Este artigo apresenta um método conveniente e rápido para a visualização de diferentes populações de células neuronais no sistema nervoso central de embriões de Xenopus, utilizando coloração de imunofluorescência em secções.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
Em vertebrados, o desenvolvimento do sistema nervoso central compreende várias fases distintas ainda consecutivos. O primeiro passo é a indução neural, quando as células ectodérmicas naive são especificados para um destino neuronal, em vez de um destino epidérmica. Vários mecanismos reguladores interligados estão envolvidos nesta fase em outros sistemas modelo 1,2 Xenopus e. Este processo é coordenado principalmente por factores segregados produzidos pela mesoderme subjacente, tais como chordin, noggin, e folistatina 3-7. Após a indução neural, um subconjunto de células progenitoras neurais sair do ciclo celular e começam a diferenciar num processo referido como neurogénese primária. Nem todos os precursores neuronais diferenciar neste momento. As células precursoras neurais restantes continuam a proliferar, mantendo assim o conjunto de células estaminais necessária para o crescimento continuado do sistema nervoso central durante o desenvolvimento e na vida adulta.
estes proliferating células precursoras neurais são caracterizados pela sua expressão do gene 8-11 SRY (sex região determinante Y) -box 3 (SOX3). A outra população de células, que a saída do ciclo celular e comprometer-se a um destino diferenciado, são identificados pela expressão do genes marcadores de diferenciação, tubulina, beta 2B classe IIb (tubb2b, N-banheira) e fator de transcrição mielina 1 (myt1) 12-14. Tais células neuronais diferenciadas, eventualmente, dar origem a diferentes tipos de neurónios, incluindo, mas não limitado a, o motor, inter, e neurónios sensoriais posicionado em zonas distintas no interior do tubo neural 15-17.
Enquanto esforços significativos foram dedicada a descobrir os mecanismos reguladores que regem a padronização eo destino determinação eventos na neuroectoderma anterior, menos atenção tem sido feito em investigar os eventos neurogênicas que ocorrem após afase de padronização inicial. Com efeito, a transdução de sinal, os regulamentos da transcrição, assim como as modificações pós-traducionais são todos envolvidos nesta fase posterior, controlando tanto a especificação de tempo e linhagem durante neurogénese 18-20. Outras investigações sobre estes mecanismos requerem um método fiável para visualizar e distinguir as diferentes populações de células neuronais facilmente. A N-banheira acima mencionados marcadores neurais, incluindo, SOX3, Myt1, e, pode proporcionar um meio para identificar estas populações de células diferentes, proporcionando assim as bases necessárias para revelar os mecanismos subjacentes da diferenciação neuronal 21-23.
Embora a rotulagem diferencial de populações de células neuronais tem sido demonstrado em outros organismos modelo, relativamente poucos estudos têm explorado o sistema Xenopus para o seu máximo a este respeito. Isto é principalmente devido a uma escassez de anticorpos compatíveis que confiantemente identificar os vários neuronal populações de células no tubo neural. Aqui, descrevemos um método para visualizar a diferenciação neuronal em embriões precoces de Xenopus via imunocoloração, que fornece uma abordagem robusta e conveniente para investigar a neurogênese primária em Xenopus. Este protocolo deve dar orientação suficiente para os pesquisadores interessados no desenvolvimento inicial do sistema nervoso central Xenopus entre etapa 26 e etapa 45.
Aqui demonstramos um método conveniente e eficiente para a visualização neurogénese primária em embriões de Xenopus. Este método permite a avaliação de diferentes tipos de células neurais, incluindo células estaminais neuronais e neurónios primárias diferenciadas utilizando marcadores específicos do tipo de célula.
O protocolo geral é robusto com muito elevado nível de reprodutibilidade. Para os embriões que estão em fases pré-incubação (ou seja, até à fase 28), recomendamos remover manualmente a membrana vitelina antes da fixação, pois isso permite que embriões para desenrolar completamente antes de fixação. Isto é especialmente importante quando a recolha de embriões em fases relativamente iniciais (antes da eclosão), uma vez que embriões dobrados são extremamente difíceis de arranjar na orientação desejada no interior da câmara de montagem. Nós ainda não experimentou uma perda de imunogenicidade após MEMFA ou PFA fixação passo recuperação antigênica, portanto, adicional não é necessário para este protocolo. Além disso, esteimunocoloração procedimento pode ser realizado em amostras de cromogénico / hibridação in situ fluorescente. Em tal situação, é recomendado para ignorar a protease K durante o passo de tratamento in situ protocolo de hibridização. Após a reacção do substrato cromogénico / fluorescente, as amostras podem ser lavadas com TBS e embebidos em solução de gelatina de peixe de uma maneira semelhante à amostras fixadas MEMFA / PFA. frascos de amostra pode ser protegida da luz enrolando os frascos em folha de alumínio se hibridação in situ fluorescente vai ser trabalhada em conjunto com a coloração imunofluorescente mais tarde.
Em alguns casos, os embriões podem diminuir excessivamente após a penetração de gelatina. Isto é provavelmente causado por uma fixação insuficiente ou insuficiente de extracção TBS-Triton. Certifique-se de que os embriões foram fixados em PFA / MEMFA para, pelo menos, 2-3 horas, ou de preferência durante a noite a 4 ° C. Se o problema persistir, aumentar o tempo de lavagem de Triton-TBS a 3 para 1 hr.
Durante crio-sectioNing, a rigidez do bloco de amostra pode variar como diferentes lotes de gelatina de peixe possuem propriedades diferentes. Este problema pode ser parcialmente compensada através do ajuste da temperatura do micrótomo. A temperatura mais baixa resultará em um bloco "mais difícil" amostra no entanto sob a temperatura excessiva baixo o bloco de amostra torna-se nítida e difícil de seção. Algum ajuste fino ou prática (usando blocos de amostras simuladas sem embriões) antes de cada corte pode ser benéfica antes do uso em amostras particularmente valiosos.
Um problema comum encontrado durante o corte é os cortes finos, por vezes, tendem a ficar sobre a placa de vidro grosso, em vez de ficar plana no palco de aço. Isto pode ser particularmente perturbadoras, uma vez que constantemente interromper o processo de corte contínuo. Tais casos são geralmente causadas por uma de duas razões: a câmara de secção e (especialmente) a placa de vidro grosso não sendo carga estática frio o suficiente, ou excessiva na máquina eo Sperator, especialmente em tempo seco. O primeiro pode ser resolvido, rodando abaixo da temperatura da câmara de secção e deixando a chapa de vidro para dentro de um tempo extra (possivelmente durante a noite); e este último por terra corretamente o criostato. Ligar a superfície metálica do criostato a uma torneira de metal ou de sistema de tubulação de água semelhante feita de metal pode ser uma maneira alternativa para liberar as cargas estáticas. Depois de cada utilização, a placa de vidro de espessura deve ser bem lavados com um detergente não-corrosivas (como o líquido de lavagem de loiça), lavado com água ultrapura, pulverizados com etanol puro, e embrulhada em papel toalha para proteger a superfície e os bordos da danificação.
Os anticorpos listados no protocolo são geralmente específica e nós raramente encontram adsorção não específica ou de alto sinal de fundo. Deve notar-se que, se utilizando soro de cabra / cordeiro inactivado pelo calor como agente bloqueador, de calor-inactivação excessiva (tal como visualizado pela formação de precipitante macio no soro) deveser evitada, pois esta precipitante é muito atractiva para os anticorpos secundários e pode contribuir para uma fonte de elevado ruído de fundo.
É possível, e por vezes necessário, para efectuar dupla coloração para visualizar diferentes populações de células neuronais em simultâneo. Essa dupla-coloração é possível e, geralmente, dá resultados satisfatórios com as seguintes combinações: SOX3 / N-banheira ou Myt1 / N-banheira. No entanto, a coloração de dupla-SOX3 e Myt1 é complicada pelo facto de que os dois anticorpos são tanto de origem de coelho. Testámos vários kits de marcação directa de anticorpos, no entanto, não há resultados satisfatórios foram observados (baixo nível de sinal-para-ruído), possivelmente devido à falta de amplificação de sinal a partir de anticorpos secundários. Uma abordagem possível para ultrapassar este problema seria o de aumentar linhas transgénicas em Xenopus, como discutido abaixo.
Uma das principais restrições deste protocolo é que, embora este protocolo poderá suficientemente distinguish dois conjuntos principais de células neuronais, ou seja, o conjunto de células estaminais neuronais que expressam SOX3 e os neurónios diferenciados Myt1-expressam, ele não tem a capacidade para revelar diferentes sub-populações de neurónios diferenciados. Tais sub-populações, que incluindo, mas não se limitam a, os neurónios motores principais, e interneurónios, neurónios sensoriais, são usualmente caracterizados pelos seus genes marcadores expressos diferencialmente-28-30. Como mencionado acima, os avanços recentes no desenvolvimento de multicolor hibridação in situ combinado com o método de detecção de imunofluorescência com anticorpos em embriões de Xenopus pode preencher a abertura para revelar estas sub-populações de neurónios diferenciados para a pesquisa do potencial 31. Alternativamente, como já foi demonstrado no modelo de ratos, seria também desejável para elevar um conjunto mais completo de anticorpos específicos do tipo de célula para distinguir tais populações de células diferentes em Xenopus.
Isto éTambém vale a pena mencionar que, como um complemento para este método, os recentes avanços na imagem óptica e análise de imagem, como a microscopia multiphoton, reconstrução 3D, e segmentação, pode também ser aplicado após as avaliações iniciais para alcançar observações mais abrangentes de oócitos de Xenopus, bem como embriões, em particular no âmbito de um ajuste 32,33 ao vivo. Portanto, para controlar a proliferação, diferenciação, e o movimento de células neuronais em animais vivos, que seria desejado por uma ou mais linhas transgénicas que abrigam proteínas fluorescentes conduzidos pelo promotor específico do tipo de célula para permitir a observação ao vivo de tais populações de células no início de Xenopus embriões. O estabelecimento de um X. linha laevis com o promotor β-tubulina neuro-específica condução tauGFP e suas aplicações têm proporcionado um bom exemplo 23,34. Com as sequências promotoras completas de ambos SOX3 e myt1 caracterizado por vertebrados 35-37, é SHould ser relativamente fácil estabelecer linhagens transgênicas adicionais em Xenopus que deverão contribuir extensivamente tanto para a comunidade Xenopus e um campo mais geral da pesquisa neurogênese primário.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Prof. Michael Klymkowsky na Universidade do Colorado em Boulder e Prof. Nancy Papalopulu na Universidade de Manchester para gentileza de anticorpos anti-SOX3 e anti-Myt1, respectivamente. Agradecemos aos membros do laboratório Papalopulu por suas sugestões perspicazes no desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi apoiado por dois fundação cura Studentships para SZ e JL, duas bolsas projecto da fundação cura para SZ / EA e JL / EA, respectivamente, a concessão de um programa a partir do Wellcome Trust para EA (WT082450MA), e um subsídio de Apoio Estratégico Institucional do Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |