Denne artikkelen presenterer en praktisk og rask metode for å visualisere ulike nervecellepopulasjoner i det sentrale nervesystemet av Xenopus embryo ved hjelp av immunfluorescens flekker på deler.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
I vertebrater, utvikling av sentralnervesystemet omfatter flere distinkte, men etterfølgende etapper. Det første trinnet er nevrale induksjon, når naive ectodermal celler er spesifisert mot en neural skjebne heller enn en epidermal skjebne. Flere sammenhengende reguleringsmekanismer som er involvert i denne fasen i Xenopus og andre modellsystemer 1,2. Denne fremgangsmåte er i hovedsak koordineres av utskilte faktorer produsert av den underliggende mesoderm, slik som chordin, noggin og follistatin 3-7. Etter nevrale induksjon, en undergruppe av nevrale stamceller ut av cellesyklus og begynner å differensiere i en prosess referert til som primær nevrogenesen. Ikke alle nevrale forløpere skille på dette tidspunktet. De resterende nevrale forløper celler fortsette å spre seg, og dermed opprettholde stamcelle bassenget nødvendig for fortsatt vekst i sentralnervesystemet gjennom utvikling og inn i voksenlivet.
disse proliferating nevrale forløper celler er preget av deres uttrykk for SRY (sex bestemme region Y) -boks 3 (sox3) genet 8-11. Den andre populasjon av celler, som exit cellesyklus og forplikte seg til en differensiert skjebne, er identifisert av uttrykket av differensiering genmarkører, tubulin, beta 2B klasse IIb (tubb2b, N-tub) og myelin transkripsjonsfaktor 1 (myt1) 12-14. Slike differensierte neuronale celler til slutt gir opphav til forskjellige kategorier av nerveceller, inkludert, men ikke begrenset til, motor, inter- og sensoriske nevroner plassert i forskjellige områder i det neurale rør 15-17.
Mens en betydelig innsats har vært viet til å avdekke de reguleringsmekanismer som styrer mønster og skjebnen bestemme hendelser i fremre neuroectoderm har mindre oppmerksomhet blitt gjort på å undersøke nevrogene hendelser som oppstår etterinnledende mønster scenen. Faktisk, signaltransduksjon, transkripsjons forskrifter, samt posttranslasjonelle modifikasjoner er alle involvert i dette senere stadium, kontrollere både timing og avstamning spesifikasjon under nevrogenese 18-20. Videre undersøkelser i disse mekanismene krever en pålitelig metode for enkelt å visualisere og skille mellom forskjellige populasjoner av nerveceller. Ovennevnte nevrale markører, inkludert, Sox3, Myt1, og N-kar, kan være et middel for å identifisere disse forskjellige cellepopulasjoner, og dermed gi de nødvendige grunnlaget for å avsløre de underliggende mekanismene for neuronal differensiering 21-23.
Selv differensial merking av nervecellepopulasjoner er påvist i andre modellorganismer, har relativt få studier utnyttet Xenopus systemet til fulle i denne forbindelse. Dette skyldes i hovedsak en mangelen på kompatible antistoffer som pålitelig identifisere de ulike Neueronal cellepopulasjoner i nevralrøret. Her beskriver vi en fremgangsmåte for visualisering av neuronal differensiering i tidlige embryoer Xenopus via farging, noe som gir en robust og enkel metode for å undersøke grunn nevrogenesen i Xenopus. Denne protokollen skal gi tilstrekkelig veiledning for forskere som er interessert i den tidlige utviklingen av Xenopus sentralnervesystemet mellom scene 26 og scene 45.
Her viser vi en enkel og effektiv metode for å visualisere primær nevrogenese i Xenopus embryoer. Denne fremgangsmåte tillater vurdering av forskjellige typer av nerveceller, inkludert nevrale stamceller og differensierte primære neuroner bruk av celletypespesifikke markører.
Protokollen er vanligvis robuste med meget høy grad av reproduserbarhet. For embryoer som er i pre-klekking stadier (dvs. opp til scenen 28), anbefaler vi å manuelt fjerne vitelline membranen før fiksering, da dette gjør at embryoene fullt uncurl før fiksering. Dette er spesielt viktig ved innsamling embryoer ved relativt tidlige stadier (før klekking), siden bøyde embryoer er ekstremt vanskelig å anordne på ønsket orientering inne i monteringskammeret. Vi har ikke opplevd et tap av immunogenisitet etter MEMFA eller PFA fiksering dermed ytterligere antigen henting trinnet er ikke nødvendig for denne protokollen. I tillegg har dennefarging fremgangsmåte kan utføres i prøver fra kromogene / fluorescerende in situ hybridisering. I et slikt scenario, anbefales det å hoppe over protease K behandlingstrinn i løpet av in situ hybridisering protokollen. Etter kromogent / fluorescerende substrat reaksjon, kan prøvene vasket med TBS og innleiret i fiskegelatinoppløsning på en lignende måte til MEMFA / PFA faste prøver. Prøverør kan beskyttes mot lys ved å vikle hetteglassene i aluminiumsfolie hvis fluorescerende in situ hybridisering blir avbildet sammen med immunfluorescerende farging senere.
I noen tilfeller kan embryoer krympe overdrevet etter gelatin penetrasjon. Dette er mest sannsynlig forårsaket av enten utilstrekkelig fiksering eller utilstrekkelig TBS-Triton utvinning. Sørg for at embryoer har blitt fikset i PFA / MEMFA i minst 2-3 timer eller helst over natten ved 4 ° C. Hvis problemet vedvarer, øker vasketiden av TBS-Triton til 3 for en time.
I løpet av cryo-sectioning, kan stivheten av prøveblokken variere som forskjellige satser av fiskegelatin har forskjellige egenskaper. Dette problem kan delvis kompenseres ved å justere temperaturen på mikrotomen. En lavere temperatur vil resultere i en "hardere" prøveblokk i henhold imidlertid overdreven lav temperatur prøveblokken blir sprø og vanskelig å seksjon. Litt finjustering eller praksis (ved hjelp av mock sample blokker uten embryoer) før hver seksjonering kan være gunstig før bruk på særlig verdifulle prøver.
En vanlig forekommende problem under seksjonering er de tynne deler noen ganger har en tendens til å holde seg på den tykke glassplate i stedet for å holde seg flatt på stål scenen. Dette kan være spesielt forstyrre siden det stadig avbryter kontinuerlig snitteprosessen. Slike saker er vanligvis forårsaket av en av to grunner: den delen kammeret og (spesielt) den tykke glassplate ikke blir kaldt nok, eller overdreven statisk belastning på maskinen og den operator, spesielt i tørt vær. Førstnevnte kan løses ved å skru ned temperaturen i seksjonen kammeret og forlater glassplaten innen for ekstra tid (eventuelt natten over); og sistnevnte ved riktig jording kryostaten. Koble til metalloverflaten på kryostaten til en metall springen eller lignende Badering system laget av metall kan være en alternativ måte å slippe statisk elektrisitet. Etter hver bruk må tykk glassplate vaskes godt med ikke-korroderende detergent (for eksempel oppvaskmiddel), skyllet med ultrarent vann, sprøytet med ren etanol, og innpakket i papir håndkle for å beskytte overflaten og kantene fra skade.
Antistoffene som er oppført i protokollen er generelt spesifikke og vi sjelden støter på ikke-spesifikk adsorpsjon eller høyt bakgrunnssignal. Det skal bemerkes at, hvis ved hjelp av varme-inaktivert geit / lam serum som blokkeringsmiddel, for sterk varme-inaktivering (som visualisert ved dannelsen av fluffy fellingsmiddel i serum) børunngås da dette utfellingsmiddel er svært attraktive for sekundære antistoffer, og kan bidra til en kilde for høy bakgrunn.
Det er mulig, og noen ganger ønskelig, for å utføre dobbelt-farging for å visualisere forskjellige populasjoner av nevronale celler samtidig. En slik dobbel-farging er mulig og generelt gir tilfredsstillende resultater med følgende kombinasjoner: Sox3 / N-badekar eller Myt1 / N-badekar. Imidlertid er dobbelt-farging av Sox3 og Myt1 komplisert ved det faktum at de to antistoffer er både fra kanin-opprinnelse. Vi har testet flere antistoff direkte merkingssett, men ingen tilfredsstillende resultater ble observert (lavt signal-til-støy-nivå), muligens på grunn av mangel på signal forsterkning fra sekundære antistoffer. En mulig metode for å omgå dette problemet ville være å øke transgene linjer i Xenopus, som diskutert nedenfor.
En av de viktigste begrensningene i denne protokollen er at mens denne protokollen kunne nok distinguish to viktigste bassenger av nerveceller, nemlig Sox3-uttrykke nevrale stamceller bassenget og Myt1-uttrykker differensierte nevroner, mangler det evnen til å avdekke ulike sub-populasjoner av differensierte nevroner. Slike underpopulasjoner, som inkluderer, men er ikke begrenset til, primære motoriske nevroner, interneuroner og sensoriske neuroner, er vanligvis kjennetegnet ved deres differensielt uttrykte-markørgener 28-30. Som nevnt ovenfor, kan nylige fremskritt i utviklingen av flerfarget in situ hybridisering kombinert med antistoff-baserte immunfluorescens deteksjonsmetoden i Xenopus embryoer fylle gapet for å avsløre disse sub-populasjoner av neuroner differensiert for potensiell undersøkelse 31. Alternativt, som har blitt vist i mus modell, ville det også være ønskelig å skaffe et mer omfattende sett av celletypespesifikke antistoffer for å skille slike forskjellige cellepopulasjoner i Xenopus.
Det erogså verdt å nevne at, som et tillegg til denne metoden, nylige fremskritt i optisk bildebehandling og bildeanalyse, for eksempel multiphoton mikroskopi, 3D rekonstruksjon, og segmentering, kan også påføres etter innledende vurdering for å oppnå mer helhetlige observasjoner av Xenopus oocytter samt tidlige embryoer, særlig i henhold til en live-setting 32,33. Derfor, for å spore proliferasjon, differensiering, og bevegelse av neuronale celler i levende dyr, ville det være ønskelig å etablere en eller flere transgene linjer som havn fluorescerende proteiner som drives av celletype-spesifikk promoter for å tillate direkte observasjon av slike cellepopulasjoner i begynnelsen av Xenopus embryoer. Etableringen av en X. laevis tråd med neuro-spesifikke β-tubulin promoter kjøring tauGFP og dets programmer har gitt et fint eksempel 23,34. Med de fullstendige promotorsekvensene av både sox3 og myt1 karakterisert ved virveldyr 35-37, er det should være forholdsvis enkelt å etablere ytterligere transgene linjer i Xenopus som skal bidra i stor grad til både Xenopus fellesskap og en mer generell felt av primær nevrogenesen forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Michael Klymkowsky i University of Colorado i Boulder og professor Nancy Papalopulu ved universitetet i Manchester for vennlig å gi anti-Sox3 og anti-Myt1 antistoffer, henholdsvis. Vi takker medlemmene av Papalopulu lab for sine innsiktsfulle forslag for å utvikle denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av to Healing Foundation Stipend til SZ og JL, to prosjekttilskudd fra Healing Foundation til SZ / EA og JL / EA henholdsvis ett program stipend fra Wellcome Trust til EA (WT082450MA), og en institusjonell strategisk støtte stipend fra Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |