऑप्टिकल इमेजिंग और छवि विश्लेषण में हाल के अग्रिमों, भी के बाद प्रारंभिक आकलन Xenopus oocytes की अधिक व्यापक टिप्पणियों के साथ ही लक्ष्य को हासिल करने के लिए लागू किया जा सकता जल्दी भ्रूण, विशेष रूप से एक जीवित 32,33 स्थापना के अंतर्गत। इसलिए, प्रसार, भेदभाव, और जीवित पशुओं में neuronal कोशिकाओं के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए, यह एक या अधिक ट्रांसजेनिक लाइनों है कि सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित फ्लोरोसेंट प्रोटीन बंदरगाह जल्दी Xenopus में इस तरह के सेल आबादी का जीना अवलोकन अनुमति देने के लिए स्थापित करने के लिए वांछित किया जाएगा भ्रूण। एक एक्स की स्थापना न्यूरो विशिष्ट β ट्यूबिलिन प्रमोटर tauGFP और उसके आवेदन ड्राइविंग के साथ laevis लाइन एक अच्छा उदाहरण 23,34 प्रदान की है। दोनों sox3 और myt1 रीढ़ 35-37 में विशेषता से भरा प्रमोटर दृश्यों के साथ, यह श हैअपेक्षाकृत Xenopus में अतिरिक्त ट्रांसजेनिक लाइनों जो दोनों Xenopus सामुदायिक और प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के एक अधिक सामान्य क्षेत्र के लिए बड़े पैमाने पर योगदान देना चाहिए स्थापित करने के लिए आसान हो सकता है ould।
The authors have nothing to disclose.
हमारा अनुरोध विरोधी Sox3 और विरोधी Myt1 एंटीबॉडी उपलब्ध कराने के लिए क्रमश: बोल्डर में कोलोराडो विश्वविद्यालय में प्रोफेसर माइकल Klymkowsky और मैनचेस्टर विश्वविद्यालय में प्रो नैन्सी Papalopulu धन्यवाद। हम इस प्रोटोकॉल के विकास में उनके व्यावहारिक सुझाव के लिए Papalopulu प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद। इस काम के SZ और जीएल के लिए दो हीलिंग फाउंडेशन Studentships द्वारा समर्थित किया गया था, हीलिंग फाउंडेशन SZ / ईए और जीएल / ईए क्रमश: ईए के लिए वेलकम ट्रस्ट (WT082450MA) से एक कार्यक्रम अनुदान के लिए, और एक संस्थागत सामरिक सहायता अनुदान से दो परियोजना अनुदान वेलकम ट्रस्ट [097820 / Z / 11 / Z] से।
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |