Questo articolo presenta un metodo conveniente e rapido per la visualizzazione di diverse popolazioni cellulari neuronali nel sistema nervoso centrale di embrioni di Xenopus mediante immunofluorescenza su sezioni.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
Nei vertebrati, lo sviluppo del sistema nervoso centrale comprendente più fasi distinte ancora consecutivi. Il primo passo è l'induzione neurale, quando le cellule ectodermiche naive sono specificati verso un destino neurale, piuttosto che un destino epidermica. Diversi meccanismi di regolazione interconnessi sono coinvolti in questa fase in altri sistemi modello 1,2 Xenopus e. Questo processo è coordinato principalmente da fattori secreti prodotti dal mesoderma sottostante, come chordin, zucca, e follistatin 3-7. Dopo l'induzione neurale, un sottoinsieme di progenitori neurali uscire dal ciclo cellulare e cominciare a differenziare in un processo denominato neurogenesi come primario. Non tutti i precursori neuronali differenziano in questo momento. Le cellule precursori neurali restanti continuano a proliferare, mantenendo così il pool di cellule staminali necessarie per la continua crescita del sistema nervoso centrale durante tutto lo sviluppo e nell'età adulta.
questi proliferating cellule precursori neurali si caratterizzano per la loro espressione del SRY (regione sesso determinare Y) -box 3 (SOX3) gene 8-11. L'altra popolazione di cellule, che uscita il ciclo cellulare e impegnarsi per un destino differenziata, sono identificati con l'espressione del marker gene differenziazione, tubulina, beta 2B classe IIb (tubb2b, N-vasca) e mielina fattore di trascrizione 1 (myt1) 12-14. Tali cellule neuronali differenziate alla fine danno origine a diverse categorie di neuroni compresi, ma non limitati a, motore, internazionale, e neuroni sensoriali posizionati in aree distinte all'interno del tubo neurale 15-17.
Mentre gli sforzi significativi sono stati dedicati a scoprire i meccanismi regolatori che governano il patterning e il destino determinare gli eventi nel neuroectoderma anteriore, meno attenzione è stata effettuata sulla indagare gli eventi neurogene che si verificano in seguito allafase patterning iniziale. Infatti, trasduzione del segnale, regolamenti trascrizionali, nonché modificazioni post-traduzionali sono tutti coinvolti in questa fase successiva, controllando sia specifica sincronizzazione e lineage durante neurogenesi 18-20. Ulteriori indagini su questi meccanismi richiedono un metodo affidabile per visualizzare e distinguere le diverse popolazioni di cellule neuronali facilmente. La suddetta marcatori neurali, tra cui, SOX3, Myt1, e N-vasca, in grado di fornire un mezzo per identificare queste diverse popolazioni cellulari, fornendo così le basi necessarie per rivelare i meccanismi alla base del differenziamento neuronale 21-23.
Anche se l'etichettatura differenziale di popolazioni di cellule neuronali sono state dimostrate in altri organismi modello, relativamente pochi studi hanno sfruttato il sistema Xenopus al massimo in questo senso. Ciò è dovuto principalmente ad una scarsità di anticorpi compatibili che identificano in modo affidabile i vari neurpopolazioni di cellule onal del tubo neurale. Qui, si descrive un metodo per la visualizzazione di differenziazione neuronale nei primi embrioni di Xenopus mediante immunostaining, che fornisce un approccio robusto e conveniente per lo studio neurogenesi primaria in Xenopus. Questo protocollo dovrebbe fornire indicazioni sufficienti per i ricercatori interessati allo sviluppo precoce del sistema nervoso centrale Xenopus tra la fase 26 e la fase 45.
Qui mostriamo un metodo conveniente ed efficiente per la visualizzazione neurogenesi primaria in embrioni di Xenopus. Questo metodo permette la valutazione di diversi tipi di cellule neurali, comprese le cellule staminali neuronali e neuroni primari differenziati utilizzando marcatori specifici del tipo di cellula.
Il protocollo è generalmente robusto molto elevata riproducibilità. Per gli embrioni che si trovano nelle fasi di pre-cova (vale a dire fino alla fase 28), si consiglia di rimuovere manualmente la membrana vitellina prima della fissazione in quanto ciò consente di embrioni uncurl completamente prima di fissazione. Ciò è particolarmente importante quando la raccolta embrioni relativamente fasi (prima della schiusa), poiché embrioni piegate sono estremamente difficile organizzare l'orientamento desiderato all'interno della camera di montaggio. Non abbiamo subito una perdita di immunogenicità dopo MEMFA o PFA fissazione quindi ulteriore passo antigene recupero non è necessario per questo protocollo. Inoltre, questoProcedura immunocolorazione può essere effettuata in campioni da cromogenica / ibridazione in situ fluorescente. In tale scenario, si consiglia di saltare la fase di trattamento K proteasi durante il protocollo in situ ibridazione. Dopo la reazione substrato cromogenico / fluorescenti, i campioni possono essere lavati con TBS e incorporati in soluzione gelatina di pesce in modo simile a campioni fissati MEMFA / PFA. Fiale del campione possono essere protetti dalla luce avvolgendo le fiale in un foglio di alluminio, se ibridazione in situ fluorescente sarà ripreso insieme a immunofluorescenza colorazione più tardi.
In alcuni casi, gli embrioni possono restringersi eccessivamente dopo la penetrazione gelatina. Questo è molto probabilmente causato da una fissazione insufficiente o insufficiente estrazione TBS-Triton. Assicurarsi che gli embrioni sono stati fissati in PFA / MEMFA per almeno 2-3 ore o preferibilmente durante la notte a 4 ° C. Se il problema persiste, aumentare il tempo di lavaggio di TBS-Triton a 3 per 1 ora.
Durante crio-sectioNing, la rigidità del blocco campione può variare in diversi lotti di gelatina di pesce hanno proprietà diverse. Questo problema può essere parzialmente compensato regolando la temperatura del microtomo. Una temperatura più bassa si tradurrà in un blocco "più duro" campione comunque sotto eccessiva bassa temperatura blocco campione diventa croccante e difficile sezione. Alcuni perfezionamenti o pratica (utilizzando i blocchi di esempio finte senza embrioni) prima di ogni sezionamento può essere utile prima di usare su campioni di particolare pregio.
Un problema comunemente incontrati durante sezionamento è sezioni sottili a volte tendono ad attaccarsi sulla lastra di vetro spessa piuttosto che rimanere piatta sul palco in acciaio. Questo può essere particolarmente interrompendo quanto interrompe costantemente il procedimento di taglio continuo. Tali casi sono di solito causati da uno dei due motivi: la camera di sezione e (soprattutto) la lastra di vetro di spessore non essere carica statica abbastanza freddo, o eccessivo sulla macchina e l'operator, soprattutto nella stagione secca. Il primo può essere risolto abbassando la temperatura della camera di sezione e lasciando la lastra di vetro entro i tempi supplementari (possibilmente durante la notte); e il secondo di terra quanto criostato. Collegamento la superficie metallica del criostato ad un rubinetto metallico o simile sistema di tubi di acqua fatta di metallo può essere un modo alternativo per liberare le cariche statiche. Dopo ogni utilizzo, la lastra di vetro di spessore deve essere lavato bene con un detergente non corrosivo (ad esempio detersivo), risciacquato con acqua ultrapura, spruzzato con etanolo puro, e avvolto in carta asciugamano per proteggere la superficie ei bordi dal danno.
Gli anticorpi elencati nel protocollo sono generalmente specifici e raramente incontrano adsorbimento non specifico o ad alto segnale di fondo. Va notato che, se si utilizza inattivato al calore siero di capra / agnello come agente bloccante, eccessivo calore inattivazione (come visualizzato dalla formazione di precipitante soffice nel siero) dovrebbeessere evitata poiché questo precipitante è molto interessante per anticorpi secondari e può contribuire ad una sorgente di alta sfondo.
È possibile, e talvolta desiderato, effettuare doppia colorazione per visualizzare differenti popolazioni di cellule neuronali simultaneamente. Tale doppia colorazione è possibile e in genere dà risultati soddisfacenti con le seguenti combinazioni: SOX3 / N-vasca o Myt1 / N-vasca. Tuttavia, doppia colorazione di SOX3 e Myt1 è complicata dal fatto che i due anticorpi sono entrambi di origine di coniglio. Abbiamo testato diversi kit di etichettatura diretti anticorpi, tuttavia sono stati osservati risultati soddisfacenti (basso livello di segnale-rumore), probabilmente a causa della mancanza di amplificazione del segnale da anticorpi secondari. Un possibile approccio per aggirare questo problema potrebbe essere quella di aumentare le linee transgeniche in Xenopus, come discusso di seguito.
Una delle principali limitazioni di questo protocollo è che, mentre questo protocollo potrebbe sufficientemente distinguish due piscine principali di cellule neuronali, vale a dire, il pool di cellule staminali neurali SOX3-esprimere e le Myt1-esprimono i neuroni differenziati, manca la capacità di rivelare diversi sotto-popolazioni di neuroni differenziati. Tali sub-popolazioni, che compreso, ma non sono limitati a, i neuroni motori primari, interneuroni e neuroni sensoriali, sono generalmente caratterizzati da loro differenzialmente espressi geni marcatori 28-30. Come accennato in precedenza, i recenti progressi nello sviluppo di multicolore in ibridazione in situ in combinazione con il metodo di rilevazione immunofluorescenza a base di anticorpi in embrioni di Xenopus possono colmare la lacuna per rivelare questi sotto-popolazioni di neuroni differenziati per il potenziale di indagine 31. In alternativa, come è stato dimostrato nei topi modello, sarebbe anche desiderabile per raccogliere un insieme più completo di anticorpi specifici per tipo di cellule per distinguere tali popolazioni cellulari diversi in Xenopus.
Èanche ricordare che, in aggiunta a questo metodo, i recenti progressi nella imaging ottico e analisi di immagine, quali la microscopia multiphoton, ricostruzione 3D, e segmentazione, possono essere applicati anche dopo valutazioni iniziali per ottenere osservazioni più complete di oociti di Xenopus e embrioni precoci, in particolare nell'ambito di una impostazione 32,33 dal vivo. Pertanto, per monitorare la proliferazione, la differenziazione, e il movimento delle cellule neuronali negli animali vivi, sarebbe desiderabile per stabilire una o più linee transgeniche che ospitano proteine fluorescenti guidati da specifici tipo di cellula promotore per consentire l'osservazione diretta di tali popolazioni cellulari nei primi mesi del Xenopus embrioni. La creazione di una X. Linea laevis con specifiche neuro promotore β-tubulina di guida tauGFP e le sue applicazioni hanno fornito un bell'esempio 23,34. Con le sequenze promotore pieni di entrambi SOX3 e myt1 caratterizzato nei vertebrati 35-37, è should essere relativamente facile stabilire linee transgeniche aggiuntivi in Xenopus che dovrebbero contribuire ampiamente sia alla comunità di Xenopus e un campo più generale della ricerca neurogenesi primario.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Prof. Michael Klymkowsky presso l'Università del Colorado a Boulder e il Prof. Nancy Papalopulu presso l'Università di Manchester per la fornitura gentilmente anti-SOX3 e anti-Myt1 anticorpi, rispettivamente. Ringraziamo i membri del laboratorio Papalopulu per i loro suggerimenti penetranti nello sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato da due Healing Foundation Borse di studio per SZ e JL, due borse di studio che la fondazione di guarigione a SZ / EA e JL / EA, rispettivamente, un programma di sovvenzioni dal Wellcome Trust a EA (WT082450MA), e una sovvenzione istituzionale supporto strategico dal Wellcome trust [097.820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |