Summary
Dieser Artikel stellt eine bequeme und schnelle Methode für die verschiedenen neuronalen Zellpopulationen im zentralen Nervensystem von Xenopus - Embryonen zu visualisieren mit Immunfluoreszenzanfärbung auf Abschnitte.
Introduction
In Vertebraten umfaßt die Entwicklung des zentralen Nervensystems mehrere ausgeprägteres aufeinanderfolgenden Stufen. Der erste Schritt ist neurale Induktion, wenn naive ektodermalen Zellen zu einem neuronalen Schicksals angegeben sind und nicht als epidermal Schicksal. Mehrere miteinander verbundene Regulationsmechanismen sind 1,2 in dieser Phase in Xenopus und anderen Modellsystemen beteiligt. Dieser Prozess wird in erster Linie koordiniert von sezernierten Faktoren , die von der zugrunde liegenden Mesoderm erzeugt, wie chordin, Noggin und Follistatin 3-7. Nach neurale Induktion Beenden einer Untergruppe von neuralen Vorläuferzellen in den Zellzyklus und beginnen, in einem Verfahren, das als primäre Neurogenese bezeichnet unterscheiden. Nicht alle neuronalen Vorläufern unterscheiden zu diesem Zeitpunkt. Die verbleibenden neuralen Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wodurch die Stammzellpools Aufrechterhaltung für das weitere Wachstum des zentralen Nervensystems während der Entwicklung benötigt und bis ins Erwachsenenalter.
Diese prneurale Vorläuferzellen oliferating zeichnen sich durch die Expression des SRY (Geschlecht bestimmende Region Y) -Box 3 (SOX3) Gen 8-11 aus. Die andere Population von Zellen, die Ausfahrt des Zellzyklus und zu einem differenzierten Schicksal begehen, werden durch die Expression des Differenzierungs Genmarker, Tubulin Beta 2B Klasse IIb identifiziert (tubb2b, N-Wanne) und Myelintranskriptionsfaktor 1 (Myt1) 14.12. Solche differenzierte neuronale Zellen schließlich zu unterschiedlichen Gruppen von Neuronen geben , einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Motor, inter- und sensorisch in verschiedenen Bereichen innerhalb des Neuralrohrs 15-17 positioniert Neuronen.
Während erhebliche Anstrengungen zur Aufdeckung der Regulierungsmechanismen gewidmet wurden, die die Strukturierung und das Schicksal das Bestimmen von Ereignissen in der vorderen Neuroektoderms regeln, weniger Aufmerksamkeit wurde auf die Untersuchung der neurogenen Ereignisse, die folgenden Voraussetzungen erfüllt sind dieAnfangsmusterstadium. Tatsächlich, Signaltransduktion, Transkriptions Vorschriften sowie post-translationale Modifikationen sind alle in diesem späteren Zeitpunkt beteiligt, sowohl zeitlich als auch Abstammungslinie Spezifikation während der Neurogenese 18-20 steuern. Weitere Untersuchungen in dieser Mechanismen erfordert eine zuverlässige Methode, um leicht zu visualisieren und verschiedene Populationen von neuronalen Zellen zu unterscheiden. Die oben erwähnte neurale Marker, einschließlich, SOX3, Myt1 und N-Wanne, kann ein Mittel bereitstellen , um diese verschiedenen Zellpopulationen zu identifizieren und so die notwendigen Grundlagen für die Bereitstellung 21-23 die zugrunde liegenden Mechanismen der neuronalen Differenzierung offenbaren.
Obwohl differentielle Markierung von neuronalen Zellpopulationen in anderen Modellorganismen, relativ wenige Studien , die die Xenopus - System in ihrem vollsten in dieser Hinsicht ausgenutzt nachgewiesen. Dies ist vor allem auf eine geringe Zahl kompatibler Antikörper, die zuverlässig die verschiedenen neur identifizierenonal Zellpopulationen im Neuralrohr. Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Differenzierung in frühen Xenopus - Embryonen über Immunfärbung, die für die Untersuchung von primären Neurogenese in Xenopus eine robuste und bequeme Ansatz bietet. Dieses Protokoll sollte eine ausreichende Führung für die Forscher in der frühen Entwicklung von Xenopus zentralen Nervensystems zwischen Stufe 26 und Stufe 45 interessierte geben.
Protocol
Alle Tierversuche wurden von der University of Manchester Animal Welfare Center genehmigt und wurden von einem britischen Home Office Projektlizenz abgedeckt.
1. Erhebung und Fixierung von Xenopus Embryonen
- Bereiten Sie Reagenzien und Materialien für Experimente.
- Bereiten 10x Marc-modifiziertem Ringers (MMR) , indem in etwa 800 ml Reinstwasser 56,5 g NaCl gelöst und Zugabe Stammlösungen von 1 M KCl, 1 M MgSO 4, 1 M CaCl 2 und 1 M HEPES , pH 7,4 , um eine Endkonzentration zu erreichen , von 20 mM KCl, 10 mM MgSO 4, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES. PH-Wert auf 7,4 mit 10 M NaOH und dann um das Endvolumen auf 1 l einzustellen
- Sterilisieren der 10x MMR Lösung durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 min auf einem Flüssigkeitskreislauf. Bei der Verwendung, verdünnt mit ddH 2 O auf 0,1 × Endkonzentration und fügen 20 mg / L Gentamycin mikrobielles Wachstum zu hemmen.
- Machen 10x TBS-Lösung durch Mischen von 24 g Tris-HCl, 5,6 g Tris-base, 88 g NaCl und in etwa 900 ml Reinstwasser gelöst wird. Die endgültige Lösung einen pH-Wert von etwa 7,6 haben. Passen Sie entweder mit 10 M NaOH oder konzentrierter HCl einen endgültigen pH-Wert von 7,6 und endgültige Volumen auf 1 L. zu erreichen
- verwenden, stellen Sie 1x TBS Nach durch Verdünnen von 1 Teil 10x TBS-Lösung mit 9 Teilen Reinstwasser.
- Machen 10x MEM Salz durch Lösen von 209,2 g MOPS in ca. 800 ml Reinstwasser und Zugabe von Stammlösungen von 0,5 M EGTA und 1 M MgSO 4 in einer Endkonzentration von 20 mM EGTA, 10 mM MgSO 4 zu erreichen. PH-Wert auf 7,4 mit 10 M NaOH und dann um das Endvolumen auf 1 l einzustellen
- Sterilisieren des MEM-Salzlösung durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 min auf einem Flüssigkeitskreislauf (die Lösung von einigen Monaten Lagerung bei Raumtemperatur vergilben kann oder nachdem sie autoklaviert wurde, aber diese Änderung in der Farbe beeinflußt nicht ihre Verwendung ). Verwenden Sie jedoch nicht die Lösung nach längerer Lagerung (mehr als 6 Monate).
- Machen Sie 1x MEMFA-Lösung durch Verdünnen von 1 Teil MEM Salze, 1 Teil 37% Formaldehyd mit 8 Teilen Reinstwasser (v / v, stabil bei 4 ° C für mindestens 1-2 Wochen).
- Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd in TBS (für nachfolgende Färbung beteiligt phalloidin) durch Auflösen von 4 g Paraformaldehyd Pulver in 100 ml 1x TBS-Lösung Die Lösung wird auf 60 ° C und ein paar Tropfen von 10 M NaOH Auflösung zu unterstützen. Aliquotieren in 5-10 ml Volumen und Frost in -20 ° C. wieder einfrieren nicht einmal aufgetaut.
ACHTUNG: Paraformaldehyd Pulver ist ein Reizmittel und ist giftig beim Einatmen, wodurch die Wiegeschritt sollte in einem Abzug durchgeführt werden. - Beschriften Sie so viele 4 ml Glasfläschchen mit Schraubverschluss vor der Probenahme.
- Vorbereitung 15% Gelatine / 15% Saccharose durch Eingießen 20 ml 40% Fischgelatine (pre-Wärme in einem 50 ° C Wasserbad) in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. In 8 g Saccharose und füllen Sie das Rohr in die 50 ml Linie mit 1x TBS.
- Legen Sie die Gelatine Rohr auf einem Rotationsmischer oder RollbettNacht bei Raumtemperatur zu mischen. Diese Gelatinelösung ist stabil bei 4 ° C für 1 Woche. Keine abgelaufenen Lösung verwenden und Frost-Tau.
- Vorbereiten und Fix X. laevis oder X. tropicalis Embryos zu kultiWunsch Stages.
- Kultur die befruchtete X. laevis oder X. tropicalis Embryonen in 0.1x MMR mit Gentamicin , bis die gewünschten Stufen.
HINWEIS: Im Allgemeinen sammeln Embryonen zwischen den Stufen 23 und 40. Später Sammlung von Embryonen nach der Stufe 40 ist möglich, vor allem, wenn axonalen Wachstum aus dem Rückenmark zu beobachten, aber bedenken Sie, dass zusätzliche Gelatine Penetrationszeit erforderlich. Die Embryonen werden können Wildtyp, transgenen, mutant, Inhibitor behandelten, Morpholino (MO) -injected oder durch Elektroporation 23,24. - Sammeln Sie 20-50 Embryonen in jedem 4 ml-Glasfläschchen, entfernen Sie so viel Medium wie möglich und ersetzen mit MEMFA.
HINWEIS: Bei anschließender Färbung phalloidin beinhaltet, verwenden Sie 4% Paraformaldehydanstelle von MEMFA da kommerziellen geliefert Formaldehyd-Lösungen enthalten in der Regel bis zu 10% Methanol als Stabilisator, der mit Phalloidin-Färbung stören. - Fix über Nacht bei 4 ° C, oder, wenn in einer Dringlichkeit, bei Raumtemperatur für 2 Stunden auf einem Rotationsmischer. Die Embryonen werden in Fixierungslösung für mindestens 1 Woche bei 4 ° C stabil sein.
- Nach der Fixierung, waschen Sie die Embryonen 3 mal 20 min mit 1x TBS mit 0,05% Triton X-100. Nach dem letzten Waschen entfernen, so viel TBS-Triton wie möglich und 3 ml 15% Gelatine / 15% Saccharose in jedem Fläschchen.
- Legen Sie die Fläschchen auf einer Walze über Nacht bei Raumtemperatur Bett. Für Embryonen älter als Stufe 40, verwenden Sie mindestens 24 Stunden von Penetrationszeit. Nach dem Eindringen, gehen Sie sofort zum Abschnitt 2.2 auf den nächsten Tag.
- Kultur die befruchtete X. laevis oder X. tropicalis Embryonen in 0.1x MMR mit Gentamicin , bis die gewünschten Stufen.
2. Montage und Kryoschneiden von Xenopus Embryonen
- Bereiten Sie Reagenzien und Materialien für Experimente.
- Nehmen Sie eine Schachtel positiv charged gleitet, idealerweise ungeöffnet.
HINWEIS: Wenn geöffnet, halten Sie die Folien in einem trockenen Zustand (wie einem trockenen Box) und innerhalb von 1 Monat verwenden die statische Ladung auf den Folien eingehalten wird, um sicherzustellen. Verwenden Sie keine abgelaufenen Dias da Proben während der Immunfärbung fallen wird. - Pre-Kühlen der Kryostatkammer bis -30 ° C. Stellen Sie die Geräteparameter als -35 ° C für Mikrotom und 12 & mgr; m Schnittdicke. Installieren Sie das dicke Deckglasplatte auf die Bühne und lassen Sie den Kryostaten für mindestens 30 min äquilibrieren, bevor Abschnitt beginnt.
- Bereiten Sie Malerei Pinsel für Profilleisten bewegen, halten im Inneren der Kryostatkammer.
- Bereiten Sie Bleistifte auf Folien für das Schreiben, legte sie bei Raumtemperatur.
- Tragen Sie Handschuhe während Kryoschnittes. Verwenden Sie keine bloßen Händen.
- Nehmen Sie eine Schachtel positiv charged gleitet, idealerweise ungeöffnet.
- Montage Xenopus Embry
- Vorsichtig absaugen 5-10 Embryonen aus dem Fläschchen Glas mit einem Kunststoff- oder Glaspipette ohne die Einführung von Luftblasen verwendet wird. Übertragen Sie die Embryonen inan der Montagekammer und unter einem Stereoskop beobachten. Füllen Sie die Montagekammer mit Gelatine-Lösung, um die Steifigkeit des Abschnitts Blocks gewährleisten.
- Ordnen Sie die Embryonen gemäß Abbildung 1 ein Paar von Fein Spitze einer Pinzette. Markieren Sie die Ausrichtung der Köpfe durch einen Pfeil auf dem Rand der Kammer Zeichnung eines kryogenen-kompatiblen Marker. Bei mehreren Gruppen von Embryonen, schreibe bitte die Beschreibung der einzelnen Gruppen auf den Rand der entsprechenden Kammer als auch nach unten.
- Vorsichtig die Kammer horizontal in einem Schaumkasten mit Trockeneis zur Hälfte gefüllt und den Deckel schließen. Beachten Sie die Montagekammer freeze in 5-10 min. An jeder Kammer seriell (dh legen Sie die vorherige Kammer auf Trockeneis , bevor mit dem nächsten fortfahren) , da dies für jede Kammer ausreichend Zeit lassen wird, einzufrieren und die verhindern , dass das Trockeneis - Box überfüllt zu werden.
HINWEIS: Gefrorene Montagekammern müssen nicht horizontal zu stehen und in der Box werden können gestapelt. - Fahren Sie mit Kryoschneiden oder, falls erforderlich, bei -80 gefrorenen Proben halten ° C für mindestens 1-2 Wochen ohne Immunogenität zu verlieren.
- Kryoschnittes von Xenopus Embryonen Mounted
- Entfernen einer gefrorenen Probenblocks aus der Kammer durch den Boden der Kammer gedrückt ein stumpfes Stock (wie ein Stift) verwendet wird.
- Fügen Sie einige Tropfen Gewebe-Gefriermedium, (ein Polyethylenglykol und Polyvinylalkohol enthaltenden Medium) auf die Probenhaltescheibe und montieren Sie den Probenblock mit dem vorderen Ende der Embryonen nach oben zeigt (Abbildung 2). Lassen Sie den mounted- Block für ca. 1 min innerhalb der Kryostatkammer stehen oder bis das Gewebe-Gefriermedium wird undurchsichtig.
- Unmittelbar nach der Scheibe Probenhalterung installieren auf dem Mikrotom mit der unteren Seite des Blocks Probe nach oben zeigt. Schneiden Sie einen Teil des Probenblocks unter Verwendung einer Klinge, wenn der Probenblock noch relativ "weiche" ist die Länge eines jeden Abschnitts zu reduzieren(wenn gewünscht). Verlassen die Probenhaltescheibe am Mikrotom für mindestens 5 min um seine Temperatur zu ermöglichen, das Gleichgewicht zu erreichen.
- Allmählich schneiden Sie den Probenblock nach unten, bis die Köpfe der Kaulquappen sichtbar durch die transluzente Gelatine sind. Zur Erhöhung der Geschwindigkeit Trimmen, der höher (dicker) Einstellung der Schnittdicke (zB 20-25 uM) in dieser Phase (wie zB Aktivierung der "Trimm" Option) , aber nicht zu dick , weil Probenblock aus der Probenhaltescheibe fallen kann . Beachten Sie die Leistung des Kryostaten, wie die Schärfe und der Winkel der Klinge in dieser Stufe die Erzeugung eines langen Streifens von nachfolgenden Abschnitten zu gewährleisten.
- Sobald die Kaulquappe Köpfe sichtbar werden, passen Sie die Einstellungen des Kryostaten wieder normal (zB 10-12 uM) und reinigen sowohl die Mikrotom und Bühne einen Pinsel verwenden. machen Sie vorsichtig 2-3 Abschnitte als Versuch das Handrad Einstellung mit (nicht die motorisierte Einstellung verwenden), um sicherzustellen, dass fertige Scheiben str bilden könnenips, nicht überlappenden oder an der Klinge haften.
- Weiter Trimmen, bis die Köpfe von Kaulquappen fast ausgesetzt sind (dies einige Erfahrung benötigen, aber erreichbar). Bürsten Sie alle Überbleibsel Abschnitte auf der Bühne aus, und die Sammlung von Beispiel Abschnitte beginnen wird.
- Machen Sie ca. 10-15 Abschnitte und lassen sie einen langen Streifen bilden.
- Flip über die dicke Deckglasplatte zur Seite und entfernen Sie vorsichtig den Streifen von der Klinge mit einer feinen Spitze Pinsel und ordnen sie auf der Bühne mit langen Achse parallel zur Klinge.
- Wählen Sie eine positiv geladene Objektträger bei Raumtemperatur, beschriften Sie sie mit einem Bleistift (die bei der anschließenden Färbung Behandlungen abgewaschen werden nicht), drücken Sie es schnell, aber fest auf den Streifen mit der beschrifteten Seite nach unten und entfernen Sie die Folie aus der Kryostatkammer. Wenn es richtig gemacht, kleben die Streifen sofort in den positiv geladenen Schieber (3A).
- Wiederholen Sie diesen Schritt 20-30 Scheiben auf jeder geschoben zu haben,e und parallel (3B) angeordnet sind . Dies ist ausreichend , um die gesamte Region des Gehirns von X. zu decken tropicalis Embryonen und die meisten Vorderhirns und des Mittelhirns Regionen X. laevis Embryonen.
- Der Luft trocknen die Folien für 10 Minuten, gehen Sie sofort oder, speichern Sie die Folien in einer Dia-Box bei -80 ° C für mindestens 3-6 Monate ohne Immunogenität zu verlieren.
3. Immunfärbung von Sectioned Xenopus Embryonen
- Bereiten Sie Reagenzien und Materialien für Experimente.
- Bereiten 0,05% TBS-Triton X-100 von Triton X-100 in TBS 1x Zugabe einer Endkonzentration von 0,05% zu erreichen. Diese Lösung ist stabil bei Raumtemperatur für 3-4 Tage. Keine abgelaufenen Lösung verwenden.
- Bereiten 5% hitzeinaktiviertes Ziegenserum oder 5% BSA in TBST als Blocking-Puffer. Erstens wärme inaktivieren die Ziege / Lammserum von ca. 20-30 ml Serum in einem 65 ° C Wasserbad für 30-60 min setzt. Aliquots in 1,5-ml-ZentrifugenRohre und gefrier in -20 ° C. Eine erneute Inaktivierung ist erforderlich bei der Verwendung.
- Verdünne das hitzeinaktiviertes Serum oder BSA in TBST eine Endkonzentration von 5% vor der Verwendung zu erzielen.
- Bereiten geeigneten primären Antikörper gemäß Verdünnungen in Blocking - Puffer (beispielsweise 1: 500 Anti-SOX3 10,25 / 1: 250 Anti-Myt1 26 / anti-acetyliertes Tubulin). Verwenden Sie ca. 100 & mgr; l Antikörperlösung auf jeder Folie.
- Bereiten geeignete fluoreszierende Antikörper (zB Anti-Maus / Kaninchen roten Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes Antikörper) in Blockierungspuffer ( in der Regel 1: 500).
- (Optional) In rot fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten Phalloidin (1: 500) in sekundären Antikörper-Mix Aktinnetzwerk zu offenbaren.
- (Optional) In DAPI (0,5 ug / ml Endkonzentration) in sekundären Antikörper-Mix Kernlokalisierung zu visualisieren.
- Nehmen Sie die anti-fade Befestigungsmittel aus dem Gefrierschrank und tauen im Raumtemperaturwasserbad.
- Immunostaining
- Entfernen Sie die gefrorenen Dias von -80 ° C und legen sie auf einem Stück Tuch Papier in einer Abzugshaube für mindestens 1 Stunde keine kondensierte Wassertröpfchen zu beseitigen, dann backen die getrockneten Folien auf einem 85-90 ° C Wärmeblock mit der Scheiben für 15 min nach oben den Haftmechanismus zu aktivieren. Schließlich erlauben die Objektträger abkühlen auf Raumtemperatur (mindestens 10 min).
- Füllen Sie das Färbeküvette mit reinem Aceton und Inkubation der Objektträger in Aceton für 10 min Fischgelatine zu entfernen. Wenn mehrere Folien zu behandeln sind, ordnen sie auf einem Färbebank. Der Luft trocknen die behandelten-Folien für 15 min in einer Abzugshaube. Sie nicht das Aceton wiederverwenden.
- ziehen Sie vorsichtig einen Ring um die Proben auf der Folie ein PAP Stift ohne die Proben zu berühren. Stellen Sie sicher, dass der Ring in sich geschlossene, sonst Antikörperlösung fließt aus während der Färbung. Vollständig trocknen die PAP Stift Ring.
- Füllen Sie ein weiteres Färbeküvette mit 1x TBS ohne Triton X-100. InserT die ausgetrockneten Dias in den Färbeküvette und erlauben Rehydrierung für mindestens 1 Stunde. In der Zwischenzeit, bereiten durch Verdünnen entweder hitzeinaktiviertem Ziegenserum oder BSA zu 5% Endkonzentration unter Verwendung von 1x TBS mit 0,05% Triton X-100 den Blockierungspuffer.
- Machen Sie ein nasses Feld um 1-2 6-Well-Platten in einem Klick-Verschluss Lebensmittel-Box platzieren und füllen die Vertiefungen zur Hälfte mit Reinstwasser. Entfernen Sie rehydrierter Dias aus dem Färbeküvette und legen Sie sie horizontal auf den 6-Well-Platten (ohne Platten Deckel).
- Vorsichtig 300-600 ul Puffer innerhalb des PAP Ring blockiert. Verschließen Sie den nassen Feld durch den Deckel in Position zu verriegeln und bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde.
- Verdünnen Sie die entsprechenden primären Antikörper in Blocking-Puffer. Im Allgemeinen verwenden 100-150 ul verdünnten Antikörperlösung pro Folie. Wenn mehrere Folien verarbeitet werden, skaliert das Volumen proportional nach oben.
- Nach dem Blockieren vorsichtig den Blockierungspuffer von Dias durch Absaugen entfernen und schnell p hinzufügenrimary Antikörperlösung trocken-out zu verhindern, dann das nasse Feld versiegeln und über Nacht bei 4 ° C inkubiert.
- Am nächsten Tag, entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus den Folien durch Aspiration. mit 1x TBS gefüllt mit 0,05% Triton X-100, 3-mal, jeweils 15 min Waschen Sie die Folien durch in Färbeschalen einlegen. Inzwischen verdünnen die geeigneten Fluoreszenz sekundären Antikörper mit Blocking-Puffer (mit oder ohne DAPI oder Phalloidin).
- Sorgfältig 100-150 ul sekundären Antikörper-Lösung auf die Folien hinzufügen. Legen Sie die Folien in der nassen Kasten und versiegeln Sie den Deckel. Inkubieren der Objektträger für 1-2 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Folien in Färbeschalen gefüllt mit 1x TBS mit 0,05% Triton X-100, 3-mal, jeweils 15 min. Bei der letzten Wäsche, tauen die anti-fade Eindeckmediums in einem 50 ° C Wasserbad für 10 Minuten, wenn bei -20 ° C gelagert. Kühlen Sie den Eindeckmedium auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch.
- In etwa 20 & mgr; l (ein Tropfen) Eindeckmedium aufder Schieber und tragen Sie eine große Deckglas (mindestens 22 mm x 64 mm) über die Proben. Beobachten Sie unter Verwendung von fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop innerhalb von 6 Stunden nach der Montage.
- Wenn Bildgebung kann nicht am selben Tag erfolgen, versiegeln Dias Nagellack verwenden und legen Sie sie in den nassen Box bei 4 ° C über Nacht.
HINWEIS: Die anti-fade Eindeckmediums allmählich nach einigen Tagen oxidiert wird erhalten (und drehen bräunlich), so empfiehlt es sich, so schnell wie möglich die Bilder zu nehmen.
- Wenn Bildgebung kann nicht am selben Tag erfolgen, versiegeln Dias Nagellack verwenden und legen Sie sie in den nassen Box bei 4 ° C über Nacht.
Representative Results
Die repräsentativen Ergebnisse zeigen Querschnitte der Stufe 30 Xenopus - Embryonen auf verschiedenen Ebenen, nämlich die Vorderhirns, des Mittelhirns, Rautenhirns und des Rückenmarks, gefärbt mit verschiedenen Antikörpern (Abbildung 4). Wie bereits erwähnt, neuronale Vorläuferzellpopulation findet in der Nähe des Lumens des Neuralrohrs, während Myt1 markierte differenzierte primäre Neuronen nach außen wandern-SOX3 markiert und in der Nähe der Grenzschicht (Basallamina) des Neuralrohr lokalisieren. Anti-acetyl-Tubulin-Etiketten Axone in differenzierten Neuronen, die innerhalb des gesamten Neuralrohrs zu beobachten ist.
Side-spezifischen Knock-Down oder Überexpression ist ein breit verwendetes Verfahren in der Neurobiologie zu bewerten, ob die Expression des bestimmten Gens modulieren (e) das Wachstum und die Differenzierung von neuronalen Zellen stört. In solchen Fällen entweder Morpholinos (MOs) oder DNA-Konstrukt (e) tragenden pro Moter-driven - Gen (s) in einer der 23 in Zweizellstadium zwei Blastomeren injiziert. Alternativ können sie in die Hirnventrikel durch Elektroporation gefolgt injiziert werden, die in Zuschlags oder Überexpression des gewünschten Gens (s) 27 führt. In beiden Fällen werden die Effekte auf eine Seite des Embryos beschränkt, die gegenüberliegende Seite des Embryos als unbehandelte interne Kontrolle zu machen.
Nach der Fixierung sectioning und Immunfärbung werden die Auswirkungen des Knock-Down / Überexpression durch Zählen und Vergleichen der Zellzahlen von verschiedenen Populationen an beiden Seiten des Embryos quantifiziert. Durch Akkumulieren diese Daten aus verschiedenen Embryonen können statistische Analyse durchgeführt werden. In unserer repräsentativen Ergebnissen wurde keine Störung in den Embryonen hergestellt. Beispiele für Gen Perturbation und deren Auswirkungen auf verschiedenen neuronalen Zellpopulationen in den Referenzen 20,23 gefunden werden.
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Abb . 1: Embryo Anordnung und Ausrichtung im Abschnitt Form (A) Eine Karikatur Darstellung der Montageanordnung zeigt, beachten Sie die Schale mit dem Datum, Zeitpunkt und die Orientierung von Embryonen markiert wurde. (B) Ein Bild , das natürliche Aussehen der Montageanordnung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 2: Die Orientierung und Position des Gelatineblock auf der Probenhaltescheibe (A) Eine Darstellung Cartoon Abschnitt Blockanordnung zeigt, beachten Sie, dass Embryonen in einem "Heads - up" Position sind und die Gelatineblock o fest fixiert istnin der Probenhaltescheibe durch das Gewebe-Gefriermedium an der Basis (siehe 2B). (B) Ein Bild , das natürliche Aussehen des Abschnitts Blockanordnung zeigt, notieren Sie die Ansammlung des Gewebes-Gefriermedium zwischen dem Gelatineblock und der Probenhaltescheibe. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Kontinuierliche Schnitte (A) Modell eines Abschnitts Kammer. Die Probenhaltescheibe sollte in die Position gedreht und fixiert werden, dass der Embryo Seite nach oben zeigt. Nach ein paar (6-10) Abschnitte sind die langen Streifen kontinuierlichen Abschnitt Fliesen vorsichtig von der Klinge (blau) getrennt, um einen feinen Pinsel und drehte sich dann um 90 ° an der Halteplatte. Dann wird eine Raumtemperatur-positiv geladene Objektträger istfest auf die Profilleiste nach unten gedrückt und sofort gesammelt fertige Streifen angehoben. (B) Normalerweise kann jeder Schlitten zwei parallele Linien von Streifen aufnehmen, wie dargestellt. Denken Sie daran, detaillierte Aufzeichnung auf der Folie Etikett mit Bleistift machen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Querschnitt der Stufe 30 X. laevis Kaulquappen und Färbung im Nervengewebe, 20X. (A) Schema der relativen Positionen angibt (Vorderhirns, des Mittelhirns, Rautenhirns und Rückenmark) von Schnittebenen auf Xenopus Kaulquappen. (B) entsprechende Querschnitte gefärbt mit Anti-SOX3 (Rot), anti-acetylierten-Tubulin (grünn) und DAPI (blau), um die relativen Positionen der neuralen Stammzellpools sowie neurofilaments im Neuralrohr zeigt. (C) entsprechende Querschnitte mit anti-Myt1 (rot) und DAPI (blau), um die relativen Positionen der differenzierten primären Neuronen im Neuralrohr zeigt. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Hier haben wir für die Visualisierung primären Neurogenese in Xenopus - Embryonen eine bequeme und effiziente Methode zu demonstrieren. Dieses Verfahren erlaubt die Bewertung der verschiedenen Arten von neuronalen Zellen, einschließlich der neuronalen Stammzellen und differenzierten primären Neuronen unter Verwendung von zelltypspezifischen Markern.
Das Protokoll ist in der Regel robust mit sehr hoher Reproduzierbarkeit. Für Embryonen , die in vordefinierten Schraffur Stufen sind (dh bis 28 zu Stufe), empfehlen wir manuell die Vitellinmembran vor der Fixierung zu entfernen , da diese Embryonen erlaubt vor der Fixierung vollständig zu entrollen. Dies ist besonders wichtig, wenn die Embryonen in relativ frühen Stadien (vor dem Schlüpfen) Sammeln, da gebogenen Embryonen extrem schwierig in der gewünschten Orientierung innerhalb des Montagekammer anzuordnen. Wir haben keinen Verlust an Immunogenität nach MEMFA oder PFA Fixation somit zusätzliches Antigen Retrieval Schritt ist nicht notwendig für dieses Protokoll erfahren. Darüber hinaus ist dieseimmunostaining Verfahren kann in Proben werden von chromogenen / Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung durchgeführt. In einem solchen Szenario wird empfohlen, die Protease K Behandlungsschritt während der in situ-Hybridisierungsprotokoll zu überspringen. Nach chromogenen / fluoreszierendes Substrat Reaktion können Proben mit TBS gewaschen und in Fischgelatinelösung in ähnlicher Weise eingebettet MEMFA / PFA festen Proben. Probenfläschchen kann durch Umwickeln der Phiolen in Aluminiumfolie vor Licht geschützt werden, wenn Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung wird später zusammen mit Immunofluoreszenzfärbung abgebildet werden.
In einigen Fällen kann Embryonen schrumpfen übermäßig nach Gelatine Penetration. Dies wird höchstwahrscheinlich entweder durch unzureichende Fixierung oder unzureichende TBS-Triton Extraktion verursacht. Stellen Sie sicher, dass Embryonen für mindestens 2-3 Stunden oder vorzugsweise über Nacht bei 4 ° C in PFA / MEMFA wurden behoben. Wenn das Problem weiterhin besteht, erhöhen Sie die Waschzeit von TBS-Triton bis 3 für 1 Stunde.
Während Kryo-Sectioning, variieren unterschiedliche Eigenschaften aufweisen kann die Steifigkeit des Probenblocks als verschiedene Chargen von Fischgelatine. Dieses Problem kann teilweise durch Einstellen der Temperatur des Mikrotom kompensiert werden. Eine niedrigere Temperatur wird in einem "härteren" Probenblock führen jedoch unter übermäßiger niedriger Temperatur Abschnitt der Probenblock wird knackig und schwierig. Einige Feinabstimmung oder Praxis (unter Verwendung von Mock Probenblöcke ohne Embryonen) vor jeder Schnitte kann vor von Vorteil sein, zu verwenden, um auf besonders wertvollen Proben.
Ein häufig auftretendes Problem während des Schneidens ist die dünnen Abschnitte manchmal auf die dicke Glasplatte zu kleben neigen, anstatt bleiben flach auf dem Stahl Bühne. Dies kann insbesondere dann sein, zu stören, da sie ständig den kontinuierlichen Schneidens unterbricht. Solche Fälle sind in der Regel durch eine von zwei Ursachen haben: die Profilkammer und (vor allem) die dicke Glasplatte nicht kalt genug sein, oder übermäßige statische Ladung auf der Maschine und die operator, vor allem bei trockenem Wetter. Ersteres kann durch Umklappen der Temperatur des Abschnitts Kammer und dem Verlassen der Glasplatte innerhalb extra Zeit (möglicherweise über Nacht) gelöst werden; und die letztere durch den Kryostaten richtig geerdet. Verbinden der Metalloberfläche des Kryostaten mit einem Metallhahn oder eine ähnliche Wasserrohrsystem aus Metall kann eine alternative Möglichkeit, die statische Aufladung zu lösen. Nach jedem Gebrauch sollte die dicke Glasplatte gut mit nicht-korrosive Reinigungsmittel (wie zB Geschirrspülmittel), von Reinstwasser, besprüht mit reinem Ethanol und eingewickelt im Tuch Papier gespült gewaschen werden, um die Oberfläche und Kanten vor Beschädigung zu schützen.
Die Antikörper im Protokoll aufgelistet sind in der Regel spezifisch und wir begegnen selten unspezifische Adsorption oder hohen Hintergrundsignal. Es sollte beachtet werden, dass bei Verwendung von hitzeinaktiviertem Ziege / Lammserum als Blockierungsmittel, übermäßige Hitze-Inaktivierung (wie durch die Bildung von fluffy Fällmittel im Serum sichtbar) solltenwerden, da diese Fällmittel vermieden sind sekundäre Antikörper sehr attraktiv und kann an eine Quelle hohen Hintergrund bei.
Es ist möglich und manchmal erwünscht, Doppelfärbung durchzuführen verschiedenen Populationen neuronaler Zellen gleichzeitig zu visualisieren. Solche Doppelfärbung ist möglich und führt in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse mit den folgenden Kombinationen: SOX3 / N-Wanne oder Myt1 / N-Wanne. Jedoch Doppelfärbung von SOX3 und Myt1 wird durch die Tatsache erschwert, daß die beiden Antikörper sind sowohl aus Kaninchen Ursprungs. Wir haben mehrere Antikörper direkte Markierung Kits getestet, jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse wurden beobachtet (niedriges Signal-Rausch-Pegel), möglicherweise aufgrund des Fehlens von Signalverstärkung von sekundären Antikörpern. Ein möglicher Ansatz , um dieses Problem zu umgehen , wäre zu transgenen Linien in Xenopus erhöhen, wie weiter unten erläutert.
Eine der Hauptbeschränkungen dieses Protokolls besteht darin, dass, während dieses Protokoll könnte ausreichend distinguish zwei Pools von neuronalen Zellen, nämlich die SOX3-exprimierenden neuralen Stammzellpool und die Myt1 exprimierenden differenzierten Neuronen, es fehlt die Fähigkeit, unterschiedliche Subpopulationen von differenzierten Neuronen zu offenbaren. Solche Subpopulationen, die einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, primäre Motorneuronen, Inter und sensorischen Neuronen, werden in der Regel durch ihre differentiell exprimierten Markergene 28-30 charakterisiert. Wie oben erwähnt, in dem Spalt die jüngsten Fortschritte bei der Entwicklung von Multicolor - in situ - Hybridisierung kombiniert mit Antikörper-basierte Immundetektionsverfahren in Xenopus - Embryonen füllen kann 31 diese Subpopulationen von differenzierten Neuronen für mögliche Untersuchung zu offenbaren. Alternativ, wie in Mäuse - Modell gezeigt wurde, wäre es auch , eine umfassende Reihe von zelltypspezifischen Antikörper zu erzeugen gewünscht werden , um so unterschiedliche Zellpopulationen in Xenopus unterscheiden.
Es istauch erwähnenswert , dass als Ergänzung zu dieser Methode, die jüngsten Fortschritte in der optischen Bildgebung und Bildanalyse, wie Multiphotonen - Mikroskopie, 3D - Rekonstruktion und Segmentierung kann auch nach ersten Einschätzungen angewendet werden , zu erwähnen , umfassendere Beobachtungen von Xenopus - Oozyten zu erreichen sowie frühen Embryonen, insbesondere unter einer Live - Einstellung 32,33. Daher Proliferation, Differenzierung und Bewegung von neuronalen Zellen in lebenden Tieren zu verfolgen, würde es wünschenswert sein , eine oder mehrere transgene Linien zu schaffen, die von zelltypspezifischen Promotor angetrieben fluoreszierende Proteine beherbergen Live Beobachtung solcher Zellpopulationen in der frühen Xenopus zu ermöglichen Embryonen. Die Einrichtung eines X. laevis Linie mit β-Tubulin - Promotor neurospezifische tauGFP und ihre Anwendungen fahren haben ein schönes Beispiel 23,34 zur Verfügung gestellt. Mit den vollständigen Promotor - Sequenzen von sowohl SOX3 und Myt1 in Wirbeltiere gekennzeichnet 35-37, ist es shOuld relativ leicht zusätzliche transgenen Linien in Xenopus zu etablieren , die sowohl umfassend die Xenopus - Community und einer allgemeineren Bereich der primären Neurogenese Forschung beitragen soll.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Prof. Michael Klymkowsky an der Universität von Colorado in Boulder und Prof. Nancy Papalopulu in der Universität Manchester für die freundliche anti-SOX3 und anti-Myt1 Antikörper bietet, beziehungsweise. Wir danken den Mitgliedern des Papalopulu Labor für ihre interessante Vorschläge in diesem Protokoll zu entwickeln. Diese Arbeit wurde von zwei Healing Foundation studentships zu SZ und JL unterstützt, zwei Projektförderung von der Healing Foundation SZ / EA und JL / EA jeweils ein Programm Zuschuss aus dem Wellcome Trust zu EA (WT082450MA) und eine institutionelle strategische Unterstützung Zuschuss aus dem Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
| Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
| Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
| Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Gloves | |||
| Dry Ice | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 85-90 °C Heat block | |||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Acetone, analytical grade | |||
| Staining jar with slide racks | |||
| Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
| anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
| Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
| Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |
References
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