Bu makalede, kesitleri üzerinde imüno-floresansı ile Xenopus embriyo, merkezi sinir sisteminde, farklı nöronal hücre popülasyonları görselleştirmek için uygun ve hızlı bir yöntem sunulur.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
omurgalılarda, merkezi sinir sisteminin gelişimi çok belirgin olmakla birlikte arka arkaya aşamalarını içerir. İlk adım naif ektodermal hücreler nöral kaderi yerine epidermal kader doğru belirtilen nöral indüksiyon vardır. Birkaç birbirine düzenleyici mekanizmalar Xenopus ve diğer model sistemlerde 1,2 bu aşamasında katılmaktadırlar. Bu süreç öncelikle böyle kordinin, noggine ve follistatin 3-7 gibi altta yatan mezoderm tarafından üretilen salgılanan faktörler tarafından koordine edilmektedir. Nöral indüksiyonundan sonra sinir progenitörlerin bir alt hücre döngüsü çıkıp primer nöron adlandırılan bir işlemde ayırt başlar. tüm nöronal öncüleri şu anda ayrım. Geri kalan sinir öncü hücreler, böylece gelişimi boyunca ve yetişkinlikte de merkezi sinir sisteminin sürekli büyüme için gerekli kök hücre havuz bakımı, çoğalmaya devam ediyor.
bu prNöral ön-madde hücreleri oliferating SRY (cinsiyet belirleyici bölge Y) box 3 (sox3) geni 8-11 bunların ekspresyonu ile karakterize edilir. Farklılaştırılmış kaderi taahhüt çıkış hücre döngüsü ve diğer hücre popülasyonu, farklılaşma gen belirteçleri, tubulin ifadesi, beta tarafından tanımlanan 2B sınıfı IIb (tubb2b, N-küvet) ve miyelin transkripsiyon faktör 1 (myt1) 12-14. Bu tür farklı nöronal hücreler sonunda dahil nöronların farklı kategorilerdeki sebebiyet verir, ama motor, bunlarla sınırlı olmamak üzere arası ve nöral tüp 15-17 içinde farklı yerlerde yerleştirilmiş duyu nöronları.
önemli çabalar ön nöroektoderm olayları belirleyen desenlendirme ve kader yöneten düzenleyici mekanizmaların ortaya çıkarılması için ayrılmış olsa da, daha az dikkat aşağıdaki meydana gelen nörojenik olayları araştıran üzerinde yapılmıştırİlk desenleme aşaması. Nitekim, sinyal iletimi, transkripsiyonel düzenlemeler yanı sıra post-translasyonel modifikasyonlar tüm nöron 18-20 sırasında her iki zamanlama ve soy özellikleri kontrol bu daha sonraki bir aşamada yer almaktadır. Bu mekanizmaların içine daha ileri araştırmalar kolayca görselleştirmek ve nöronal hücrelerin farklı popülasyonları ayırt etmek için güvenilir bir yöntem gerektirir. Sox3, Myt1, aşağıdakileri içeren nöral belirteçler, yukarıda bahsedilen ve N küvet ve böylece nöronal farklılaşma 21-23 mekanizmasının ortaya çıkarılması için gerekli olan temel sağlayan bu farklı hücre popülasyonlarının tanımlanması için bir araç sağlayabilir.
Nöronal hücre popülasyonlarının farklı etiketleme diğer model organizmalarda görülmekle birlikte, göreceli olarak az sayıda çalışma bu konuda onun sonuna kadar Xenopus sistemini istismar var. Bu güvenilir, çeşitli neur belirlemek uyumlu antikor azlığı kaynaklanmaktadırnöral tüpte onal hücre popülasyonları. Burada, Xenopus birincil nöron araştırılması için sağlam ve uygun bir yaklaşım sağlar immün aracılığıyla erken Xenopus embriyolar nöronal farklılaşma görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol aşamasında 26 ve evre 45 arasında Xenopus merkezi sinir sisteminin erken gelişimi ilgilenen araştırmacılar için yeterli rehberlik vermelidir.
Burada Xenopus embriyolarındaki primer nöron görselleştirmek için uygun ve etkili bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntem, hücre tipine spesifik markörleri kullanılarak nöronal kök hücrelerin ve farklı primer nöronlar dahil sinir hücrelerinden farklı, değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.
protokol tekrarlanabilirliği çok yüksek seviyede genellikle sağlamdır. Ön kuluçka aşamasında olan embriyoların (yani kadar 28 sahne), bu embriyolar tamamen tespitten önce açılmak için izin verir gibi elle önce tespite vitellin membran kaldırmanızı öneririz. bükülmüş embriyolar montaj odasının içine istenilen yönde de düzenlemek için son derece zor olduğundan, (kuluçka önce) nispeten erken aşamalarında embriyolar toplarken bu özellikle önemlidir. Biz MEMFA veya PFA fiksasyon dolayısıyla ek antijen alma aşamasından sonra immünojenisite kaybı yaşamamış bu protokol için gerekli değildir var. Ayrıca, buimmüno-boyama prosedüründe in situ hibridizasyon kromojenik / floresan örnekler içinde gerçekleştirilebilir. Bu gibi bir durumda, in situ hibridizasyon protokolü sırasında proteaz K muamelesi adımı atlamak için tavsiye edilir. Floresan / kromojenik alt tabaka reaksiyonu sonra, numuneler TBS ile yıkanabilir ve MEMFA / PFA sabit örneklere benzer bir şekilde, balık jelatini çözeltisi içinde gömülü. Örnek şişeler floresan in situ hibridizasyon, daha sonra immünofloresan boyama ile birlikte görüntülenebilir eğer alüminyum folyo şişeleri sararak ışıktan korunur.
Bazı durumlarda, embriyolar jelatin penetrasyon sonra aşırı küçültmek olabilir. Bu büyük olasılıkla yetersiz olduğu tespit veya yetersiz TBS-Triton ekstre kaynaklanır. Embriyolar 2-3 saat için PFA / MEMFA sabit ya da tercihan bir gece boyunca 4 ° C 'de olan emin olun. Sorun devam ederse, 1 saat boyunca 3 TBS-Triton yıkama süresini artırır.
cryo-sezaryen sırasındaplanlama, örnek blok sertliği balık jelatin gibi farklı partiler farklı özelliklere sahip değişebilir. Bu sorun kısmen microtome sıcaklığını ayarlayarak telafi edilebilir. Bir alt sıcaklık örnek blok bölümüne net ve zor olur, ancak aşırı düşük sıcaklık altında bir "sert" örnek bloğu neden olur. Her kesit önce (embriyolar olmadan sahte örnek bloklar kullanılarak) Bazı ince ayar ya da uygulama özellikle değerli örnekleri üzerinde kullanmadan önce yararlı olabilir.
kesit sırasında sık karşılaşılan bir problem ince kesitler bazen kalın cam plaka üzerine sopa yerine çelik sahnede düz kalmak eğilimindedir. Bu sürekli devam eden kesit işlemini keser beri özellikle bozucu olabilir. bölüm odası ve (özellikle) kalınlığında cam levha makine ve o yeterince soğuk veya aşırı statik yük olmamak: Bu gibi durumlarda genellikle iki nedenden birinden kaynaklanırÖzellikle kuru havalarda perator. Eski bölüm odasının ısısını aşağı çevirerek ve uzatmalarda (muhtemelen gece) için içinde cam plaka bırakarak çözülebilir; ve düzgün Kriyostat topraklama ikincisi. metal musluk veya metalden yapılmış benzer su hortumu sistemine kriyostat metal yüzeyine bağlanması statik yük serbest bırakmak için alternatif bir yol olabilir. Her kullanımdan sonra, kalın cam levha, ultra-saf su ile durulanmıştır (örneğin, bulaşık yıkama sıvısı gibi) aşındırıcı olmayan bir deterjan ile iyice yıkandı gereken saf etanol ile püskürtülür, ve zarar verici yüzeyi ve kenarları korumak için havlu kağıt sarılmış.
Protokolde belirtilen antikorlar genellikle belirli ve biz nadiren nonspesifik adsorpsiyon veya yüksek arka plan sinyalini karşılaşıyoruz. Belirtilmelidir gereken engelleme maddesi (serumdaki kabarık çökeltici oluşumu ile görselleştirildiği gibi) aşırı ısı inaktivasyonu olarak ısı ile inaktive edilmiş keçi / kuzu serumu kullanılarak, buBu çökeltici gibi kaçınılması ikincil antikorlar son derece çekici ve yüksek arka kaynağına katkıda bulunabilir.
Bu mümkündür ve zaman zaman aynı zamanda nöronal hücrelerin farklı popülasyonlarının görselleştirmek için çift boyama yapmak için, istenen. Böyle çift boyama mümkündür ve genellikle aşağıdaki kombinasyonları ile tatmin edici sonuçlar verir: Sox3 / N-küvet veya Myt1 / N-küvet. Bununla birlikte, Sox3 ve Myt1 çift boyama iki antikor, tavşan kökenli her ikisi de aslında karmaşık hale gelir. Bu muhtemelen ikincil antikor sinyal amplifikasyon olmaması nedeniyle, çok sayıda antikorun doğrudan etiketleme kitleri, ancak hiçbir tatmin edici sonuçlar (düşük sinyal-gürültü seviyesi) gözlendi test ettik. Bu sorunu aşmak için bir olası bir yaklaşım, aşağıda ele alındığı gibi, Xenopus transjenik çizgileri yükseltmek olabilir.
Bu protokolün ana kısıtlamalar biri olduğunu iken bu protokol olabilir yeterince di olduğununöronal hücrelerin iki ana havuzu stinguish, yani Sox3 ifade eden nöral kök hücre havuzu ve Myt1-ifade farklılaşmış nöronlar, bu farklılaşmış nöronların farklı alt-popülasyonları ortaya çıkarmak için yeteneği yoktur. Bu tür de dahil olmak üzere, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, alt-popülasyonları, primer motor nöronlar, internöron ve duyusal nöronlar, genellikle farklı şekilde eksprese marker genleri 28-30 ile karakterize edilir. Yukarıda belirtildiği gibi, Xenopus embriyolarındaki antikor bazlı immünofloresan tespit yöntemi ile birlikte, in situ hibridizasyon çok renkli gelişmesinde son gelişmeler, potansiyel inceleme 31 için farklılaşmış nöronların Bu alt topluluklar ortaya boşluğu doldurmak olabilir. Alternatif olarak, fare modelinde gösterilmiştir, o da Xenopus gibi farklı hücre popülasyonları ayırt etmek için hücre tipine özgü antikorların daha kapsamlı yükseltmek için istenmektedir.
BuAyrıca değer bu yönteme ek olarak, söz, böyle multiphoton mikroskobu, 3D rekonstrüksiyon ve segmentasyon gibi optik görüntüleme ve görüntü analizi son gelişmeler, aynı zamanda ilk değerlendirmeler daha kapsamlı Xenopus oosit gözlemlerini yanı sıra elde etmek sonra uygulanabilir özellikle 32,33 ayarı canlı kapsamında erken embriyolar. Bu nedenle, çoğalma, farklılaşma ve canlı hayvan nöronal hücreleri hareketini izlemek için, erken Xenopus bu hücre popülasyonlarının canlı gözlenmesine imkan vermek için hücre tipine spesifik promotör tarafından sürülen floresan proteinleri liman bir veya daha fazla transgenik line'lar oluşturmak için arzulanan olur embriyolar. Bir X kurulması tauGFP ve uygulamalarını sürüş nöro-spesifik β-tübülin promotör ile laevis hat güzel bir örnek 23,34 sağladı. Sox3 ve omurgalı 35-37 özelliği myt1 hem tam hızlandırıcı sekansları ile, shXenopus eden ve primer nöron araştırma daha genel bir alan hem de geniş ölçüde katkıda bulunmalıdır Xenopus ek transgenik çizgiler kurmaya nispeten kolay ould.
The authors have nothing to disclose.
Biz nazik sırasıyla anti-Sox3 ve anti-Myt1 antikorları sağlamak için Manchester Üniversitesi'nde Boulder Colorado Üniversitesi Prof. Michael Klymkowsky ve Prof. Nancy Papalopulu teşekkür ederim. Biz bu protokolü gelişmekte onların anlayışlı önerileri için Papalopulu laboratuar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma SZ ve JL iki Şifa Vakfı studentships tarafından desteklenen, SZ / EA ve sırasıyla JL / EA, EA Wellcome Trust (WT082450MA) itibaren bir programı hibe Şifa Vakfı, ve bir Kurumsal Stratejik Destek hibeden iki proje hibe Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z] 'den.
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |