Summary
Bu makalede, kesitleri üzerinde imüno-floresansı ile Xenopus embriyo, merkezi sinir sisteminde, farklı nöronal hücre popülasyonları görselleştirmek için uygun ve hızlı bir yöntem sunulur.
Introduction
omurgalılarda, merkezi sinir sisteminin gelişimi çok belirgin olmakla birlikte arka arkaya aşamalarını içerir. İlk adım naif ektodermal hücreler nöral kaderi yerine epidermal kader doğru belirtilen nöral indüksiyon vardır. Birkaç birbirine düzenleyici mekanizmalar Xenopus ve diğer model sistemlerde 1,2 bu aşamasında katılmaktadırlar. Bu süreç öncelikle böyle kordinin, noggine ve follistatin 3-7 gibi altta yatan mezoderm tarafından üretilen salgılanan faktörler tarafından koordine edilmektedir. Nöral indüksiyonundan sonra sinir progenitörlerin bir alt hücre döngüsü çıkıp primer nöron adlandırılan bir işlemde ayırt başlar. tüm nöronal öncüleri şu anda ayrım. Geri kalan sinir öncü hücreler, böylece gelişimi boyunca ve yetişkinlikte de merkezi sinir sisteminin sürekli büyüme için gerekli kök hücre havuz bakımı, çoğalmaya devam ediyor.
bu prNöral ön-madde hücreleri oliferating SRY (cinsiyet belirleyici bölge Y) box 3 (sox3) geni 8-11 bunların ekspresyonu ile karakterize edilir. Farklılaştırılmış kaderi taahhüt çıkış hücre döngüsü ve diğer hücre popülasyonu, farklılaşma gen belirteçleri, tubulin ifadesi, beta tarafından tanımlanan 2B sınıfı IIb (tubb2b, N-küvet) ve miyelin transkripsiyon faktör 1 (myt1) 12-14. Bu tür farklı nöronal hücreler sonunda dahil nöronların farklı kategorilerdeki sebebiyet verir, ama motor, bunlarla sınırlı olmamak üzere arası ve nöral tüp 15-17 içinde farklı yerlerde yerleştirilmiş duyu nöronları.
önemli çabalar ön nöroektoderm olayları belirleyen desenlendirme ve kader yöneten düzenleyici mekanizmaların ortaya çıkarılması için ayrılmış olsa da, daha az dikkat aşağıdaki meydana gelen nörojenik olayları araştıran üzerinde yapılmıştırİlk desenleme aşaması. Nitekim, sinyal iletimi, transkripsiyonel düzenlemeler yanı sıra post-translasyonel modifikasyonlar tüm nöron 18-20 sırasında her iki zamanlama ve soy özellikleri kontrol bu daha sonraki bir aşamada yer almaktadır. Bu mekanizmaların içine daha ileri araştırmalar kolayca görselleştirmek ve nöronal hücrelerin farklı popülasyonları ayırt etmek için güvenilir bir yöntem gerektirir. Sox3, Myt1, aşağıdakileri içeren nöral belirteçler, yukarıda bahsedilen ve N küvet ve böylece nöronal farklılaşma 21-23 mekanizmasının ortaya çıkarılması için gerekli olan temel sağlayan bu farklı hücre popülasyonlarının tanımlanması için bir araç sağlayabilir.
Nöronal hücre popülasyonlarının farklı etiketleme diğer model organizmalarda görülmekle birlikte, göreceli olarak az sayıda çalışma bu konuda onun sonuna kadar Xenopus sistemini istismar var. Bu güvenilir, çeşitli neur belirlemek uyumlu antikor azlığı kaynaklanmaktadırnöral tüpte onal hücre popülasyonları. Burada, Xenopus birincil nöron araştırılması için sağlam ve uygun bir yaklaşım sağlar immün aracılığıyla erken Xenopus embriyolar nöronal farklılaşma görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol aşamasında 26 ve evre 45 arasında Xenopus merkezi sinir sisteminin erken gelişimi ilgilenen araştırmacılar için yeterli rehberlik vermelidir.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Manchester Hayvan Refahı Merkezi'ne Üniversitesi onaylanmış ve bir İngiliz Home Office Project Lisansı tarafından karşılanmıştır.
1. Toplama ve Fiksasyon Xenopus Embriyolar
- Deney için Reaktifler ve Malzemeler hazırlayın.
- Bir son konsantrasyon elde etmek için 10x Marc Modifiye Ringers (KKK), 1 M MgSO 4, 1 M CaCl2 ve 1 M HEPES pH 7.4, yaklaşık 800 mi ultra saf su içinde NaCI 56.5 g eritilmesi ve 1 M KCI stok çözelti ekleyerek hazırlamak 20 mM KCI, 10 mM MgSO 4, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES. 10 M NaOH ile 7.4 pH ayarlayın ve sonra 1 L. son ses seviyesini ayarlamak
- bir sıvı döngüsü 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavda tutarak 10x MMR solüsyonu sterilize edin. Kullanımına bağlı olarak, 0.1x nihai konsantrasyona GKD 2 O seyreltin ve mikrobiyal büyümeyi inhibe etmek için, 20 mg / L gentamisin ilave edin.
- 24 g Tris-HCI, 5.6 g Tris-b karıştırılarak 10x TBS çözeltisi yapmakase, 88 gr NaCl ve yaklaşık 900 ml saf su eriterek. Nihai çözüm 7.6 civarında bir pH değerine sahip olacaktır. 1 L'ye 7.6 nihai pH ve son hacim elde etmek için 10 M NaOH ve konsantre HCI ile ya ayarlama
- kullanarak üzerine, ultra saf su 9 parça ile 10x TBS solüsyonu 1 bölümünü sulandırarak 1x TBS yapmak.
- 20 mM EGTA, 10 mM MgSO 4 bir son konsantrasyon elde etmek için 0.5 M EGTA ve 1 M MgSO 4 stok çözelti yaklaşık 800 mi ultra saf su içinde 209.2 gr MOPS eritilmesi ve ekleyerek 10x MEM tuzunu yapmak. 10 M NaOH ile 7.4 pH ayarlayın ve sonra 1 L. son ses seviyesini ayarlamak
- Bu otoklava sonra çözelti, oda sıcaklığında depolanması bir kaç ay sararma ya (a, sıvı döngüsü 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavda tutarak MEM tuzu çözeltisi sterilize ama renkli bu değişiklik kullanımını etkilemez ). Ancak, uzun süreli depolama (fazla 6 aylık) sonra çözüm kullanmayın.
- 1x MEM olunMEM Tuzların 1 bölüm (en az 1-2 hafta boyunca 4 ° C 'de sabit bir h / h), ultra saf su 8 kısım% 37 formaldehid 1 parça seyreltilmesiyle FA çözeltisi.
- 60 ° C'de 1x TBS çözeltisi Isı 100 ml çözelti, paraformaldehid toz 4 g çözülerek (Phalloidin içeren daha sonra boyama) TBS içinde% 4 paraformaldehid hazırlamak ve eritilmesi yardımcı olmak için 10 M NaOH birkaç damla ekleyin. -20 ° C, 5-10 ml hacim ve dondurularak kısım. re-donma yok bir kere çözülmüş.
DİKKAT: Paraformaldehyde toz tahriş edicidir ve böylece tartı adımı davlumbaz yapılmalıdır, solunduğunda toksiktir. - Örnek toplama işleminden önceki vidalı kapaklarla gibi birçok 4 ml cam şişeleri etiketleyin.
- 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne (50 ° C su banyosu içinde ön ısıtma)% 40 balık jelatini 20 ml dökülerek% 15 jelatin /% 15 sukroz hazırlayın. sükroz 8 g ekleyin ve 1 x TBS ile 50 mi hattına tüp doldurun.
- bir döner mikser veya haddeleme yatakta jelatin tüpü yerleştiringece boyunca oda sıcaklığında karıştırın. Bu jelatin solüsyonu 1 hafta boyunca 4 ° C'de stabildir. Süresi dolan çözüm kullanmak etmeyin ve donma-çözülme yoktur.
- Hazırlayın ve X Fix laevis veya X İstenilen Aşamaları için tropicalis Embriyolar Kültür.
- Döllenmiş X. Kültür laevis veya X tropicalis istenen evrelerine kadar gentamisin ile 0.1x MMR embriyolar.
NOT: Genellikle evre 40 sonra aşamaları 23 ve embriyoların 40. Daha sonra toplama arasındaki embriyolar toplamak omurilikten aksonal büyümeyi gözlemleyerek, ancak ek jelatin penetrasyon süresi gerekebilir akılda tutmak, özellikle mümkündür. Embriyolar, vahşi tip transjenik mutant olabilir tedavi inhibitörü, morfolino (MO) -injected veya 23,24 elektroporasyona. - Her biri 4 ml bir cam şişe içinde 20-50 embriyo toplamak mümkün olduğu kadar orta kaldırmak ve MEMFA ile değiştirin.
NOT: Sonraki boyama Phalloidin içeriyorsa,% 4 paraformaldehid kullanınyerine MEMFA ticari verilen formaldehit çözümleri genellikle Phalloidin boyama işlemine engel olacak bir dengeleyici olarak en fazla% 10 metanol içerdiğinden. - Oda sıcaklığında aciliyet, eğer döner bir karıştırıcıda 2 saat boyunca, 4 ° C'de bir gece boyunca saptamak ya. Embriyolar, 4 ° C de en az 1 hafta için tespit çözeltisi içinde kararlı olacaktır.
- Tespit edildikten sonra,% 0.05 Triton X-100 ile 1 x TBS ile 20 dakika için embriyolar 3 kere yıkayın. Son yıkamadan sonra, mümkün olduğu kadar TBS-Triton çıkarın ve her bir şişeye% 15 jelatin /% 15 sükroz 3 ilave edin.
- gece boyunca oda sıcaklığında yatak bir silindir üzerine şişe yerleştirin. kademe 40 daha büyük embriyolar için, penetrasyon süresi en az 24 saat kullanır. penetrasyon sonra, ertesi gün bölüm 2.2 hemen geçin.
- Döllenmiş X. Kültür laevis veya X tropicalis istenen evrelerine kadar gentamisin ile 0.1x MMR embriyolar.
2. Montaj ve Cryosectioning Xenopus Embriyolar
- Deney için Reaktifler ve Malzemeler hazırlayın.
- olumlu charg bir kutu alıned ideal açılmamış, slaytlar.
NOT: Açılmışsa, (örneğin, bir kuru kutu gibi), kuru koşullarda slaytlar tutmak ve slaytlar üzerinde statik yük korunmasını sağlamak için 1 ay içinde kullanın. Numuneler immün sırasında kapalı düşecek çünkü zaman aşımına uğramış slaytlar kullanmayın. - -30 ° C'ye kriyostat Kabin, önceden soğuk. microtome için -35 ° C ve 12 mikron kesit kalınlığı olarak enstrüman parametrelerini ayarlayın. sahneye kalın kapak cam plaka takın ve bölüm başlamadan önce kriyostat en az 30 dakika süreyle dengeye edelim.
- bölüm şeritleri taşımak için boyama fırçaları hazırlayın, kriyostat odasının içine tutmak.
- , Kızaklar üzerinde yazma kalem hazırlayın oda sıcaklığında koydu.
- cryosection sırasında eldiven giyin. çıplak elle kullanmayın.
- olumlu charg bir kutu alıned ideal açılmamış, slaytlar.
- Xenopus Embriyolar Montaj
- Dikkatle hava kabarcıkları tanıtan olmadan bir plastik veya cam pipet kullanarak cam şişenin dışına 5-10 embriyolar aspirat. embriyolar transferve montaj odasına bir Stereoskop altında gözlemlemek. bölüm bloğunun sertliği sağlamak için jelatin solüsyonu ile montaj odasına kadar doldurun.
- Ince uçlu forseps bir çift kullanarak Şekil 1 uyarınca embriyolar düzenleyin. kriyojenik uyumlu kalem kullanarak odasının kenarında bir ok çizerek başkanlarının yönünü işaretleyin. Embriyoların çoklu gruplar için de ilgili odasının kenarında her grubun açıklamasını yazın.
- Dikkatle kuru buz ile yarım dolu bir köpük kutu yatay odasına yerleştirin ve kapağını kapatın. 5-10 dakika montaj odası dondurma gözlemleyin. Bu dondurmak ve kalabalık olmaya kuru buz kutusu önlemek için her bölme için yeterli zaman bırakacak şekilde (yani bir sonraki geçmeden önce kuru buz üzerine önceki odasına yerleştirin) seri her odasına işleyin.
NOT: Dondurulmuş montaj odaları yatay durmak gerekmez ve kutu içinde yığılmış olabilir. - Gerekirse, imunojenisite kaybolmaksızın en azından 1-2 hafta -80 ° C'de donmuş örnekleri tutmak cryosectioning ile devam veya.
- Atlı Xenopus Embriyolar Cryosection
- (Örneğin bir kalem gibi) künt sopa kullanarak odasının alt basarak odadan donmuş örnek bloğunu çıkarın.
- Örnek tutma diski üzerine doku dondurma ortamı birkaç damla, (polietilen glikol ve polivinil alkol içeren ortam) ekleyin ve embriyo ön ucu ile örnek blok monte (Şekil 2) kadar etmektedir. üstünde sabit blok yaklaşık 1 dakika boyunca ya da doku dondurma orta opak hale gelinceye kadar kriyostat odası içinde durmak izin verin.
- Hemen yukarı bakacak şekilde örnek bloğunun alt tarafı ile microtome üzerine numune tutma diski takın. Örnek bloğu hala nispeten "yumuşak" olduğu zaman her bölümün uzunluğunu azaltmak için bıçak kullanarak örnek bloğunun bir kısmını keserek(arzu edildiği takdirde). sıcaklığı dengesine ulaşmasına izin için en az 5 dakika mikrotom örnek tutma diski bırakın.
- tadpoles başkanları saydam jelatin yoluyla görünene kadar yavaş yavaş örnek blok kırpın. Numune blok numune tutma diskinden düşmek çünkü (örneğin "Döşeme" seçeneğini etkinleştirerek gibi) bu aşamada kesit kalınlığında (örneğin 20-25 uM) daha yüksek (kalın) ayarı uygulamak, hız kesme artırmak ama çok kalın . kriyostat performansını gözlemlemek, böyle bu aşamada netlik ve bıçak açısı olarak ileriki bölümlerde uzun bir şerit üretimini sağlamak.
- Tadpole kafaları görünür olduktan sonra, bir boya fırçası kullanarak geri (örneğin 10-12 uM) normal ve hem mikrotom temiz ve sahneye kriyostat ayarlarını ayarlayın. Yavaşça bitmiş dilim str oluşabilir emin olmak için (motorlu ayarı kullanmayın) el çarkı ayarını kullanarak bir deneme olarak 2-3 bölümleri yapmakips, örtüşen veya bıçak yapışmasını değil.
- tadpoles başkanları neredeyse maruz kadar (bu biraz tecrübe ama başarılabilir gerekebilir) kırparak devam edin. Sahnede herhangi kalıntı bölümleri ve başlayacak örnek bölümlerin toplama savmak.
- Yaklaşık 10-15 bölümleri yapmak ve onları uzun bir şerit oluşturmak edelim.
- tarafına kalın kapak cam plaka ters çevirin ve yavaşça bir ucu ince boya fırçası kullanarak bıçak bandını çıkarın ve bıçağı uzun eksenine paralel sahnede düzenlemek.
- , Oda sıcaklığında bir pozitif yüklü slayt seçin (bir sonraki boyama tedavileri sırasında yıkanıp olmayacak) bir kalem ile etiket, basın hızla ama sıkıca aşağıya bakacak etiketli yüzü şerit üzerine ve kriyostat odasından slayt kaldırmak. Doğru şekilde yapılırsa, şerit hemen pozitif yüklü slayt (Şekil 3A) ayrılmamak gerekir.
- Her kaydırdı 20-30 dilim için bu adımı tekrarlayınE ve paralel (Şekil 3b) yerleştirilmiş. Bu X'in tüm beyin bölgesini kapsayacak şekilde yeterli tropicalis embriyolar ve X'in ön beyin en ve orta beyin bölgeleri embriyolar laevis.
- 10 dakika için slaytlar Hava kuruması hemen devam ya, immünojenite kaybetmeden en az 3-6 ay süreyle -80 ° C'de bir slayt kutusunda slaytlar saklayın.
Kesitli Xenopus Embriyolar 3. immün
- Deney için Reaktifler ve Malzemeler hazırlayın.
- % 0.05'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 1 x TBS içinde Triton X-100 eklenmesi ile% 0.05 TBS-Triton X-100 hazırlayın. Bu çözelti 3-4 gün boyunca oda sıcaklığında stabildir. Süresi dolan çözüm kullanmayın.
- bloke edici tampon olarak TBST içinde% 5 ısı ile inaktive edilmiş keçi serumu ve% 5 BSA hazırlayın. İlk olarak, 30-60 dakika boyunca 65 ° C su banyosu içinde yaklaşık 20-30 ml serum ve yerleştirerek, keçi / kuzu serumu ısıyla etkisiz hale getirirler. 1.5 ml santrifüj içine kısımborular ve -20 ° C'de dondurularak. Hayır yeniden inaktivasyon kullanarak üzerine gereklidir.
- Kullanmadan önce% 5 nihai konsantrasyon elde etmek için TBST içinde ısı ile inaktive edilmiş serum veya BSA ile seyreltilir.
- (500, anti-Sox3 10,25 / 1: 250, anti-Myt1 26 / anti-asetillenmiş tübülin örneğin 1) blokaj tamponunda seyreltileri göre uygun primer antikorların hazırlanması. Her slaytta antikor çözüm yaklaşık 100 ul kullanın.
- Tampon (: 500 genelde 1) bloke uygun floresan antikor (örneğin anti-fare / tavşan kırmızı floresan boya-konjuge antikorlar) hazırlayın.
- aktin network ortaya çıkarmak için ikincil antikor karışımı içine: (isteğe bağlı) kırmızı floresan boya-konjuge Phalloidin (500 1) ekleyin.
- (Isteğe bağlı), nükleer lokalizasyon görselleştirmek için ikincil antikor karışımı içine DAPI (0.5 ug / ml nihai konsantrasyon) eklenir.
- dondurucu anti-solmaya montaj orta alın ve oda sıcaklığında su banyosunda eritin.
- immün
- -80 ° dondurulmuş slaytlar çıkarın ve en az 1 saat sonra bir 85-90 ° C ısıya blok üzerinde kurutulmuş slaytlar fırında, herhangi bir yoğunlaştırılmış su damlacıklarını ortadan kaldırmak için bir havalandırma kaput içinde havlu kağıt parçası üzerine koyun 15 dakika yukarı bakacak şekilde dilimler yapışma mekanizmasını etkinleştirmek için. Son olarak, lamlar, oda sıcaklığına kadar (en az 10 dakika) soğuk sağlar.
- Saf aseton ile boyama kavanoz doldurun ve balık jelatini çıkarmak için 10 dakika boyunca aseton içinde slaytlar inkübe edin. Birden fazla slayt tedavi edilecek ise, bir boyama rafa bunları düzenlemek. Bir havalandırma kaput 15 dakika boyunca işlem görmüş slaytlar hava-kurutun. Do not aseton yeniden kullanın.
- Dikkatle örnekleri dokunmadan PAP kalem kullanarak slayt örneklerin etrafında bir halka çizin. Aksi takdirde antikor çözeltisi boyama sırasında akacak, halka kendini kapalı olduğundan emin olun. Tamamen PAP kalem halkasını kurutun.
- Triton X-100 olmadan 1x TBS ile başka bir boyama kavanoz doldurun. INSERboyama kavanoz içine kurutulmuş slaytlar t ve en az 1 saat süreyle rehidrasyon sağlar. Bu süre zarfında,% 0.05 Triton X-100 ile 1 x TBS ile% 5 nihai konsantrasyona kadar ısı ile inaktive edilmiş keçi serumu ve BSA ya seyreltilmesi ile bloke tamponu hazırlayın.
- Bir tıklama kilidi gıda kutusunun içinde 1-2 Haziran-kuyucuğu koyarak ıslak kutu yapın ve saf su ile yarım kuyu doldurun. boyama kavanozdan Rehidrate slaytları çıkarın ve (plaka kapaksız) yatay 6-kuyucuğu üzerine koyun.
- Dikkatle PAP halkasının içinde tampon engelleme 300-600 ul ekleyin. yerine kapağı kilitleme ıslak kutu kapatılır ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- tampon engelleme uygun birincil antikorlar sulandırınız. Genellikle, slayt başına 100-150 ul seyreltilmiş antikor çözeltisi kullanın. Birden fazla slaytlar işlenir ise, orantılı hacmi büyütmek.
- bloke sonra, dikkatle aspirasyon ile slaytlar engelleme tampon kaldırmak ve hızlı bir şekilde p ekleyinKuru Çıkış bilmek rimary antikor çözeltisi, daha sonra ıslak kutu mühür ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, aspirasyon ile slaytlar birincil antikor çözüm kaldırmak. % 0.05 Triton X-100, 3 kez, her biri 15 dakika ile 1 x TBS ile doldurulmuş boyama kavanoz içine sokulmasıyla slaytlar yıkayın. Bu arada, (ya da DAPI veya Phalloidin olmadan) bloklama tamponu uygun floresan sekonder antikor sulandırmak.
- Dikkatle Slaytlarınıza ikincil antikor çözüm 100-150 ul ekleyin. Islak kutu içinde slaytlar yerleştirin ve kapağı kapatın. Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca slaytlar inkübe edin.
- % 0.05 Triton X-100, 3 kez, her biri 15 dakika ile 1 x TBS ile doldurulmuş boyama kavanozlarda slaytlar yıkayın. -20 ° C'de muhafaza edildiğinde son yıkama olarak, 10 dakika boyunca 50 ° C su banyosu içinde, anti-solma montaj orta çözülme. Kullanmadan önce, oda sıcaklığına kadar montaj orta soğutun.
- üzerine montaj orta yaklaşık 20 ul (bir damla) ekleyinslayt ve örnekler üzerinde büyük bir kapak kayma (en az 22 mm x 64 mm) uygulanır. 6 saat sonrası montaj içinde floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak gözlemlemek.
- görüntüleme aynı gün yapılabilir yapamıyorsanız, tırnak cilası kullanarak slaytları mühür ve gece boyunca 4 ° C'de ıslak kutu içinde koyun.
NOT: anti-solmaya montaj orta kademeli olarak birkaç gün sonra okside (ve kahverengimsi dönüş) bu nedenle en kısa sürede görüntüleri çekmek için tavsiye edilir alacak.
- görüntüleme aynı gün yapılabilir yapamıyorsanız, tırnak cilası kullanarak slaytları mühür ve gece boyunca 4 ° C'de ıslak kutu içinde koyun.
Representative Results
Örnek sonuçlar farklı antikorları (Şekil 4) ile boyandı farklı düzeylerde, yani ön beyin, orta beyin, arka beyin ve omurilik, önceki aşamada 30 Xenopus embriyolar enine kesitlerini gösterir. belirtildiği gibi, farklılaştırılmış birincil nöronlar dışa göç ve nöral tüp marjinal tabakasının (bazal lamina) yakın bulmak MyT1 etiketli ise nöronal progenitör hücre popülasyonu, nöral tüpün lümeni yakınında bulur Sox3 etiketli. Anti-asetil-tübülin bütün nöral tüp içinde görülebilir farklılaşmış nöronların içinde aksonlar etiketler.
Yan özgü gen yok etme ya da aşın belirli bir gen (ler) in ekspresyonunu modüle nöronal hücrelerin büyümesini ve farklılaşmasını bozan olup olmadığını değerlendirmek için nörobiyolojisinde bir yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu gibi durumlarda, her iki morpholinos (ay) ya da DNA yapısı (ler) ön taşıyan Moter odaklı gen (ler), iki hücre aşamasında 23 iki blastomerlerin birine enjekte edilir. Alternatif olarak, demonte veya aşırı ifadesi, istenen gen (ler) 27 sonuçlanacaktır elektroporasyon ardından beyin ventrikül içine enjekte edilebilir. Her iki durumda da, etkileri tedavi edilmemiş bir iç kontrol olarak embriyo karşıt tarafını, embriyonun bir tarafına sınırlandırılacaktır.
tespit, kesit ve immün sonra, gen yok etme / aşırı ifadesi etkileri sayarak ve embriyo her iki tarafında farklı popülasyonlarının hücre sayıları karşılaştırılarak ölçülür. Birçok embriyolardan bu veri birikimi ile, istatistiksel analiz gerçekleştirilebilir. Bizim temsilcisi sonuçları, hiçbir pertürbasyon embriyolar yapıldı. Gen pertürbasyon ve farklı nöronal hücre popülasyonları üzerindeki etkileri örnekleri referanslar 20,23 bulunabilir.
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Şekil 1:. Bölüm kalıpta Embriyo düzenleme ve yönlendirme (A) montaj grubunu gösteren bir karikatür tasviri, tepsi tarih, sahne ve embriyoların yönlendirme ile etiketlenmiş olmuştur unutmayın. (B) montaj montaj doğal görünümünü gösteren bir görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Yönelimi ve örnek tutma disk üzerindeki jelatin blok pozisyonu (A) bölümünde blok düzeneğini gösteren bir karikatür tasviri, embriyolar "yukarı kafaları" konumunda ve jelatin blok sıkıca o sabit olduğuna dikkatüssünde doku dondurma ortamı ile örnek tutma disk nto (Şekil 2B). (B) bölümünde blok montaj doğal görünümünü gösteren bir görüntü, jelatin blok ve örnek tutma diski arasındaki doku dondurma orta birikimini not edin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Bir kesit odasının sürekli kesit (A) modeli. Numune tutma disk embriyo tarafı yukarı bakacak pozisyona döndürülür ve sabit olmalıdır. Birkaç (6-10) bölümleri sonra, sürekli bölüm kiremit uzun bir şerit hafifçe ince bir fırça kullanarak bıçağı (mavi) ayrılır ve daha sonra tutma plaka üzerinde 90 ° döndürülebilir. Sonra bir oda geçici pozitif slayt ücretsıkıca aşağı bakacak bölüm şerit üzerine basıldığında ve hemen tahsil bitmiş şeritler kaldırdı. Gösterildiği gibi (B) Normalde, her slayt, şerit 2 paralel çizgiler konaklayabilir. Kalem kullanarak slayt etiketi üzerinde detaylı bir kayıt yapmayı unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: aşama 30 X kesiti , 20X. (A) Şemalar Xenopus tadpoles bölüm uçaklarının göreli konumlarını (ön beyin, orta beyin, arka beyin ve omurilik) gösteren nöral dokuda Kurbağa yavrularını ve boyama laevis. (B) anti-Sox3 (Kırmızı), anti-asetile-tubulin (Gree ile boyanmış karşılık gelen enine kesitlerdenöral tüp içindeki nöral kök hücre havuzları yanı sıra nörofilament göreli konumlarını gösteren n) ve DAPI (mavi). Nöral tüp içindeki farklı primer nöron göreli konumlarını gösteren anti-MyT1 (kırmızı) ve DAPI (mavi) ile boyanmış kesitler, karşılık gelen (C). Ölçek çubuğu = 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Burada Xenopus embriyolarındaki primer nöron görselleştirmek için uygun ve etkili bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntem, hücre tipine spesifik markörleri kullanılarak nöronal kök hücrelerin ve farklı primer nöronlar dahil sinir hücrelerinden farklı, değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.
protokol tekrarlanabilirliği çok yüksek seviyede genellikle sağlamdır. Ön kuluçka aşamasında olan embriyoların (yani kadar 28 sahne), bu embriyolar tamamen tespitten önce açılmak için izin verir gibi elle önce tespite vitellin membran kaldırmanızı öneririz. bükülmüş embriyolar montaj odasının içine istenilen yönde de düzenlemek için son derece zor olduğundan, (kuluçka önce) nispeten erken aşamalarında embriyolar toplarken bu özellikle önemlidir. Biz MEMFA veya PFA fiksasyon dolayısıyla ek antijen alma aşamasından sonra immünojenisite kaybı yaşamamış bu protokol için gerekli değildir var. Ayrıca, buimmüno-boyama prosedüründe in situ hibridizasyon kromojenik / floresan örnekler içinde gerçekleştirilebilir. Bu gibi bir durumda, in situ hibridizasyon protokolü sırasında proteaz K muamelesi adımı atlamak için tavsiye edilir. Floresan / kromojenik alt tabaka reaksiyonu sonra, numuneler TBS ile yıkanabilir ve MEMFA / PFA sabit örneklere benzer bir şekilde, balık jelatini çözeltisi içinde gömülü. Örnek şişeler floresan in situ hibridizasyon, daha sonra immünofloresan boyama ile birlikte görüntülenebilir eğer alüminyum folyo şişeleri sararak ışıktan korunur.
Bazı durumlarda, embriyolar jelatin penetrasyon sonra aşırı küçültmek olabilir. Bu büyük olasılıkla yetersiz olduğu tespit veya yetersiz TBS-Triton ekstre kaynaklanır. Embriyolar 2-3 saat için PFA / MEMFA sabit ya da tercihan bir gece boyunca 4 ° C 'de olan emin olun. Sorun devam ederse, 1 saat boyunca 3 TBS-Triton yıkama süresini artırır.
cryo-sezaryen sırasındaplanlama, örnek blok sertliği balık jelatin gibi farklı partiler farklı özelliklere sahip değişebilir. Bu sorun kısmen microtome sıcaklığını ayarlayarak telafi edilebilir. Bir alt sıcaklık örnek blok bölümüne net ve zor olur, ancak aşırı düşük sıcaklık altında bir "sert" örnek bloğu neden olur. Her kesit önce (embriyolar olmadan sahte örnek bloklar kullanılarak) Bazı ince ayar ya da uygulama özellikle değerli örnekleri üzerinde kullanmadan önce yararlı olabilir.
kesit sırasında sık karşılaşılan bir problem ince kesitler bazen kalın cam plaka üzerine sopa yerine çelik sahnede düz kalmak eğilimindedir. Bu sürekli devam eden kesit işlemini keser beri özellikle bozucu olabilir. bölüm odası ve (özellikle) kalınlığında cam levha makine ve o yeterince soğuk veya aşırı statik yük olmamak: Bu gibi durumlarda genellikle iki nedenden birinden kaynaklanırÖzellikle kuru havalarda perator. Eski bölüm odasının ısısını aşağı çevirerek ve uzatmalarda (muhtemelen gece) için içinde cam plaka bırakarak çözülebilir; ve düzgün Kriyostat topraklama ikincisi. metal musluk veya metalden yapılmış benzer su hortumu sistemine kriyostat metal yüzeyine bağlanması statik yük serbest bırakmak için alternatif bir yol olabilir. Her kullanımdan sonra, kalın cam levha, ultra-saf su ile durulanmıştır (örneğin, bulaşık yıkama sıvısı gibi) aşındırıcı olmayan bir deterjan ile iyice yıkandı gereken saf etanol ile püskürtülür, ve zarar verici yüzeyi ve kenarları korumak için havlu kağıt sarılmış.
Protokolde belirtilen antikorlar genellikle belirli ve biz nadiren nonspesifik adsorpsiyon veya yüksek arka plan sinyalini karşılaşıyoruz. Belirtilmelidir gereken engelleme maddesi (serumdaki kabarık çökeltici oluşumu ile görselleştirildiği gibi) aşırı ısı inaktivasyonu olarak ısı ile inaktive edilmiş keçi / kuzu serumu kullanılarak, buBu çökeltici gibi kaçınılması ikincil antikorlar son derece çekici ve yüksek arka kaynağına katkıda bulunabilir.
Bu mümkündür ve zaman zaman aynı zamanda nöronal hücrelerin farklı popülasyonlarının görselleştirmek için çift boyama yapmak için, istenen. Böyle çift boyama mümkündür ve genellikle aşağıdaki kombinasyonları ile tatmin edici sonuçlar verir: Sox3 / N-küvet veya Myt1 / N-küvet. Bununla birlikte, Sox3 ve Myt1 çift boyama iki antikor, tavşan kökenli her ikisi de aslında karmaşık hale gelir. Bu muhtemelen ikincil antikor sinyal amplifikasyon olmaması nedeniyle, çok sayıda antikorun doğrudan etiketleme kitleri, ancak hiçbir tatmin edici sonuçlar (düşük sinyal-gürültü seviyesi) gözlendi test ettik. Bu sorunu aşmak için bir olası bir yaklaşım, aşağıda ele alındığı gibi, Xenopus transjenik çizgileri yükseltmek olabilir.
Bu protokolün ana kısıtlamalar biri olduğunu iken bu protokol olabilir yeterince di olduğununöronal hücrelerin iki ana havuzu stinguish, yani Sox3 ifade eden nöral kök hücre havuzu ve Myt1-ifade farklılaşmış nöronlar, bu farklılaşmış nöronların farklı alt-popülasyonları ortaya çıkarmak için yeteneği yoktur. Bu tür de dahil olmak üzere, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, alt-popülasyonları, primer motor nöronlar, internöron ve duyusal nöronlar, genellikle farklı şekilde eksprese marker genleri 28-30 ile karakterize edilir. Yukarıda belirtildiği gibi, Xenopus embriyolarındaki antikor bazlı immünofloresan tespit yöntemi ile birlikte, in situ hibridizasyon çok renkli gelişmesinde son gelişmeler, potansiyel inceleme 31 için farklılaşmış nöronların Bu alt topluluklar ortaya boşluğu doldurmak olabilir. Alternatif olarak, fare modelinde gösterilmiştir, o da Xenopus gibi farklı hücre popülasyonları ayırt etmek için hücre tipine özgü antikorların daha kapsamlı yükseltmek için istenmektedir.
BuAyrıca değer bu yönteme ek olarak, söz, böyle multiphoton mikroskobu, 3D rekonstrüksiyon ve segmentasyon gibi optik görüntüleme ve görüntü analizi son gelişmeler, aynı zamanda ilk değerlendirmeler daha kapsamlı Xenopus oosit gözlemlerini yanı sıra elde etmek sonra uygulanabilir özellikle 32,33 ayarı canlı kapsamında erken embriyolar. Bu nedenle, çoğalma, farklılaşma ve canlı hayvan nöronal hücreleri hareketini izlemek için, erken Xenopus bu hücre popülasyonlarının canlı gözlenmesine imkan vermek için hücre tipine spesifik promotör tarafından sürülen floresan proteinleri liman bir veya daha fazla transgenik line'lar oluşturmak için arzulanan olur embriyolar. Bir X kurulması tauGFP ve uygulamalarını sürüş nöro-spesifik β-tübülin promotör ile laevis hat güzel bir örnek 23,34 sağladı. Sox3 ve omurgalı 35-37 özelliği myt1 hem tam hızlandırıcı sekansları ile, shXenopus eden ve primer nöron araştırma daha genel bir alan hem de geniş ölçüde katkıda bulunmalıdır Xenopus ek transgenik çizgiler kurmaya nispeten kolay ould.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz nazik sırasıyla anti-Sox3 ve anti-Myt1 antikorları sağlamak için Manchester Üniversitesi'nde Boulder Colorado Üniversitesi Prof. Michael Klymkowsky ve Prof. Nancy Papalopulu teşekkür ederim. Biz bu protokolü gelişmekte onların anlayışlı önerileri için Papalopulu laboratuar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma SZ ve JL iki Şifa Vakfı studentships tarafından desteklenen, SZ / EA ve sırasıyla JL / EA, EA Wellcome Trust (WT082450MA) itibaren bir programı hibe Şifa Vakfı, ve bir Kurumsal Stratejik Destek hibeden iki proje hibe Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z] 'den.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
| Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
| Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
| Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Gloves | |||
| Dry Ice | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 85-90 °C Heat block | |||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Acetone, analytical grade | |||
| Staining jar with slide racks | |||
| Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
| anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
| Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
| Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |
References
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
- Wilson, S. W., Houart, C.
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
- Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
- Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
- Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
- Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
- Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
- Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
- Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
- Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
- Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
- Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
- Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
- Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
- Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
- Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
- Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
- Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
- Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469 (2013).
- Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
- Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).
- Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
- Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
- Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
- Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
- Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
- Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
- Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
- Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).
