Este artículo presenta un método conveniente y rápido para la visualización de diferentes poblaciones de células neuronales en el sistema nervioso central de embriones de Xenopus utilizando la tinción de inmunofluorescencia en secciones.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
En los vertebrados, el desarrollo del sistema nervioso central comprende varias etapas distintivas todavía consecutivos. El primer paso es la inducción neural, cuando se especifican células ectodérmicas ingenuos hacia un destino neuronal en lugar de un destino epidérmica. Varios mecanismos de regulación interconectados están involucrados en esta etapa en Xenopus y otros sistemas modelo 1,2. Este proceso está coordinado principalmente por factores secretados producidos por el mesodermo subyacente, como chordin, noggin, y folistatina 3-7. Después de la inducción neural, un subconjunto de progenitores neurales salir del ciclo celular y comienzan a diferenciarse en un proceso denominado neurogénesis como primaria. No todos los precursores neuronales se diferencian en este momento. Las células precursoras neurales restantes continúan proliferando, manteniendo de ese modo la piscina de células madre necesario para el crecimiento continuo de sistema nervioso central en todo el desarrollo y la edad adulta.
estos proliferating células precursoras neuronales se caracterizan por su expresión de la SRY (región determinante del sexo Y) -box 3 (sox3) gen 8-11. La otra población de células, que salen del ciclo celular y se comprometen a un destino diferenciado, se identifican por la expresión de los marcadores de genes de diferenciación, tubulina, beta 2B clase IIb (tubb2b, N-bañera) y la mielina factor de transcripción 1 (Myt1) 12-14. Tales células neuronales diferenciadas finalmente dan lugar a diferentes categorías de neuronas, incluyendo, pero no limitado a, motor, internacional, y las neuronas sensoriales situados en áreas distintas dentro del tubo neural 15-17.
Si bien los esfuerzos significativos se han dedicado a descubrir los mecanismos de regulación que rigen el patrón y el destino determinación de eventos en el neuroectodermo anterior, menos atención se ha hecho en la investigación de los eventos neurogénicos que se producen a raíz de laetapa inicial del patrón. De hecho, la transducción de señales, las regulaciones de la transcripción, así como las modificaciones post-traduccionales están involucrados en esta etapa posterior, controlar tanto la especificación sincronización y linaje durante la neurogénesis 18-20. Otras investigaciones sobre estos mecanismos requieren un método fiable para visualizar y distinguir las diferentes poblaciones de células neuronales fácilmente. La N-bañera mencionada marcadores neuronales, incluyendo, Sox3, Myt1, y, puede proporcionar un medio para la identificación de estas diferentes poblaciones celulares, proporcionando así las bases necesarias para revelar los mecanismos subyacentes de la diferenciación neuronal 21-23.
Aunque el etiquetado diferencial de poblaciones de células neuronales se ha demostrado en otros organismos modelo, relativamente pocos estudios han explotado el sistema de Xenopus al máximo en este sentido. Esto se debe principalmente a la escasez de anticuerpos compatibles que identificar de forma fiable los distintos neurpoblaciones de células onal en tubo neural. A continuación, describimos un método para la visualización de la diferenciación neuronal en los primeros embriones de Xenopus mediante inmunotinción, que proporciona un enfoque robusto y conveniente para la investigación de la neurogénesis primaria en Xenopus. Este protocolo deberá proporcionar una orientación suficiente para los investigadores interesados en el desarrollo temprano del sistema nervioso central Xenopus entre la etapa 26 y la etapa 45.
Aquí se demuestra un método conveniente y eficiente para la visualización de la neurogénesis primaria en embriones de Xenopus. Este método permite la evaluación de diferentes tipos de células neuronales, incluyendo las células madre neuronales y neuronas primarias diferenciadas utilizando marcadores específicos de tipo de células.
El protocolo es generalmente robusto con muy alto nivel de reproducibilidad. Para los embriones que se encuentran en etapas pre-eclosión (es decir, hasta el estadio 28), se recomienda eliminar manualmente la membrana vitelina antes de la fijación ya que esto permite que los embriones a estiren completamente antes de la fijación. Esto es especialmente importante en la recogida de embriones en las fases relativamente tempranas (antes de la eclosión), ya que los embriones dobladas son extremadamente difíciles de organizar en la orientación deseada dentro de la cámara de montaje. No hemos experimentado una pérdida de inmunogenicidad después MEMFA o PFA fijación de ahí paso adicional de recuperar el antígeno no es necesario para este protocolo. Además, esteprocedimiento de inmunotinción puede llevarse a cabo en muestras de cromógeno / hibridación fluorescente in situ. En tal escenario, se recomienda para omitir la etapa de tratamiento K proteasa durante el protocolo de hibridación in situ. Después de la reacción de sustrato cromogénico / fluorescente, las muestras se pueden lavar con TBS y se embebieron en solución de gelatina de pescado en una forma similar a las muestras fijadas MEMFA / PFA. Frascos de la muestra pueden ser protegidos de la luz envolviendo los viales en papel de aluminio si hibridación fluorescente in situ serán fotografiadas junto con la tinción de inmunofluorescencia después.
En algunos casos, los embriones pueden reducir excesivamente después de la penetración de gelatina. Esto es muy probablemente causado por cualquiera de una fijación insuficiente o insuficiente de extracción TBS-Triton. Asegúrese de que los embriones se han corregido en PFA / MEMFA durante al menos 2-3 horas o preferiblemente durante la noche a 4 ° C. Si el problema persiste, aumente el tiempo de lavado de TBS-Triton al 3 durante 1 hora.
Durante la crio-seccióNing, la rigidez de la muestra puede variar en diferentes lotes de gelatina de pescado tienen propiedades diferentes. Este problema puede ser parcialmente compensada mediante el ajuste de la temperatura del micrótomo. Una temperatura más baja dará lugar a un bloque "más duro" de la muestra sin embargo, bajo baja temperatura excesiva del bloque de muestras se vuelve quebradizo y difícil de sección. Algunos ajustes o práctica (utilizando bloques de muestras simuladas sin embriones) antes de cada seccionamiento pueden ser beneficiosos antes de su uso en muestras particularmente valiosos.
Un problema comúnmente encontrado durante el corte es las secciones delgadas a veces tienden a pegarse sobre la placa de vidrio grueso en lugar de permanecer plana en el escenario de acero. Esto puede ser particularmente interrumpir ya que constantemente interrumpe el proceso de corte continuo. Tales casos son causados generalmente por una de dos razones: la cámara de sección y (especialmente) la placa de vidrio grueso no ser carga estática lo suficientemente frío, o excesiva en la máquina y la juntaperator, sobre todo en tiempo seco. El primero puede ser resuelto por bajar la temperatura de la cámara de sección y dejando la placa de vidrio dentro de un tiempo extra (posiblemente durante la noche); y los segundos al conectar a tierra adecuadamente el criostato. Conexión de la superficie metálica del criostato a un grifo de metal o sistema de tubos de agua similar hecha de metal puede ser una forma alternativa para liberar los cargas estáticas. Después de cada uso, la placa de vidrio de espesor se debe lavar bien con detergente no corrosivo (por ejemplo, líquido para lavar platos), se enjuagó con agua ultrapura, rociado con etanol puro, y se envolvió en una toalla de papel para proteger la superficie y los bordes de perjudicial.
Los anticuerpos que figuran en el protocolo son generalmente específicos y que rara vez se encuentran con la adsorción inespecífica o alta señal de fondo. Cabe señalar que, si se utiliza suero de cabra / cordero inactivado por calor como agente de bloqueo, el exceso de calor de la inactivación (como se visualizó mediante la formación de precipitado esponjoso en el suero) debedebe evitarse ya que esto precipitante es muy atractivo para los anticuerpos secundarios y puede contribuir a una fuente de alto fondo.
Es posible, y a veces se desea, para realizar de doble tinción para visualizar diferentes poblaciones de células neuronales simultáneamente. Tal doble tinción es posible y por lo general da resultados satisfactorios con las siguientes combinaciones: Sox3 / N-bañera o Myt1 / N-bañera. Sin embargo, de doble tinción de Sox3 y Myt1 se complica por el hecho de que los dos anticuerpos son ambos de origen de conejo. Hemos probado varios kits de marcaje directo de anticuerpos, sin embargo, no se observaron resultados satisfactorios (bajo nivel de señal a ruido), posiblemente debido a la falta de amplificación de la señal de anticuerpos secundarios. Un posible enfoque para evitar este problema sería aumentar líneas transgénicas en Xenopus, como se discute a continuación.
Una de las principales limitaciones de este protocolo es que, mientras que este protocolo podría suficientemente distinguish dos piscinas principales de células neuronales, es decir, el grupo de células madre neurales que expresan Sox3 y los Myt1 que expresan las neuronas diferenciadas, que carece de la capacidad para revelar diferentes subpoblaciones de neuronas diferenciadas. Tales sub-poblaciones, que incluyen, pero no se limitan a, neuronas motoras primarias, interneuronas, y las neuronas sensoriales, por lo general se caracterizan por sus genes marcadores diferencialmente expresado 28-30. Como se mencionó anteriormente, los recientes avances en el desarrollo de multicolor de hibridación in situ combinado con el método de detección de inmunofluorescencia basado en anticuerpos en embriones de Xenopus pueden llenar el vacío para revelar estas subpoblaciones de neuronas diferenciadas para una posible investigación 31. Por otra parte, como se ha demostrado en el modelo de ratones, sería también ser deseable para criar a un conjunto más amplio de anticuerpos específicos del tipo de células para distinguir estos diferentes poblaciones de células en Xenopus.
EsTambién vale la pena mencionar que, como una adición a este método, los recientes avances en la imagen óptica y análisis de imagen, como la microscopía multifotónica, reconstrucción 3D, y la segmentación, también pueden aplicarse después de las evaluaciones iniciales para lograr observaciones más completas de los ovocitos de Xenopus, así como los embriones tempranos, en particular en virtud de un ajuste de 32,33 vivo. Por lo tanto, para realizar un seguimiento de la proliferación, diferenciación, y el movimiento de las células neuronales en los animales vivos, se desearía establecer una o más líneas transgénicas que albergan proteínas fluorescentes impulsados por promotor específico del tipo de células para permitir la observación en vivo de tales poblaciones de células a principios de Xenopus embriones. El establecimiento de una X. laevis línea con el promotor de β-tubulina-neuro específica conducción tauGFP y sus aplicaciones han proporcionado un buen ejemplo 23,34. Con las secuencias promotoras completos de ambos sox3 y Myt1 caracterizado vertebrados 35-37, es should ser relativamente fácil de establecer líneas transgénicas adicionales en Xenopus que deben contribuir ampliamente para tanto la comunidad de Xenopus y un campo más general de la investigación neurogénesis primaria.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Prof. Michael Klymkowsky en la Universidad de Colorado en Boulder y Prof. Nancy Papalopulu en la Universidad de Manchester para proporcionar la amabilidad de anticuerpos anti-Sox3 y anti-Myt1, respectivamente. Agradecemos a los miembros del laboratorio Papalopulu por sus sugerencias interesantes en el desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por dos Healing Foundation becas a SZ y JL, dos subvenciones para proyectos de la Fundación Healing a SZ / EA y JL / EA, respectivamente, subvención programa de una de la Wellcome Trust para EA (WT082450MA), y una subvención Institucional de Apoyo Estratégico de la Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |