تقدم هذه المقالة طريقة مريحة وسريعة لتصور مختلف السكان الخلية العصبية في الجهاز العصبي المركزي للأجنة القيطم باستخدام مناعي تلطيخ على أقسام.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
في الفقاريات، وتطوير الجهاز العصبي المركزي وتشمل عدة مراحل مميزة بعد التوالي. الخطوة الأولى هي الحث العصبي، وعندما يتم تحديد خلايا الأدمة ساذجة نحو مصير العصبي بدلا من مصير البشرة. وتشارك عدة آليات تنظيمية مترابطة خلال هذه المرحلة في القيطم وأنظمة نموذج الأخرى 1،2. ويتم تنسيق هذه العملية في المقام الأول بسبب عوامل يفرز التي تنتجها الأديم المتوسط الكامنة، مثل chordin، رأس، وفوليستاتين 3-7. بعد تحريض العصبي، مجموعة فرعية من الأسلاف العصبية الخروج من دورة الخلية وتبدأ في التفريق في العملية المشار إليها الخلايا العصبية كما الابتدائي. ليس كل السلائف العصبية تفرق في هذا الوقت. تستمر الخلايا العصبية السلائف المتبقية على التكاثر، وبالتالي الحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لاستمرار نمو الجهاز العصبي المركزي في جميع أنحاء التنمية وفي مرحلة البلوغ.
هذه العلاقات العامةoliferating الخلايا العصبية السلائف تتميز التعبير عنها من SRY (الجنس تحديد المنطقة Y) -box 3 (sox3) الجين 8-11. يتم تحديد سكانية أخرى من الخلايا، التي الخروج من دورة الخلية والالتزام مصير متباينة، من خلال التعبير عن علامات التمايز الجيني، تويولين، بيتا 2B الدرجة بنك الاستثمار الدولي (tubb2b، N-الحوض) والمايلين عامل النسخ 1 (myt1) 12-14. هذه الخلايا العصبية متباينة في نهاية المطاف تؤدي إلى فئات مختلفة من الخلايا العصبية بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، والسيارات، المشترك بين، والخلايا العصبية الحسية المتمركزة في مناطق متميزة داخل الأنبوب العصبي 15-17.
في حين تم بذل جهود كبيرة لكشف الآليات التنظيمية التي تحكم الزخرفة ومصير تحديد الأحداث في الأديم الظاهر العصبي الأمامي، أحرز اهتماما أقل على التحقيق في الأحداث العصبية التي تحدث بعدمرحلة الزخرفة الأولية. في الواقع، نقل الإشارة واللوائح النسخي، وكذلك التعديلات بعد متعدية وجميع المشاركين في هذه المرحلة في وقت لاحق، والسيطرة على كل من توقيت والنسب مواصفات خلال تكوين الخلايا العصبية 18-20. وتتطلب المزيد من التحقيقات في هذه الآليات وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتصور بسهولة وتميز مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية. N-الحوض المذكور أعلاه علامات العصبية، بما في ذلك، Sox3، Myt1، و، يمكن أن توفر وسيلة للتعرف على هؤلاء السكان مختلفة من الخلايا، وبالتالي توفير الأسس اللازمة للكشف عن الآليات الكامنة وراء تمايز الخلايا العصبية 21-23.
وعلى الرغم من تظاهر العلامات التفاضلية للسكان الخلية العصبية في الكائنات نموذج أخرى، استغل عدد قليل نسبيا من الدراسات النظام القيطم على أكمل وجه في هذا الصدد. ويرجع ذلك أساسا إلى قلة من الأجسام المضادة متوافقة التي تحدد موثوق neur مختلفالسكان الخلية اونال في الأنبوب العصبي. هنا، نحن تصف طريقة لتصور تمايز الخلايا العصبية في الأجنة القيطم في وقت مبكر عن طريق المناعية، التي توفر نهجا قويا ومريحة للتحقيق في تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في القيطم. هذا البروتوكول يجب أن تعطي توجيهات كافية للباحثين المهتمين في التنمية في وقت مبكر من الجهاز العصبي المركزي القيطم بين مرحلة ومرحلة 26 45.
نحن هنا لشرح طريقة مريحة وفعالة لتصور الخلايا العصبية الأولية في أجنة القيطم. يسمح هذا الأسلوب تقييم أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية الأولية متباينة باستخدام خلية علامات نوع محدد.
بروتوكول قوي عموما مع مستوى عال جدا من التكاثر. للأجنة التي هي في مراحل الفقس مسبقا (أي ما يصل لمرحلة 28)، ونحن نوصي إزالة الغشاء المحي قبل تثبيت يدويا كما يسمح هذا الأجنة إلى سدل بالكامل قبل التثبيت. هذا مهم بشكل خاص عند جمع الأجنة في مراحل مبكرة نسبيا (قبل الفقس)، منذ الأجنة عازمة صعبة للغاية لترتيب في الاتجاه المطلوب داخل غرفة في تصاعد مستمر. لم نشهد فقدان المناعة بعد MEMFA أو PFA تثبيت بالتالي إضافية خطوة استرجاع مستضد ليس من الضروري لهذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، وهذايمكن أن يتم إجراء المناعية في عينات من مولد اللون / الفلورية في الموقع التهجين. في هذا السيناريو، فمن المستحسن لتخطي البروتيني K خطوة العلاج خلال الموقع في بروتوكول التهجين. بعد مولد اللون / الفلورسنت رد فعل الركيزة، والعينات ويمكن غسلها مع TBS وجزءا لا يتجزأ من حل الجيلاتين الأسماك بطريقة مشابهة لMEMFA / PFA عينات ثابتة. قارورة العينة يمكن أن تكون محمية من الضوء من خلال التفاف قارورة في رقائق الألومنيوم إذا كان سيتم تصويرها الفلورية في الموقع التهجين مع تلوين مناعي في وقت لاحق.
في بعض الحالات، قد الأجنة يتقلص بشكل مفرط بعد اختراق الجيلاتين. وعلى الأرجح سبب ذلك إما غير كافية أو غير كافية تثبيت استخراج TBS-تريتون. ضمان أن الأجنة قد تم علاجها في PFA / MEMFA لمدة 2-3 على الأقل ساعة أو يفضل أن يكون بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إذا استمرت المشكلة، وزيادة وقت غسل TBS-تريتون إلى 3 لمدة 1 ساعة.
أثناء البرد التقطيعةنينغ، جمود كتلة عينة قد تختلف دفعات مختلفة اعتبارا من الجيلاتين الأسماك لها خصائص مختلفة. هذه المشكلة يمكن تعويضه جزئيا عن طريق ضبط درجة حرارة مشراح. وهناك انخفاض درجة الحرارة يؤدي إلى "صعوبة" كتلة عينة لكن تحت درجة حرارة منخفضة المفرطة يصبح كتلة العينة هش ويصعب القسم. بعض صقل أو ممارسة (باستخدام كتل عينة وهمية دون الأجنة) قبل كل باجتزاء قد يكون من المفيد قبل استخدامها على عينات قيمة خاصة.
وهناك مشكلة تصادفها أثناء باجتزاء هي الشرائح الرقيقة تميل أحيانا إلى عصا على لوحة زجاجية سميكة بدلا من البقاء شقة في مرحلة الصلب. هذا يمكن أن يكون لا سيما تعطيل لأنه يقطع باستمرار عملية باجتزاء مستمرة. وعادة ما تسبب هذه الحالات من جانب واحد من سببين: غرفة الباب و (خصوصا) لوحة زجاجية سميكة لا يجري الباردة بما فيه الكفاية، أو الإفراط في تهمة ثابتة على الجهاز وسperator، خصوصا في الطقس الجاف. الأول يمكن حلها من خلال رفض درجة حرارة الجزء الغرفة وترك لوحة من الزجاج داخل لوقت اضافي (ربما بين عشية وضحاها). وهذا الأخير من خلال زرع جذور ناظم البرد بشكل صحيح. يمكن ربط السطح المعدني للناظم البرد إلى الاستفادة من المعدن أو نظام أنابيب المياه مماثلة مصنوعة من المعدن يكون وسيلة بديلة للافراج عن رسوم ثابتة. بعد كل استخدام، يجب غسلها لوحة زجاجية سميكة بشكل جيد مع المنظفات غير قابلة للتآكل (مثل سوائل غسل الاطباق)، تشطف بماء عالى النقاء، رش مع الإيثانول النقي، وملفوفة في منشفة ورقية لحماية سطح وحواف من الاضرار.
الأجسام المضادة المدرجة في بروتوكول محددة عموما، ونحن نادرا ما تصادف الامتزاز غير محددة أو عالية إشارة الخلفية. وتجدر الإشارة إلى أنه في حالة استخدام الحرارة المعطل الماعز / لحم الضأن مصل كما منع وكيل، والإفراط في الحرارة تعطيل (كما تصور من قبل تشكيل مرسب رقيق في المصل) يجبينبغي تجنبها لأن هذا مرسب جذابة للغاية لالأجسام المضادة الثانوية ويمكن أن تسهم في مصدر خلفية عالية.
ومن الممكن، والمطلوب في بعض الأحيان، لأداء مزدوج تلطيخ لتصور مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية في وقت واحد. هذا المزدوج تلطيخ هو ممكن، ويعطي نتائج مرضية مع المجموعات التالية بشكل عام: Sox3 / N-الحوض أو / N-حوض Myt1. ومع ذلك، معقد المزدوج تلطيخ Sox3 وMyt1 من حقيقة أن الأجسام المضادة هما كلا من أصل أرنب. اختبرناها عدة مجموعات العلامات المباشرة الأجسام المضادة، ولكن لم يلاحظ أي نتائج مرضية (مستوى منخفض إشارة إلى الضوضاء)، وربما يعود ذلك إلى عدم وجود تضخيم إشارة من الأجسام المضادة الثانوية. كان أحد النهج الممكنة للتحايل على هذه المشكلة يكون لرفع خطوط المعدلة وراثيا في القيطم، كما هو مبين أدناه.
واحدة من القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه، في حين أن هذا البروتوكول يمكن فيه الكفاية ديstinguish حوضين رئيسيين من الخلايا العصبية، وهي تجمع الخلايا الجذعية العصبية، معربا عن Sox3 وMyt1، معربا عن الخلايا العصبية متباينة، إلا أنها تفتقر إلى القدرة على الكشف عن مختلف مجموعات فرعية من الخلايا العصبية متباينة. هؤلاء السكان من الباطن، والتي بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، الخلايا العصبية الحركية الأساسية، interneurons، والخلايا العصبية الحسية، وعادة ما تتميز الجينات علامة، وأعرب تفاضلي من 28-30. وكما ذكر أعلاه، التطورات الحديثة في تطوير متعدد الألوان في الموقع التهجين جنبا إلى جنب مع طريقة كشف المناعي القائم على الأجسام المضادة في الأجنة القيطم قد ملء الفجوة لكشف هؤلاء السكان من الباطن من الخلايا العصبية متباينة للتحقيق المحتملين 31. بدلا من ذلك، كما ثبت في نموذج الفئران، كما سيتم المطلوبة لرفع مجموعة أشمل من خلايا الأجسام المضادة من نوع معين لتمييز هؤلاء السكان خلية مختلفة في القيطم.
أنهكما تجدر الإشارة إلى أن، كإضافة إلى هذا الأسلوب، التطورات الحديثة في التصوير الضوئي وتحليل الصور، مثل المجهر multiphoton والتعمير 3D، وتجزئة، ويمكن أيضا أن تطبق بعد التقديرات الأولية لتحقيق الملاحظات أشمل من البويضات القيطم وكذلك الأجنة المبكرة، لا سيما في ظل يعيش وضع 32،33. لذلك، لتتبع انتشار، والتمايز، وحركة الخلايا العصبية في الحيوانات الحية، فإن المستوى المطلوب لإنشاء واحد أو أكثر من خطوط المعدلة وراثيا التي تأوي البروتينات الفلورية يقودها نوع محدد خلية المروج للسماح للمراقبة حية لهؤلاء السكان الخلية في وقت مبكر القيطم الأجنة. إنشاء اكس. وقد وفرت خط المورق مع العصبية محدد β تويولين المروج القيادة tauGFP وتطبيقاته على سبيل المثال لطيفة 23،34. مع تسلسل المروج الكاملة للsox3 وmyt1 تتميز في الفقاريات 35-37، فمن شولد يكون من السهل نسبيا لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا إضافية في القيطم التي ينبغي أن تساهم على نطاق واسع في كل من المجتمع القيطم ومجال أكثر العام للبحوث الخلايا العصبية الابتدائية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر البروفيسور مايكل Klymkowsky في جامعة كولورادو في بولدر والبروفيسور نانسي Papalopulu في جامعة مانشستر لتوفير يرجى مكافحة Sox3 ومكافحة Myt1 الأجسام المضادة، على التوالي. نشكر أعضاء المختبر Papalopulu للحصول على اقتراحات الثاقبة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل اثنين من شفاء دراسية مؤسسة لSZ وJL، منحتين المشروع من مؤسسة شفاء لSZ / EA وJL / EA على التوالي، منحة برنامج واحد من ويلكوم ترست لEA (WT082450MA)، واحد منحة الدعم المؤسسي الاستراتيجية من ويلكوم ترست [097820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |