Denne artikel præsenterer en praktisk og hurtig metode til at visualisere forskellige neuronal cellepopulationer i centralnervesystemet af Xenopus embryoer hjælp immunfluorescensfarvning på sektioner.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
I hvirveldyr, udvikling af centralnervesystemet omfatter flere markante endnu konsekutive faser. Det første trin er neural induktion, når naive ektodermale celler er specificeret mod en neural skæbne snarere end en epidermal skæbne. Adskillige indbyrdes forbundne reguleringsmekanismer er involveret i denne fase i Xenopus og andre modelsystemer 1,2. Denne proces er primært koordineres af udskilte faktorer produceret af den underliggende mesoderm, såsom Chordin, noggin, og follistatin 3-7. Efter neural induktion, en delmængde af neurale stamceller forlade cellecyklen og begynder at differentiere i en proces, der betegnes primær neurogenese. Ikke alle neuronale precursorer differentiere på dette tidspunkt. De resterende neurale precursorceller fortsat formere sig, og dermed bevare den stamcelle pool nødvendig for fortsat vækst af centralnervesystemet i hele udviklingen og ind i voksenalderen.
Disse pRoliferating neurale precursorceller er kendetegnet ved deres ekspression af SRY (køn bestemmende region Y) -boks 3 (sox3) -gen 8-11. Den anden population af celler, som exit cellecyklus og forpligte sig til en differentieret skæbne, identificeres ved ekspression af differentiering genmarkører, tubulin, beta 2B klasse IIb (tubb2b, N-kar) og myelin transskription faktor 1 (myt1) 12-14. Sådanne differentierede neuronale celler vinder give anledning til forskellige kategorier af neuroner, herunder, men ikke begrænset til, motor, inter- og sensoriske neuroner placeret i særskilte områder inden neuralrøret 15-17.
Mens betydelig indsats er blevet afsat til at afdække de regulatoriske mekanismer, der styrer mønster og skæbne bestemme begivenheder i den forreste neuroectoderm, er mindre opmærksomhed foretaget på at undersøge de neurogene begivenheder, der opstår som følge afindledende mønsterdannelse fase. Faktisk signaltransduktion, transskriptionelle forskrifter, samt post-translationelle modifikationer er alle involveret i denne senere tidspunkt, styring af både timing og slægt specifikation under neurogenese 18-20. Yderligere undersøgelser disse mekanismer kræver en pålidelig metode til nemt visualisere og skelne mellem forskellige populationer af neuronale celler. Ovennævnte neurale markører, herunder, Sox3, Myt1, og N-tub, kan tilvejebringe et middel til identifikation af disse forskellige cellepopulationer, hvilket giver det nødvendige fundament til at afsløre de underliggende mekanismer af neuronal differentiering 21-23.
Selv differentiel mærkning af neuronale cellepopulationer er blevet påvist i andre modelorganismer, har relativt få undersøgelser udnyttes Xenopus systemet til sin fulde i denne henseende. Dette skyldes hovedsagelig en mangel på kompatible antistoffer, som pålideligt identificere de forskellige NEUROnal cellepopulationer i neuralrøret. Her beskriver vi en metode til at visualisere neuronal differentiering i tidlige Xenopus embryoner via immunfarvning, hvilket giver en robust og bekvem fremgangsmåde til undersøgelse af primær neurogenese i Xenopus. Denne protokol bør give tilstrækkelig vejledning for forskere interesseret i den tidlige udvikling af Xenopus centralnervesystemet mellem stadie 26 og scene 45.
Her demonstrerer vi en bekvem og effektiv metode til at visualisere primære neurogenese i Xenopus embryoer. Denne metode tillader vurdering af forskellige typer af neurale celler, herunder neuronale stamceller og differentierede primære neuroner bruger celle typespecifikke markører.
Protokollen er generelt robust med meget høje reproducerbarhed. For embryoner, der er på forhånd udrugning etaper (dvs. op til fase 28), anbefaler vi manuelt at fjerne vitellinmembranen forud for fiksering, da dette giver embryoner til fuldt ud at uncurl før fiksering. Dette er især vigtigt ved indsamling embryoner ved relativt tidlige faser (før udklækning), da bøjede embryoner er yderst vanskeligt at arrangere på den ønskede orientering inden i monterings kammeret. Vi har ikke oplevet et tab af immunogenicitet efter MEMFA eller PFA fiksering dermed yderligere antigen hentning trin er ikke nødvendigt for denne protokol. Desuden er denneimmunfarvning procedure kan udføres i prøver fra kromogene / fluorescerende in situ-hybridisering. I et sådant scenario, anbefales det at springe protease K trinnet behandling under in situ hybridisering protokol. Efter chromogent / fluorescerende substrat reaktion kan prøverne vaskes med TBS og indlejret i fiskegelatine opløsning på en lignende måde at MEMFA / PFA faste prøver. Prøvehætteglas kan beskyttes mod lys ved indpakning hætteglassene i aluminiumsfolie, hvis fluorescerende in situ hybridisering vil blive afbildet sammen med immunfluorescensfarvning senere.
I nogle tilfælde kan embryoner skrumpe overdrevent efter gelatine penetration. Dette er højst sandsynligt forårsaget af enten utilstrækkelig fiksering eller utilstrækkelig TBS-Triton udvinding. Sørg for, at embryoner rettet i PFA / MEMFA i mindst 2-3 timer eller helst natten over ved 4 ° C. Hvis problemet fortsætter, øge vasketiden af TBS-Triton til 3 i 1 time.
Under cryo-sektionning, kan stivheden af prøveblokken variere som forskellige partier af fiskegelatine har forskellige egenskaber. Dette problem kan delvis kompenseres ved indstilling af temperaturen af mikrotomen. En lavere temperatur vil resultere i en "hårdere" prøveblok dog under overdreven lav temperatur prøveblokken bliver sprød og vanskelig at sektionen. Nogle finjustering eller praksis (ved hjælp af mock sample blokke uden embryoner) før hver sektionering kan være gavnligt før brug på særligt værdifulde prøver.
Et almindeligt stødt problem under sektionering er de tynde sektioner tider tendens til at holde på den tykke glasplade snarere end bo fladt på stål scenen. Dette kan være særligt forstyrrende, da det hele tiden afbryder den kontinuerlige skæreproces. Sådanne tilfælde er normalt forårsaget af en af to grunde: afsnittet kammer og (især) tyk glasplade ikke være kold nok, eller overdreven statisk ladning på maskinen og operator, især i tørt vejr. Førstnævnte kan løses ved at skrue ned for temperaturen af sektionen kammeret og forlader glaspladen inden for ekstra tid (muligvis natten over); og sidstnævnte ved korrekt jordforbindelse kryostaten. Tilslutning af metaloverfladen af kryostaten til et metal hane eller lignende vand rørsystem lavet af metal kan være en alternativ måde at frigive de statiske ladninger. Efter hver brug skal tyk glasplade vaskes godt med ikke-korroderende detergent (såsom opvaskemiddel), skyllet med ultrarent vand, sprøjtes med ren ethanol, og pakket ind i håndklæde papir for at beskytte overfladen og kanterne ved skadelig.
De er anført i protokol antistoffer er generelt specifikke og vi sjældent støder uspecifik adsorption eller høj baggrund signal. Det skal bemærkes, at hvis hjælp varmeinaktiveret ged / lammeserum som blokerende middel, stærk varme-inaktivering (som visualiseret ved dannelsen af fluffy fældningsmiddel i serum) børundgås, da dette præcipitant er meget attraktiv for sekundære antistoffer og kan bidrage til en kilde med høj baggrund.
Det er muligt, og undertiden ønsket at udføre dobbelt-farvning til visualisering forskellige populationer af neuronale celler samtidigt. En sådan dobbelt-farvning er muligt og generelt giver tilfredsstillende resultater med følgende kombinationer: Sox3 / N-badekar eller Myt1 / N-badekar. Imidlertid er dobbelt-farvning af Sox3 og Myt1 kompliceres af, at de to antistoffer er begge fra kanin oprindelse. Vi har testet en række antistof direkte kits mærkning, men ingen tilfredsstillende resultater blev observeret (lavt signal-støj-niveau), muligvis på grund af manglende signal forstærkning fra sekundære antistoffer. En mulig fremgangsmåde til at omgå dette problem ville være at øge transgene linjer i Xenopus, som diskuteret nedenfor.
En af de vigtigste begrænsninger af denne protokol er, at mens denne protokol kunne tilstrækkeligt distinguish to vigtigste puljer af neuronale celler, nemlig Sox3-udtrykkende neural stamcelle pool og Myt1-udtrykkende differentierede neuroner, det mangler evnen til at afsløre forskellige subpopulationer af differentierede neuroner. Sådanne subpopulationer, som herunder, men ikke begrænset til, primære motoriske neuroner, interneuroner og sensoriske neuroner, er normalt kendetegnet ved deres differentielt udtrykte markørgener 28-30. Som nævnt ovenfor kan de seneste fremskridt i udviklingen af flerfarvet in situ hybridisering kombineret med antistof-baserede immunfluorescenspåvisningen metode i Xenopus embryoer udfylde hullet for at afsløre disse under-populationer af differentierede neuroner for potentiel undersøgelse 31. Alternativt, som er blevet påvist i mus model, vil det også være ønsket at rejse en mere omfattende sæt af celletype-specifikke antistoffer til at skelne sådanne forskellige cellepopulationer i Xenopus.
det erogså værd at nævne, at som et tillæg til denne metode, seneste fremskridt i optisk billeddannelse og billedanalyse, såsom multifoton mikroskopi, 3D-rekonstruktion, og segmentering, kan også anvendes efter indledende vurderinger til at opnå mere omfattende observationer af Xenopus oocytter samt tidlige embryoner, især under en live indstilling 32,33. Derfor, for at spore proliferation, differentiering, og flytning af neuronale celler i levende dyr, det ville være ønskeligt at etablere en eller flere transgene linjer, der huser fluorescerende proteiner drevet af celletype-specifik promotor for at tillade levende observation af sådanne cellepopulationer i begyndelsen Xenopus embryoner. Etableringen af et X. laevis linje med neuro-specifikke β-tubulin-promotor kørsel tauGFP og dens applikationer har givet en flot eksempel 23,34. Med de fulde promotorsekvenser både sox3 og myt1 kendetegnet ved hvirveldyr 35-37, er det shOuld være forholdsvis let at etablere yderligere transgene linjer i Xenopus som bør bidrage udstrakt grad til både Xenopus samfund og en mere generel felt af primær neurogenese forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Michael Klymkowsky i University of Colorado i Boulder og Prof. Nancy Papalopulu i University of Manchester for venligt at give anti-Sox3 og anti-Myt1 antistoffer hhv. Vi takker medlemmerne af Papalopulu laboratorium for deres indsigtsfulde forslag i at udvikle denne protokol. Dette arbejde blev støttet af to Healing Foundation stipendier til SZ og JL, to projekttilskud fra Healing Foundation til SZ / EA og JL / EA henholdsvis ét program bevilling fra Wellcome Trust til EA (WT082450MA), og en institutionel strategisk Support tilskud fra Wellcome Trust [097.820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |