I denna artikel presenteras en bekväm och snabb metod för att visualisera olika neuronala cellpopulationer i det centrala nervsystemet hos Xenopus embryon med hjälp av immunofluorescerande färgning på sektioner.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
I ryggradsdjur, utvecklingen av det centrala nervsystemet består av flera distinkta men på varandra följande steg. Det första steget är neural induktion, när naiva ektodermala celler specificeras mot en neural öde i stället för en epidermal öde. Flera sammankopplade regleringsmekanismer är involverade under denna fas i Xenopus och andra modellsystem 1,2. Denna process är i första hand samordnas av utsöndrade faktorer som produceras av den underliggande mesoderm, såsom chordin, noggin, och follistatin 3-7. Efter neural induktion, en delmängd av neurala stamceller ur cellcykeln och börjar differentiera i en process som kallas primär neurogenes. Inte alla neuronala prekursorer skilja vid denna tidpunkt. De återstående neurala prekursorceller fortsätter att föröka sig och därmed bibehålla stamcells poolen behövs för fortsatt tillväxt av det centrala nervsystemet under utveckling och i vuxen ålder.
dessa proliferating neurala prekursorceller kännetecknas av sin expression av SRY (kön bestämmande region Y) -box 3 (sox3) -genen 8-11. Den andra populationen av celler, som lämnar cellcykeln och engagera sig i en differentierad öde, identifieras genom uttrycket av differentiering genmarkörer, tubulin, beta 2B klass IIb (tubb2b, N-tub) och myelin transkriptionsfaktor 1 (myt1) 12-14. Sådana differentierade neuronala celler så småningom ge upphov till olika typer av nervceller, inklusive, men inte begränsat till, motor, internationell och sensoriska neuroner placerade i olika områden inom neuralröret 15-17.
Även om stora ansträngningar har gjorts för att upptäcka de regleringsmekanismer som styr mönstring och ödet bestämma händelser i den främre neuroectoderm har mindre uppmärksamhet gjorts på att undersöka de neurogena händelser som inträffar efterinitial mönstring skede. I själva verket, signaltransduktion, transkriptions regler, liksom posttranslationella modifieringar är alla involverade i detta senare skede styra både timing och härstamning specifikation under neurogenesis 18-20. Fortsatta undersökningar om dessa mekanismer kräver en tillförlitlig metod för att enkelt visualisera och särskilja olika populationer av neuronala celler. Ovannämnda neurala markörer, inklusive Sox3, Myt1, och N-tub, kan vara ett sätt för att identifiera dessa olika cellpopulationer, vilket ger den nödvändiga grunden för att avslöja de bakomliggande mekanismerna för neuronal differentiering 21-23.
Även differentiell märkning av neuronala cellpopulationer har visats i andra modellorganismer, har relativt få studier utnyttjas Xenopus-systemet till fullo i detta avseende. Detta beror främst på en brist på kompatibla antikroppar som på ett tillförlitligt sätt identifiera de olika neuronal cellpopulationer i neuralröret. Här beskriver vi en metod för att visualisera neuronal differentiering i tidiga Xenopus embryon via immunofärgning, vilket ger en robust och praktisk metod för att undersöka primär neurogenes i Xenopus. Detta protokoll bör ge tillräcklig vägledning för forskare som är intresserade av den tidiga utvecklingen av Xenopus centrala nervsystemet mellan steget 26 och steget 45.
Här visar vi en bekväm och effektiv metod för att visualisera primär neurogenes i Xenopus embryon. Denna metod medger utvärdering av olika typer av neurala celler, inkluderande neuronala stamceller och differentierade primära nervceller med hjälp av cell typspecifika markörer.
Protokollet är generellt robust med mycket hög grad av reproducerbarhet. För embryon som är på förhand kläckning stadier (dvs upp till steg 28), rekommenderar vi att manuellt ta bort vitellinmembranet före fixering eftersom detta tillåter embryon till fullo uncurl innan fixeringen. Detta är särskilt viktigt när man samlar in embryon vid relativt tidiga stadier (före kläckning), eftersom böjda embryon är extremt svårt att ordna vid den önskade orienteringen inuti monteringskammaren. Vi har inte upplevt en förlust av immunogenicitet efter MEMFA eller PFA fixering därmed ytterligare antigenåtervinning steg är inte nödvändigt för detta protokoll. Dessutom har dennaimmunfärgning förfarande kan utföras i prover från kromogena / fluorescent in situ hybridisering. I ett sådant scenario, är det rekommenderat att hoppa proteaset K behandlingssteget under in situ hybridisering protokoll. Efter kromogent / fluorescerande substrat reaktion kan proverna tvättas med TBS och inbäddade i fiskgelatinlösning på ett liknande sätt till MEMFA / PFA fasta prover. Provflaskor kan skyddas från ljus genom att linda flaskorna i aluminiumfolie om fluorescent in situ hybridisering kommer att avbildas tillsammans med immunofluorescerande färgning senare.
I vissa fall kan embryon krympa alltför efter gelatin penetration. Detta är troligen orsakas av antingen otillräcklig fixering eller otillräcklig TBS-Triton extraktion. Se till att embryon har rättats i PFA / MEMFA minst 2-3 h eller helst över natten vid 4 ° C. Om problemet kvarstår, öka tvättiden TBS-Triton till 3 för en timme.
Under Cryo-ITTning, kan styvheten hos provblocket variera som olika satser av fiskgelatin har olika egenskaper. Detta problem kan delvis kompenseras genom att justera temperaturen av mikrotomen. En lägre temperatur kommer att resultera i en "hårdare" provblocket dock enligt alltför låg temperatur provblocket blir skarp och svår att sektion. Några finjusteringar eller praxis (med mock sampelblock utan embryon) före varje sektionering kan vara fördelaktigt före användning på särskilt värdefulla prover.
Ett vanligt förekommande problem under sektionering är de tunna sektionerna tenderar ibland att fastna på den tjocka glasplatta snarare än stanna platt på stål scenen. Detta kan vara särskilt störa eftersom det ständigt avbryter den kontinuerliga snittningsprocessen. Sådana fall orsakas ofta av en av två skäl: sektionskammaren och (i synnerhet) tjocka glasskivan inte är tillräckligt kallt, eller kraftig statisk laddning på maskinen och operator, särskilt i torrt väder. Den förstnämnda kan lösas genom att vrida ner temperaturen i sektionskammaren och lämnar glasskivan inom extra tid (möjligen över natten); och senare genom korrekt jord kryostaten. Anslutning av metallytan på kryostat till en metall kran eller liknande vatten rörsystem av metall kan vara ett alternativt sätt för att frigöra de statiska laddningar. Efter varje användning bör tjock glasplatta tvättas väl med icke-frätande rengöringsmedel (t.ex. diskmedel), sköljdes med ultrarent vatten, besprutas med ren etanol, och insvept i handduk papper för att skydda ytan och kanterna från skada.
Antikropparna som anges i protokollet är i allmänhet specifik och vi sällan stöter på ospecifik adsorption eller hög bakgrundssignal. Det bör noteras att, om man använder värmeinaktiverat get / lammserum som blockeringsmedel, hög värme-inaktivering (såsom visualiseras genom bildningen av fluffig fällningsmedel i serumet) börundvikas eftersom detta fällningsmedel är mycket attraktiv för sekundära antikroppar och kan bidra till en källa för hög bakgrund.
Det är möjligt, och ibland önskvärt, att utföra dubbelfärgning för att visualisera olika populationer av neuronala celler samtidigt. En sådan dubbelfärgningen är möjligt och i allmänhet ger tillfredsställande resultat med följande kombinationer: Sox3 / N-badkar eller Myt1 / N-badkar. Emellertid är dubbelfärgning av Sox3 och Myt1 kompliceras av det faktum att de två antikropparna är båda från kaninursprung. Vi har testat flera antikropps direkta märkningssatser, emellertid inga tillfredsställande resultat observerades (lågt signal-till-brusnivån), möjligen på grund av bristen på signalförstärkning från sekundära antikroppar. Ett möjligt tillvägagångssätt för att kringgå detta problem skulle vara att öka transgena linjer i Xenopus, såsom diskuteras nedan.
En av de viktigaste begränsningarna i detta protokoll är att, medan detta protokoll kunde tillräckligt distinguish två pooler av neuronala celler, nämligen Sox3-uttryckande neurala stamceller poolen och Myt1-uttryck differentierade neuroner, saknar den förmågan att avslöja olika delpopulationer av differentierade neuroner. Sådana delpopulationer, vilket bland annat, men är inte begränsade till, primära motoriska nervceller, interneuronen och sensoriska neuroner, vanligtvis kännetecknas av sina differentiellt uttryckta markörgener 28-30. Som nämnts ovan, kan de senaste framstegen inom utvecklingen av flerfärgad in situ hybridisering i kombination med antikroppsbaserad immunofluorescens detektionsmetoden i Xenopus embryon fylla i gapet för att avslöja dessa delpopulationer av differentierade neuroner för potentiella utredning 31. Alternativt, som har visats i musmodell, det skulle också vara önskvärt att höja en mer omfattande uppsättning celltyp-specifika antikroppar för att särskilja sådana olika cellpopulationer i Xenopus.
Det ärockså värt att nämna att, som ett komplement till den här metoden, de senaste framstegen inom optisk avbildning och bildanalys, såsom multifoton mikroskopi, 3D-rekonstruktion, och segmentering, kan också tillämpas efter inledande bedömningar att uppnå mer omfattande observationer av Xenopus oocyter samt tidiga embryon, särskilt inom ramen för en levande inställning 32,33. Därför att spåra proliferation, differentiering och förflyttning av nervceller i levande djur, skulle det vara önskvärt att införa ett eller flera transgena linjer som hyser fluorescerande proteiner som drivs av celltyp specifik promotor för att möjliggöra levande observation av sådana cellpopulationer i början av Xenopus embryon. Inrättandet av en X. laevis linje med neuro-specifik β-tubulin promotor som driver tauGFP och dess tillämpningar har gett ett bra exempel 23,34. Med de fullständiga promotorsekvenser både sox3 och myt1 kännetecknat av ryggradsdjur 35-37, är det shOuld vara relativt lätt att etablera ytterligare transgena linjer i Xenopus som i stor utsträckning skulle bidra till både Xenopus samhället och en mer allmän fråga om primär neurogenesis forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Prof. Michael Klymkowsky i University of Colorado i Boulder och professor Nancy Papalopulu vid universitetet i Manchester för vänligt ger anti-Sox3 och anti-Myt1 antikroppar, respektive. Vi tackar medlemmarna i Papalopulu lab för deras insiktsfulla förslag för att utveckla detta protokoll. Detta arbete stöddes av två Healing Foundation anställningar till SZ och JL, två projektbidrag från Healing Foundation till SZ / EA och JL / EA respektive ett program bidrag från Wellcome Trust till EA (WT082450MA), och en institutionell Strategic Support bidrag från Wellcome Trust [097.820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |