Dit artikel een gemakkelijke en snelle werkwijze voor het visualiseren van verschillende neuronale celpopulaties in het centrale zenuwstelsel van embryonale ontwikkeling middels immunofluorescentiekleuring op de afdelingen.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
In vertebraten, de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel omvat meerdere duidelijkere en opeenvolgende fasen. De eerste stap is neurale inductie bij naïeve ectodermale cellen worden gespecificeerd naar een neuraal lot plaats van een epidermale lot. Meerdere onderling verbonden regulerende mechanismen betrokken in deze fase van Xenopus en andere modelsystemen 1,2. Dit proces wordt voornamelijk gecoördineerd door uitgescheiden factoren die door de onderliggende mesoderm, zoals chordine, noggin en follistatin 3-7. Na neurale inductie, een deelverzameling van neurale voorlopercellen verlaat de celcyclus en beginnen te differentiëren in genoemd neurogenese primaire proces. Niet alle neuronale precursoren differentiëren op dit moment. De overblijvende neurale precursorcellen blijven prolifereren en hielden daar de stamcel pool nodig voor verdere groei van het centrale zenuwstelsel tijdens de ontwikkeling en in de volwassenheid.
deze proliferating neurale precursorcellen worden gekenmerkt door hun expressie van SRY (geslacht bepalend gebied Y) -box 3 (sox3) gen 8-11. De andere populatie van cellen, die afrit de celcyclus en zich verbinden tot een gedifferentieerd lot, worden geïdentificeerd door de expressie van de differentiatie-gen markers, tubuline, beta 2B klasse IIb (tubb2b, N-bad) en myeline transcriptiefactor 1 (myt1) 12-14. De gedifferentieerde neuronale cellen uiteindelijk aanleiding geven tot verschillende soorten neuronen waaronder, maar niet beperkt tot, motor, inter- en sensorische neuronen gelegen in verschillende gebieden in de neurale buis 15-17.
Hoewel aanzienlijke inspanningen zijn gewijd aan het blootleggen van de regulerende mechanismen die de patronen en het lot bepalen van de gebeurtenissen in de voorste neuroectoderm regeren, heeft minder aandacht geboekt bij het onderzoek naar de neurogene gebeurtenissen die zich voordoen na deaanvankelijke patroonvorming podium. Inderdaad, signaaltransductie, transcriptionele regelgeving, evenals post-translationele modificaties zijn allemaal betrokken bij dit later stadium, het beheersen van zowel de timing en het geslacht specificatie tijdens de neurogenese 18-20. Verder onderzoek naar deze mechanismen vereisen een betrouwbare methode om gemakkelijk te visualiseren en te onderscheiden verschillende populaties van neuronale cellen. De bovengenoemde neurale markers, waaronder Sox3, Myt1 en N-bad, kan een middel voor het identificeren van deze verschillende celpopulaties, waardoor de noodzakelijke basis voor het openbaren van de onderliggende mechanismen van neuronale differentiatie 21-23.
Hoewel differentiële labeling van neuronale celpopulaties zijn aangetoond in andere modelorganismen, relatief weinig studies de Xenopus systeem krijgen tot zijn recht in dit verband. Dit is voornamelijk te wijten aan een gebrek aan compatibele antilichamen die op betrouwbare wijze de verschillende neur identificerenonale cel bevolkingsgroepen in de neurale buis. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van neuronale differentiatie in vroege embryonale ontwikkeling via immunokleuring, die een krachtige en gemakkelijke benadering voor het onderzoeken van primaire neurogenese in Xenopus verschaft. Dit protocol moet voldoende leidraad voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de vroege ontwikkeling van Xenopus centrale zenuwstelsel tussen fase 26 en fase 45.
Hier laten we een handige en efficiënte methode voor het visualiseren primaire neurogenese in Xenopus embryo. Deze methode maakt de beoordeling van verschillende soorten neurale cellen, zoals neuronale stamcellen en gedifferentieerde neuronen primaire behulp celtype-specifieke merkers.
Het protocol is algemeen robuust met zeer hoge reproduceerbaarheid. Voor embryo's die zijn dan vooraf uitkomen stadia (dwz tot stadium 28), raden we aan het handmatig verwijderen van de vitelline membraan voorafgaand aan fixatie als dit maakt het mogelijk embryo's volledig krul voor fixatie. Dit is vooral belangrijk bij het verzamelen van embryo's bij relatief vroeg stadium (voor het uitkomen), aangezien gebogen embryo uiterst moeilijk te regelen in de gewenste oriëntatie in de montage kamer. We hebben niet ervaren een verlies van immunogeniciteit na MEMFA of PFA fixatie dus extra antigeenterugtrekking stap is niet nodig voor dit protocol. Daarnaast is dezeimmunokleuring procedure kan worden uitgevoerd op monsters van chromogene / fluorescente in situ hybridisatie uitgevoerd. In een dergelijk scenario, is het raadzaam om het protease K behandeling stap tijdens de in situ hybridisatie protocol over te slaan. Na chromogeen / substraat fluorescent reactie kan monsters gewassen met TBS en ingebed in visgelatine oplossing op dezelfde manier MEMFA / PFA gefixeerde monsters. Monsterflesjes niet blootstaat aan licht door het wikkelen van de flacons in aluminiumfolie of fluorescente in situ hybridisatie worden met immunofluorescentie kleuring later afgebeeld.
In sommige gevallen kan embryo overmatig krimpen na gelatine penetratie. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een onvoldoende fixatie of onvoldoende TBS-extractie Triton. Controleer of embryo's in PFA / MEMFA vastgesteld ten minste 2-3 uur en bij voorkeur overnacht bij 4 ° C. Als het probleem aanhoudt, verhoging van de wastijd van TBS-Triton tot 3 voor 1 uur.
Tijdens cryo-sectioning, de stijfheid van monsterblok kan variëren als verschillende partijen visgelatine verschillende eigenschappen. Dit probleem kan gedeeltelijk worden gecompenseerd door aanpassing van de temperatuur van het microtoom. Een lagere temperatuur resulteert in een "hardere" monsterblok echter onder zware lage temperatuur het monsterblok wordt helder en moeilijk punt. Sommige fine-tuning of gebruiken (met behulp van mock sample blokken zonder embryo's) voor elke snijden kan gunstig zijn voor gebruik op bijzonder waardevol monsters.
Een veel voorkomende probleem tijdens snijden is de dunne secties soms de neiging om vast te houden op de dikke glasplaat in plaats van te blijven plat op de stalen podium. Dit kan met name het verstoren, omdat het voortdurend onderbreekt de continue snijbeweging. Dergelijke gevallen worden meestal veroorzaakt door een van twee redenen: de sectie kamer en (vooral) de dikke glasplaat niet te koud genoeg is, of overmatige statische lading op de machine en de operator, vooral bij droog weer. De eerste kan worden opgelost door het draaien van de temperatuur van de sectie kamer en het verlaten van de glasplaat binnen voor extra tijd (eventueel 's nachts); en de laatste door de juiste aarding van de cryostaat. het metalen oppervlak van de cryostaat aansluiten op een metalen kraan of soortgelijke water tubing systeem van metaal kan een alternatieve manier om de statische lading vrij te geven. Na elk gebruik, moet de dikke glasplaat goed worden gewassen met een niet-bijtend schoonmaakmiddel (zoals afwasmiddel), gespoeld door ultrapuur water, worden besproeid met zuivere ethanol, en gewikkeld in een handdoek papier om het oppervlak en de randen te beschermen tegen beschadiging.
De in het protocol genoemde antilichamen zijn in het algemeen specifiek en we zelden tegenkomen niet-specifieke adsorptie of hoge achtergrond signaal. Opgemerkt wordt dat, bij gebruik van hitte-geïnactiveerd geit / lam serum als blokkeermiddel, hitte-inactivatie (zoals zichtbaar gemaakt door de vorming van zachte neerslagmiddel in het serum) bereikenworden vermeden omdat dit neerslagmiddel is zeer aantrekkelijk voor secundaire antilichamen en kunnen bijdragen aan een bron van hoge achtergrond.
Het is mogelijk en soms gewenst om dubbele kleuring uitvoeren om verschillende populaties van neuronale cellen gelijktijdig te visualiseren. Dergelijke dubbele-kleuring is mogelijk en in het algemeen geeft bevredigende resultaten met de volgende combinaties: Sox3 / N-tub of Myt1 / N-bad. Echter, dubbele kleuring van Sox3 en Myt1 gecompliceerd door het feit dat de twee antilichamen zijn beiden van konijnen oorsprong. We hebben verschillende antilichaam direct merken kits, maar geen bevredigende resultaten werden waargenomen (laag signaal-ruisniveau) getest, mogelijk als gevolg van het ontbreken van signaalversterking van secundaire antilichamen. Eén mogelijke benadering om dit probleem te omzeilen is om transgene lijnen in Xenopus verhogen, zoals hierna besproken.
Een van de belangrijkste beperkingen van dit protocol is dat, terwijl dit protocol zou voldoende distinguish twee pools van neuronale cellen, namelijk de Sox3 expressie neurale stamcel zwembad en Myt1 expressie gedifferentieerde neuronen, het mist de mogelijkheid om verschillende subpopulaties van gedifferentieerde neuronen te onthullen. Dergelijke sub-populaties, die inclusief, maar niet beperkt tot, primaire motorische neuronen, interneuronen en sensorische neuronen, worden meestal gekenmerkt door hun differentieel tot expressie merkergenen 28-30. Zoals hierboven vermeld, kunnen de recente vooruitgang in de ontwikkeling van veelkleurige in situ hybridisatie gecombineerd met immunofluorescentie antilichamen gebaseerde detectiemethode in Xenopus embryo's in de leemte deze subpopulaties van gedifferentieerde neuronen te onderzoeken op mogelijke 31. Als alternatief, zoals is aangetoond in muizen model, zou het ook gewenst zijn om een uitgebreidere reeks celtype-specifieke antilichamen te maken tegen verschillende celpopulaties onderscheiden Xenopus.
Het isook vermeldenswaardig dat, als aanvulling op deze werkwijze, recente ontwikkelingen in optische beeldvorming en beeldanalyse zoals multifoton microscopie, 3D reconstructie en segmentatie, kan ook worden aangebracht na de eerste beoordelingen voor uitgebreidere opmerkingen van Xenopus oöcyten en bereiken vroege embryo's, met name onder een levende instelling 32,33. Daarom, om de proliferatie, differentiatie en beweging van neuronale cellen in levende dieren te volgen, zou het wenselijk zijn om één of meer transgene lijnen die fluorescerende eiwitten aangedreven door celtype-specifieke promotor herbergen live waarneming van dergelijke celpopulaties in vroege Xenopus, kan worden gecontroleerd embryo. De oprichting van een X. laevis lijn met neuro-specifieke β-tubuline promotor die tauGFP en haar toepassingen hebben verstrekt een mooi voorbeeld 23,34. Met de volledige promotorsequenties volgens zowel sox3 en myt1 kenmerk vertebraten 35-37 is shOuld relatief eenvoudig om extra transgene lijnen in Xenopus die op grote schaal zou moeten bijdragen aan zowel de Xenopus gemeenschap en een meer algemene gebied van primaire neurogenese onderzoek vast te stellen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Prof. Michael Klymkowsky aan de Universiteit van Colorado in Boulder en prof Nancy Papalopulu in de Universiteit van Manchester voor vriendelijk het verstrekken van anti-Sox3 en anti-Myt1 antilichamen, respectievelijk. Wij danken de leden van de Papalopulu lab voor hun inzichtelijke suggesties bij de ontwikkeling van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door twee Healing Foundation studentships te SZ en JL, twee projectsubsidies van de Healing Foundation om SZ / EA en JL / EA respectievelijk één programma subsidie van de Wellcome Trust EA (WT082450MA), en één institutionele strategische ondersteuning subsidie van de Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |