Abstract
A pesar de los avances en la comprensión de la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas (HNSCC) la progresión, la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo baja debido a la recurrencia local y metástasis a distancia. Una hipótesis para explicar esta recurrencia es la presencia de células madre, como el cáncer (CSC) que presentan la quimio y la radio inherente resistencia. Con el fin de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, es necesario disponer de modelos experimentales que validan la eficacia de los tratamientos específicos y, por tanto, disponer de métodos fiables para la identificación y aislamiento de células madre cancerosas. Con este fin, se presenta un protocolo para el aislamiento de células madre cancerosas de las líneas celulares HNSCC humanos que se basa en la combinación de dos granulometrías sucesivas de células realizadas por células activadas por fluorescencia (FACS). El primero de ellos se basa en la propiedad de los CAC a sobreexpresan ATP vinculante cassette (ABC) transportador de proteínas y por lo tanto excluye, entre otros, los tintes de ADN vitales tales como Hoechst 33342. Las células clasificadas con THSe método se identifica como una "población lado" (SP). A medida que las células SP representan un porcentaje bajo (<5%) de las células parentales, es necesario una fase de crecimiento con el fin de aumentar su número antes de la segunda clasificación de células. El siguiente paso permite la selección de células que poseen otras dos características de células madre HNSCC, es decir, alto nivel de expresión del marcador de superficie celular CD44 (CD44 alta) y la sobreexpresión de aldehído deshidrogenasa (ALDH alto). Dado que el uso de un único marcador tiene numerosas limitaciones y dificultades para el aislamiento de células madre cancerosas, la combinación de SP, CD44 y marcadores ALDH proporcionarán una herramienta útil para aislar células madre cancerosas para más ensayos analíticos y funcionales que requieren células viables. Las características madre-como de los CAC fue finalmente validadas in vitro mediante la formación de tumorispheres y la expresión de β-catenina.
Introduction
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es una enfermedad común en todo el mundo ya pesar de los avances en los tratamientos actuales, los pacientes con enfermedad avanzada tienen un mal pronóstico. La tasa de supervivencia 5 años general del paciente es de alrededor de 30% a pesar de la combinación de enfoques terapéuticos que incluyen la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia-terapias dirigidas. Estudios recientes atribuyen recurrencia local y metástasis a distancia para la supervivencia de las células madre, como el cáncer (CSC) siguiendo las terapias contra el cáncer 1. Hay evidencia acumulada apoya la existencia de células que presentan propiedades de células madre (capacidades de estado indiferenciado, auto-renovación y la diferenciación, y la actividad telomerasa) en diversos tumores sólidos incluyendo cáncer de mama, cerebro, próstata, pulmón, colon, páncreas, hígado y piel 2- 10. Sin embargo, el origen de los CAC no está claro 11,12. Ellos pueden ser el resultado de la transformación maligna de las células madre normales o 3,13 dedifferenciación de las células tumorales que adquieren características CSC-como 14,15. Por lo tanto, la comprensión de las vías de distintivos relacionados con CSC proporcionará información sobre el diagnóstico y el tratamiento de HNSCC resistente temprano.
Se ha propuesto que los CAC también poseen fenotipos resistentes que evaden la quimioterapia y la radioterapia estándar, lo que resulta en la recaída del tumor en comparación con la mayor parte de las células tumorales 16-19 y se localizan en hipóxica nichos 20. Se han propuesto numerosos factores para explicar estas resistencias de células madre cancerosas, tales como propensión a la inactividad, mejorado de reparación del ADN, hasta reguladas mecanismos de control del ciclo celular, y la eliminación de radicales libres 21. Por otra parte, varias vías moleculares oncogénicas pueden activarse específicamente en los CAC 17. Con el fin de mejorar el conocimiento de los CAC para terapias selectivas, necesitamos métodos fiables para la identificación y aislamiento de células madre cancerosas, debido a la heterogeneidad de los marcadores relacionados con las células madre envarios tipos de cánceres. 22
En CECC, tallo-como las células iniciadoras de tumores han sido aislados de tumores de pacientes primaria clasificar células que expresan diferentes biomarcadores CSC (tales como transportadores de eflujo de fármaco expresión 23, CD44 alta, baja CD24 CD133 alta, c-Met + 10,24 fenotipo, 25, o una alta actividad de ALDH 26) o el cultivo de tumor primario del paciente para formar squamospheres que tienen propiedades CSC. Sin embargo, el número de squamospheres disminuye drásticamente después de dos pasos, dando así un tamaño pequeño de la muestra para una caracterización adicional estudia 27. Por lo tanto, los ensayos in vitro a partir de líneas celulares bien establecidas es una solución más fácil de diseñar experimentos con el fin de mejorar el conocimiento de los CAC.
El objetivo de este artículo es proponer un método para aislar células madre cancerosas a partir de líneas celulares HNSCC utilizando el análisis de citometría de flujo multiparamétrica unand clasificación de células. La expresión de CD44 en correlación con varias propiedades CSC incluyendo la actividad de ALDH, Side Población (SP) fenotipo, la capacidad y la formación de esferoides tumorigenicidad se utilizan para aislar y caracterizar esta subpoblación de células madre cancerosas. CD44, una glicoproteína de superficie celular, está implicada en la adhesión celular y la migración. CD44 se expresa altamente en muchos tumores sólidos los CAC 28, incluso en modelos de cáncer de cabeza y cuello 29-31. Por otra parte, las células CD44 altas pueden generar in vivo un tumor heterogéneo mientras que las células CD44 bajas no pueden 10. El ensayo SP se basa en el potencial diferencial de las células para flujo de salida el colorante Hoechst 22 a través de la familia de casete de unión a ATP (ABC) de proteínas transportadoras sobreexpresados dentro de la membrana CSC. Este ensayo incluye el uso de inhibidores del transportador ABC como verapamilo en muestras de control. Aldehído deshidrogenasa (ALDH) es una enzima intracelular que está implicada en la conversión de retinol a retácido inoic durante la diferenciación de células madre al comienzo 25,26. Las células que presentan actividad muestran el comportamiento de células madre similares a alta ALDH en HNSCC 26 y un número muy limitado de células de alta ALDH son capaces de generar tumores in vivo 26,32.
La combinación de estos marcadores y propiedades se utilizó con éxito por Bertrand e t al. Para estudiar la resistencia in vitro e in vivo de estas células madre cancerosas a la radiación de fotones y 19 de iones de carbono. Sus resultados mostraron claramente que la combinación de varios marcadores de células y las propiedades son más selectivos para los estudios útiles en poblaciones CECC CSC que los enfoques de un solo marcador.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices locales en el cuidado de animales. Todos los detalles de este estudio fueron aprobados por el CECCAPP, un comité de ética francés.
1. La selección de un lado la población (SP) por el colorante Hoechst Ensayo de eflujo
- La tinción 50 millones de células con Hoechst 33342.
- Se preparan dos tubos de 15 ml estériles con un fondo cónico: un tubo etiquetado "Hoechst" y la otra "Hoechst y verapamilo". Preparar 10 ml de solución de clorhidrato de verapamilo 5 mM en agua estéril. Preparar el medio de cultivo (CM) para las células madre.
- Para preparar CM para CSC (CM-CSC), se combinan los siguientes: medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% de suero de ternera fetal (FCS), 0,04 mg / L de hidrocortisona , 100 U / ml de penicilina, 0,1 g / l de estreptomicina, y 20 g / l de factor de crecimiento epidérmico (EGFR).
- Bajo una campana de flujo laminar, trypsinize células. Retirar el medio, lavar con ssolución salina de fosfato tamponada terile (PBS) y se añade 1 ml de tripsina-EDTA (0,5 g / L) para un matraz de 75 cm². Incubar 3 minutos a 37 ° C. Detener la reacción mediante la adición de medio de cultivo utilizado para la línea celular parental. Contar el número de células utilizando un contador de células.
- Para preparar CM para la línea celular parental (CM-P), complementar DMEM con 10% de FCS, 0,4 mg / L de hidrocortisona, 100 U / ml de penicilina y 0,1 g / l de estreptomicina).
- Se diluye la suspensión celular obtenida en la etapa 1.1.2 para obtener 10 7 células / ml en CM-P. Dividir la suspensión de células en los 2 tubos preparados: poner 100 l (10 6 células) en el tubo "Hoechst y verapamilo" y 4 ml (4 x 10 7 células) en el tubo "Hoechst".
- En la muestra "Hoechst y verapamilo", añadir 10 l de solución de clorhidrato de verapamilo 5 mM (concentración final: 0,5 mM) y mezclar suavemente. Añadir 5 l de 1 g / L solución de Hoechst (concentración final: 0,1 g / L). En la muestra & #34; Hoechst ", añadir 5 l de 1 g / L de solución por cada 10 6 células (200 totales l) Hoechst A partir de entonces, mantener las muestras protegidas de la exposición a la luz directa utilizando papel de aluminio..
- Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 ° C durante 1 hora y 30 minutos. Mezclar suavemente cada 15 minutos para evitar que las células se asiente.
- tubos de centrifugación a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet con 2 ml de PBS 1x.
- tubos de centrifugación a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Resuspender "Hoechst y verapamilo" pellet en 500 l de 5 mg / L de yoduro de propidio (PI) diluido en tampón PBS y pellet "Hoechst" en 4 ml de 5 mg / L PI diluido en tampón PBS.
- Transferencia de las soluciones de muestra a través de un filtro de 70 micras para eliminar los agregados de células y recoger células individuales en tubos para la absorción de la muestra en el citómetro de flujo. Mantener las muestras en hielo y proteger de la exposición a la luz directa utilizando papel de aluminio.
- Se preparan dos tubos de 15 ml estériles con un fondo cónico: un tubo etiquetado "Hoechst" y la otra "Hoechst y verapamilo". Preparar 10 ml de solución de clorhidrato de verapamilo 5 mM en agua estéril. Preparar el medio de cultivo (CM) para las células madre.
- yoconsuelos de la Población lateral Excluyendo colorante Hoechst por clasificación de células.
- Realizar Hoechst separación de células negativo en un clasificador de citometría de flujo con los siguientes parámetros: láser UV (355 nm), 2 detectores en el camino láser UV con Hoechst azul (450/50 BP) y Hoechst rojo (610/20 BP) filtros y 2 colectores.
- En primer lugar, analizar la muestra "Hoechst" que sirve como un control positivo para la tinción y citómetro de flujo configuración.
- Usando el software citómetro, en la ventana "Hoja de trabajo global", haga clic en "Dot Plot" (quinta arriba imagen de la derecha) y crear un gráfico en la hoja de trabajo global. En la ordenada, con un clic derecho, seleccione FSC-A (dispersión hacia adelante) y en abscisas, SSC-A (dispersión lateral) (Figura 1A). De la misma manera, crear un SSC-W frente gráfico de puntos SCC-H. En este segundo gráfico de puntos, para crear una región P1, haga clic en "puerta Polígono" (XIV arriba imagen de la derecha) (Figura 1B) 33.
Nota: La región P1abarcar las células individuales y discriminar dobletes. - Opcional: Excluir PI células positivas mediante la creación de una EVE-A frente PI cerrada en P1. En este gráfico de puntos, seleccione la población negativa PI (P2) para excluir las células muertas de PI positivas.
- Usando el software citómetro, en la ventana "Hoja de trabajo global", haga clic en "Dot Plot" y crear un gráfico en la hoja de trabajo global. En la ordenada, con un clic derecho, seleccione azul Hoechst-A y el eje de abscisas, rojo Hoechst-A. Con un clic derecho sobre la población, seleccione "Mostrar población" y P1. En esta gráfica de puntos, crear una región (P2) para seleccionar las células Hoechst población lado tinte negativo (SP) que aparece como un brazo lateral de la izquierda de la población principal de las células (Figura 1C).
- Analizar la muestra "Hoechst" y recoger 10.000 eventos. Para asegurarse de que la puerta P2, que representa la población SP, está bien posicionado, analizar la muestra "Hoechst y verapamilo" (10.000 eventos)para observar la desaparición de la población SP (Figura 1D).
- Recoger las células negativas de colorante Hoechst SP en un tubo de 15 ml que contiene 1 ml de CM-CSC preparados en 1.1.1.1.
- Al final de la clasificación de células, se centrifuga la suspensión de células a 250 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1 ml de CM-CSC. Contar el número de células clasificadas utilizando un contador de células y la transferencia del número apropiado de células para un frasco de cultivo (véase la Tabla 1). Añadir CM-CSC y se incuba a 37 ° C y 5% CO 2 atmósfera.
- Mantener células en cultivo en las mismas condiciones para un máximo de 2 pasajes hasta que haya un mínimo de 5 x 10 7 células (véase el paso 3, "método de cultivo celular").
- Realizar Hoechst separación de células negativo en un clasificador de citometría de flujo con los siguientes parámetros: láser UV (355 nm), 2 detectores en el camino láser UV con Hoechst azul (450/50 BP) y Hoechst rojo (610/20 BP) filtros y 2 colectores.
2. Selección de la alta / alta ALDH subpoblación CD44 en el lateral Población Ordenada
- La tinción de 50 millones de células SP con el kit de detección de ALDH y CD44 anticuerpo.
- Preparar siete 15 ml tubos estériles etiquetados como sigue: "no teñida" (Tubo a), "CD44-APC" (Tubo b), "IgG1-APC" (Tubo c), "ALDH" (Tubo d), "ALDH y DEAB "(tubo e)," ALDH y CD44-APC "(tubo f)," ALDH, DEAB y CD44-APC "(tubo g). Mantenga todos los tubos y reactivos a 4 ° C durante la tinción.
- Preparar el tampón A con 4,5 ml del tampón 1 (contenido en el kit) y 45 l de CD44-APC (aloficocianina) anticuerpo (dilución 1: 100). Preparar tampón B con 100 l de tampón 1 y 1 l de anticuerpo IgG1-APC (dilución 1: 100). Preparar el tampón C con 4 ml de tampón 1 y 20 l de reactivo del kit.
- Preparar una suspensión celular de las células previamente ordenados (paso 1.2.5) a 10 7 células / ml. Añadir 100 ml (10 6 células) de la suspensión celular a tubos de a, b y c, y 4 ml (4 x 10 7 células) a f tubo. Por el momento no poner las células en tubos d, e y g.
- Centrifugar los tubos que contienen las células a 250 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender los gránulos en tubos A, B y C en 100 l de tampón 1. Añadir 5 l de diethylaminobenzaldehyde (DEAB), un inhibidor de ALDH de tubos e y g.
- Resuspender las células en tubo de f con 4 ml de reactivo C e inmediatamente se transfieren 100 l en tubos d, e y g. Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min y proteger de la exposición a la luz directa utilizando papel de aluminio. Mezclar la suspensión de células suavemente mediante agitación con vórtex después de 15 min a evitar que las células de sedimentación.
- A partir de este momento, mantener los tubos en hielo y protegido de la luz directa utilizando papel de aluminio. Centrifugar los tubos a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y se elimina el sobrenadante.
- f tubo de volver a suspender en 4 ml y tubos by g con 100 l de tampón A. Se resuspenden tubo C con 100 l de tampón B. Para los otros tubos, añadir 100 l de tampón 1. Incubar 10 min a 4 °;DO.
- Centrifugar los tubos a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y se elimina el sobrenadante. Enjuagar una vez con 1 ml de tampón 1 (4 ml para tubo f) y centrifugar de nuevo a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender tubo f sedimento en 4 ml y todos los otros tubos en 1 ml de tampón 1.
- La transferencia de las soluciones de muestra a través de 70 coladores celulares micras para eliminar los agregados y recoger las células individuales en tubos apropiados para la absorción de la muestra en el citómetro de flujo.
- El aislamiento de la CD44 alta ALDH alta célula Población / fluorescencia por clasificación de células activadas.
- Realizar CD44 de alta / ALDH alta clasificación de células en un clasificador de citometría de flujo con los siguientes parámetros: láser azul (488 nm) y el láser rojo (633 nm), 1 detector en la trayectoria de láser azul con un filtro FITC (530/30), 1 detector en la trayectoria del láser rojo con un filtro de APC (660/20) y 2 colectores.
- Usando el software citómetro, haga clic en "Dot Plot "(la quinta imagen superior derecha) para crear una FSC-A frente a SSC-Un gráfico de puntos como se describe en la sección 1.2.1.2, para comprobar la morfología celular y seleccionar una población compuesta de células individuales con un SSC-W frente a SSC-H Gráfica de puntos.
- Usando el software citómetro, en la ventana "Hoja de trabajo global", haga clic en "Dot Plot" y crear un gráfico en la hoja de trabajo global. En la ordenada, con un clic derecho, seleccione APC-A y el eje de abscisas, FITC-A con el fin de seleccionar la población doble de colores. Crear una puerta utilizando tubos D y E para seleccionar pilas de gran ALDH (Figura 2A). Nota: Las células positivas desaparecen en el tubo e tratado con DEAB (Figura 2B).
- En el mismo gráfico, crear una segunda puerta utilizando tubos B y C en el fin de seleccionar las células CD44 altas (Figura 2C y 2D). Las células positivas desaparecen en el tubo que contiene IgG1-APC. Analizar tubos F y G y crear una tercera puerta que incluye CD44 alta / ALDH <sup> pilas de gran (Figura 2e y 2F).
Nota: Si las células positivas están presentes en el tubo que contiene IgG1-APC (Figura 2D), la interacción entre las células y el anticuerpo teñido con APC no es específico.
- En el mismo gráfico, crear una segunda puerta utilizando tubos B y C en el fin de seleccionar las células CD44 altas (Figura 2C y 2D). Las células positivas desaparecen en el tubo que contiene IgG1-APC. Analizar tubos F y G y crear una tercera puerta que incluye CD44 alta / ALDH <sup> pilas de gran (Figura 2e y 2F).
- Recoger CD44 de alta / ALDH pilas de gran en un tubo de 15 ml que contiene 1 ml de CM-CSC. Recoge también CD44 baja / ALDH baja en un tubo de 15 ml que contenía 1 ml de CM 19. Nota: Preparar CM-CSC como se describe en el paso 1.1.1.1.
- Centrifugar la suspensión celular a 250 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 1 ml de CM-CSC. Contar el número de células clasificadas.
3. Método de Cultivo Celular
- Después de la doble clasificación de las células como se describió anteriormente, la placa de las células clasificadas en un matraz de cultivo apropiado (Tabla 1) con CM-CSC a 37 ° C con 5% de CO 2. Después de 18-24 horas,comprobar si se han adherido las células y cambiar el medio de cultivo. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días hasta que las colonias en expansión son mayores que 50% de confluencia.
- Usa el volumen apropiado de tripsina 0,5 g / L - EDTA (Tabla 1) para trypsinize células del matraz de cultivo. Se incuban las células 3-5 min a 37 ° C. Añadir el volumen apropiado de CM-CSC (Tabla 1) para detener la acción de la tripsina.
- Contar el número de células obtenidas y la placa 4 x 10 5 células en un frasco de cultivo de 175 cm² con CM-CSC. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2. A esta concentración, las células con un tiempo de duplicación de 24 horas será el 70% de confluencia en 7 días.
- Utilice los CAC como in vitro o in vivo los experimentos antes de que hayan sido sometidos a 3 pasajes.
4. La confirmación del potencial y las características del tumor CSC
- Esfera Formación de tumores para confirmar el potencial del tumor de la alta CD44 / ALDHaltos células.
- Trypsinize células como se describe en 3.2. Añadir 1 x 10 6 células a un tubo de 15 ml y centrifugar a 250 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en un DMEM: F12 (3: 1) FCS medio libre, 20 ng / ml de EGFhr, 4 mg / l de heparina y 1x B27. Se incuban las células en un matraz de cultivo de 6 pocillos bajo placas de anclaje a 37 ° C y 5% de CO 2.
Nota: El uso DMEM: F12 (3: 1) medio que contiene 5% de FCS, 20 ng / ml de EGFhr, 4 mg / L de heparina y 1x B27 si la celda no crecen sin FCS. - Observar la formación esfera tumor con un microscopio óptico de 4 a 10 días después de la siembra (Figura 3A).
Nota: El tumor diámetro de la esfera debe ser mayor de 35 micras. Las células CD44 altas / ALDH altos mostrarán una formación de esferas tumoral más rápido y más mejorada en términos de número y tamaño en comparación con CD44 baja baja / ALDH.
- Trypsinize células como se describe en 3.2. Añadir 1 x 10 6 células a un tubo de 15 ml y centrifugar a 250 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en un DMEM: F12 (3: 1) FCS medio libre, 20 ng / ml de EGFhr, 4 mg / l de heparina y 1x B27. Se incuban las células en un matraz de cultivo de 6 pocillos bajo placas de anclaje a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Evaluación de la tumorigenicidad in vivo DespuésLa inyección subcutánea de CD44 altas altas células / ALDH en ratones NOD-SCID.
- Después de la clasificación, las células re-suspender en PBS a tres concentraciones diferentes (10 4 células / ml, 10 5 células / ml, y 10 6 células / ml). Inyectar por vía subcutánea 100 l de 10 4 células / ml (10 3 células) en la región del flanco derecho de 6 ratones. Haga lo mismo con 10 5 células / ml (10 4 células), y 10 6 células / ml (10 5 células).
Nota: Bajo la dilución de 10 3 células pueden ser probados. - Se inyecta la misma concentración de células CD44 / ALDH bajas bajas en la región del flanco izquierdo. Seguir los ratones inyectados por hasta 10 semanas para ver la progresión del tumor 19.
- Después de la clasificación, las células re-suspender en PBS a tres concentraciones diferentes (10 4 células / ml, 10 5 células / ml, y 10 6 células / ml). Inyectar por vía subcutánea 100 l de 10 4 células / ml (10 3 células) en la región del flanco derecho de 6 ratones. Haga lo mismo con 10 5 células / ml (10 4 células), y 10 6 células / ml (10 5 células).
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Representative Results
El aislamiento de células madre cancerosas a partir de líneas celulares HNSCC requiere dos ordenación sucesiva debido a la muy bajo porcentaje de células madre cancerosas en la línea celular de sus padres. La primera clasificación se basa en la capacidad de CSC para excluir el colorante Hoechst debido a transportadores de eflujo de fármacos. Esto dio como resultado la adquisición de 1-5% de la población celular total ordenado (Figura 1). Durante el colorante Hoechst clasificación de células negativa, comprobar el tamaño y la granulación de células clasificadas por mirar el FSC-A frente a SSC-Un diagrama de puntos (Figura 1A). Entonces, discriminar dobletes y fragmentos de células mediante el uso de la SSC-W frente gráfico de puntos de SSC-H y la selección de la población P1 (Figura 1B). En esta población P1, crear una Red Hoechst-A frente Hoechst Azul-Un gráfico de puntos. Con el tubo de la etiqueta "Hoechst", el SP aparece como un brazo lateral de la izquierda de la principal población de células (Figura 1C). Esta población debe desaparecer cuando are tratados con verapamil (Figura 1D), un inhibidor de los transportadores ABC. La tinción PI permite la exclusión de las células muertas de la PI-positivo porque esta población es menor escala en la Red Hoechst-A escala (Figura 1C y 1D, elipses azules).
La segunda clasificación de células se basa en la alta expresión del receptor y de alta actividad de la enzima ALDH CD44 que permitió la adquisición de 0,5 a 2% de las células SP anteriormente según (Figura 2). Antes de la clasificación, se utilizaron varios controles. Los primeros son el "ALDH" y los tubos "ALDH + DEAB" necesarios con el fin de colocar la primera puerta en pilas de gran FITC (Figuras 2A y 2B): pilas de gran ALDH fueron cerrada en la FITC-A versus APC-A dot parcela usando el "ALDH" tubo (Figura 2A). La buena posición de la puerta se comprobó mediante el "ALDH + DEAB "tubo:.. Como DEAB inhibe ALDH, las células positivas deben desaparecer de la puerta (Figura 2B) Si no lo hacen, cambian las condiciones de reacción (por el aumento de la cantidad de DEAB por ejemplo) El segundo control es el" CD44-APC "y los" tubos IgG1-APC ", que les permite posicionar la segunda puerta en pilas de gran APC (Figuras 2C y 2D) utilizando las células teñidas con el anticuerpo CD44-APC (Figura 2C). Esta población debe desaparecer con el tubo de control que contenía células IgG1-APC (Figura 2D). Si no es así, el enlace con el anticuerpo no es específico y BSA 0,5% se debe añadir en tampón 1 del kit de detección de ALDH durante la reacción de anticuerpos. por último, la tercera el control se refiere a la "ALDH y CD44-APC" tubo y "ALDH, DEAB y CD44-APC" tubos (Figuras 2E, 2F, 2G y 2H). la doble stacaniza ALDH tubo / CD44 se utiliza para posicionar la última puerta en las células dobles positivas (Figura 2e) y el mismo tubo tratado con DEAB es un control para verificar que las células ALDH altos desaparecen (Figura 2F).
Este protocolo se utiliza para ordenar los CAC de la las líneas de células FaDu SQ20B y. Cuando la clasificación se realiza por primera vez en una nueva línea celular, con el fin de asegurar que las células clasificadas tienen propiedades de las células madre, como es necesario para confirmar su potencial tumoral. Una de las propiedades de células madre-como es su capacidad para formar tumorspheres in vitro en un medio sin FCS. Bajo esta condición, sólo las células madre de cáncer-como pueden sobrevivir y proliferar (Figura 3A). Por otra parte, los experimentos de qPCR muestran una alta expresión de β-catenina (marcador de la característica de tallo similares) en las células CD44 de alta / ALDH altos (Figura 3B), así como Bmi-1 y Notch 19 </ Sup>. Por último, pilas de gran alta / ALDH CD44 también son capaces de formar tumores cuando se inyectan en cantidades bajas en comparación con las células CD44 bajos de baja / ALDH 19.
Figura 1: aislamiento de una población lado excluyendo el colorante Hoechst (A) FSC-A versus SSC-A gráfico de puntos.. (B) SSC-W frente gráfico de puntos de SSC-H. (C, D) Hoechst Rojo-A frente Hoechst Azul-Un gráfico de puntos con el tubo de "Hoechst" (C) o con el tubo "Hoechst y verapamilo" (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Así rting de CD44 altas pilas de gran / ALDH de células negativas de colorante Hoechst. FITC-A versus APC-A gráfico de puntos usando el tubo "ALDH" (A), el "ALDH + DEAB" tubo (B), el "CD44-APC" tubo (C), el tubo "IgG1-APC" (D), el "ALDH y CD44-APC" tubo (e y G) o el tubo "ALDH, DEAB y CD44-APC" (F y H). Las figuras A, B, C, D, E y F se obtuvieron utilizando la línea celular SQ20B. Figuras G y H obtuvieron utilizando la línea celular FaDu. El color verde indica CD44 baja ALDH células / bajas (Q3); azul oscuro indica CD44 / ALDH bajo pilas de gran (Q1); púrpura indica CD44 alto células ALDH / bajas (Q4); azul claro indica CD44 / alta pilas de gran ALDH (Q2)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. La confirmación de potencial tumor de células CD44 altas / ALDH altos células clasificadas CD44 altas / ALDH altas fueron capaces de formar tumorspheres in vitro (A) en un medio pobre-FCS. Barra de escala, 25 micras. Por otra parte, CD44 alta / alta ALDH-expresan β-catenina, un marcador de la tumorigenicidad (B). Esta cuantificación se ha realizado por qPCR y barras de error representan SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número de célulasordenados | Cultura del tipo de frasco | Volumen de tripsina (ml) | Medio de Cultivo Volumen (ml) |
| 10,000-200,000 | 1 pocillo de una placa de 6 pocillos o una placa de Petri 3,5 cm | 0,5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | matraz de cultivo T25 1 | 1 | 4 |
| > 1000000 | matraz de cultivo T75 1 | 2 | 10 |
Tabla 1: Cultura del tipo de frasco a utilizar de acuerdo con el número de células clasificadas detalles del tamaño de frasco de cultivo para el número aproximado de células clasificadas se les da.. También se proporcionan El volumen de tripsina y volumen de medio requerido para el tipo matraz de cultivo.
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Discussion
Este protocolo describe un método fiable para el aislamiento con éxito de células madre cancerosas de una línea celular específica que es aplicable a otras líneas celulares HNSCC. Aislado CSC cabeza y cuello son entonces adecuado para la caracterización molecular más in vitro y validación funcional de trasplante en ratones inmunodeficientes 19. Sin embargo, algunas modificaciones pueden ser probados en función de la población lado o los de alta / ALDH altos porcentajes de CD44 presentes en la línea celular parental. Por ejemplo, si el porcentaje de células en la población lado es demasiado bajo en una línea celular particular, la alta / ALDH alta clasificación CD44 puede realizarse directamente. Los marcadores utilizados en este estudio pueden ser sustituidos por otros marcadores adecuados para la línea de células estudiadas como CD133 alta 34 o 35 CD10 alta.
Este protocolo se basa en dos granulometrías de células. Tres clasificación por color con SP + CD44 + ALDH no era posible con las líneas celulares ensayadas. En primer lugar, las líneas celulares de sus padres probados aquí en la presencia de menos de 5% de SP y menos del 10% pilas de gran alta / ALDH CD44 en el SP. Por lo tanto, SP / CD44 alta / alta ALDH representan menos del 0,5% de la línea celular de sus padres. Por lo tanto, una primera clasificación SP es necesario con el fin de enriquecer la población de CD44 pilas de gran altura y / o ALDH. En segundo lugar, para ordenar el 1% de la línea celular de sus padres, se tarda 5 horas para obtener aproximadamente 300.000 células. Por lo tanto, si se realiza una clasificación de células de 3 colores, la cantidad de células recogidas será muy baja. Por otra parte, ya la clasificación no se recomienda ya que puede afectar la viabilidad celular.
Debido a la selectividad de este protocolo de aislamiento, la principal limitación es el pequeño número de células madre cancerosas obtenidos. Esto podría ser problemático para llevar a cabo experimentos adicionales, ya que no se recomienda el uso de ellos después de 3 pasos, debido a la rápida pérdida de CD44 y Amarcadores de LDH. Además, antes de cada nuevo experimento, el porcentaje de CD44 pilas de gran alta / ALDH aún presentes en la suspensión de células se debe probar con el fin de comprobar el número de células madre cancerosas que ha diferenciadas.
Es imperativo para preparar solución de clorhidrato de verapamilo y el medio de cultivo que contiene EGF justo antes de su uso como estas moléculas son muy inestables. Una solución madre de EGF a 20 mg / L es estable durante tres meses a -20 ° C. Existen variaciones del protocolo de Hoechst, pero la concentración de colorante final de uso general es de 5 mg / ml. Por otra parte, durante la primera clasificación, composiciones diferentes medios de cultivo deben ser probados de acuerdo con la línea celular utilizada. Una vez que se validan las condiciones de clasificación, es necesario revisar las propiedades de la población de células clasificar por medio de los diferentes métodos (sección 4).
marcadores de superficie celular, la actividad de ALDH y la capacidad de flujo de salida colorantes vitales han sido ya utilizado individuaLLY en la literatura para aislar células madre cancerosas de la CECC. Sin embargo, el protocolo descrito aquí tiene la ventaja única de usar combinaciones de diversos marcadores con el fin de lograr una alta especificidad en el aislamiento de líneas celulares CSC HNSCC. Por otra parte, la CD44 sorting podría realizarse con un anticuerpo anti-CD44 conjugado con magnéticos micro perlas y ordenados con una columna magnética 36, pero este método sólo es aplicable a los marcadores de superficie celular y no se puede utilizar para una clasificación ALDH, evitar la doble clasificación . Otro método utilizado para obtener células madre cancerosas es la cultura tumorsphere de tumores primarios 37 o xenoinjertos 38. Sin embargo, la adquisición de estos tumores primarios o xenoinjertos están asociados con limitaciones éticas.
Dado que este método aísla células madre cancerosas HNSCC viables, que pueden ser utilizados (después de comprobar su tumorigenicidad) en una serie de experimentos que miden la función fisiológica de estas células. Por lo tanto, permite la evaluación del comportamientode células madre cancerosas siguiendo diferentes enfoques terapéuticos (radioterapia, quimioterapia). También permite el estudio de diversos parámetros biológicos tales como la migración / invasión, la reparación del ADN, la señalización celular, etc. Por lo tanto, la obtención de células madre cancerosas de diferentes líneas celulares es una opción atractiva para la investigación de las propiedades CSC.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
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