Abstract
Несмотря на достигнутые успехи в понимании головы и шеи плоскоклеточный рак (ПРГШ) прогрессирования, частота пятилетняя выживаемость остается низкой из-за местных рецидивов и отдаленных метастазов. Одна из гипотез для объяснения этого рецидива является наличие раковых стволовых клеток типа (CSC), которые представляют присущую хемо- и радиорезистентности. В целях разработки новых терапевтических стратегий, необходимо иметь экспериментальные модели, которые проверки эффективности целевых методов лечения и, следовательно, иметь надежные методы для идентификации и выделения ЦОК. С этой целью мы приводим протокол для выделения ЦОК из линий человеческих клеток ПРГШ, которая опирается на комбинации двух последовательных сортировок клеток, выполненных с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS). Первый из них основан на свойстве ЦОК к сверхэкспрессии АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеру белков и, таким образом, исключить, среди других, жизненно важных красителей ДНК, такие как Hoechst 33342. Клетки отсортирован нногоявляется метод идентифицируются как "побочный населения" (СП). По мере того как SP клетки представляют собой низкий процент (<5%) родительских клеток, растущая фаза необходима для того, чтобы увеличить их число до второй сортировки клеток. Следующий шаг позволяет для отбора клеток , которые обладают двумя другими характеристиками ПРГШ стволовых клеток , то есть высокий уровень экспрессии маркера клеточной поверхности CD44 (CD44 высокий) и избыточная экспрессия альдегиддегидрогеназой (ALDH высокий). Так как использование одного маркера имеет многочисленные ограничения и подводные камни для изоляции ЦОНов, сочетание SP, CD44 и маркеры ALDH обеспечит полезный инструмент для выделения CSCs для дальнейших аналитических и функциональных анализов, требующих жизнеспособных клеток. Стволовые подобные характеристики ЦОК была окончательно подтверждена в пробирке формирования tumorispheres и экспрессии бета-катенина.
Introduction
Голова и шея плоскоклеточный рак (ПРГШ) является распространенным злокачественным во всем мире и, несмотря на прогресс в современных методов лечения, у пациентов с прогрессирующим заболеванием имеют плохой прогноз. Общая 5-летняя выживаемость пациентов составляет около 30%, несмотря на сочетание терапевтических подходов, включая операции, химио-лучевой терапии и целевых-терапии. Недавние исследования объясняют местный рецидив и отдаленные метастазы для выживания раковых стволовых клеток типа (ОКК) после терапии противоопухолевыми 1. Существует накопления доказательств , подтверждающих существование клеток , представляющих стволовых клеток свойства (недифференцированные состояния, самообновлению и дифференцировке потенциала и активности теломеразы) в различных солидных опухолей , включая рак груди, мозга, простаты, легких, толстой кишки, поджелудочной железы, печени и кожи 2- 10. Тем не менее, происхождение ЦОК остается неясным 11,12. Они могут возникнуть в результате злокачественной трансформации нормальных стволовых клеток 3,13 или dedifferenференцирование опухолевых клеток , которые приобретают ОКК-подобные функции 14,15. Таким образом, понимание отличительных путей, связанных с ЦОК обеспечит понимание ранней диагностики и лечения резистентной ПРГШ.
Было высказано предположение , что ЦОК также обладают устойчивые фенотипы , которые уклоняются стандартной химиотерапии и лучевой терапии, что приводит к рецидиву опухоли по сравнению с основной массы опухолевых клеток и 16-19 локализованы в гипоксических ниши 20. Многочисленные факторы были предложены для объяснения этих сопротивлений ЦОК, такие как склонность к пассивности, усиливается репарации ДНК, повышающей регуляции механизмов контроля клеточного цикла, и свободных радикалов , поглощающие 21. Кроме того, несколько онкогенных молекулярные пути могут быть специфически активированы в ЦОК 17. В целях повышения знаний о ЦОК для дальнейших целенаправленных-терапии, нам нужны надежные методы для идентификации и выделения ЦОК, вследствие неоднородности маркеров стволовых клеток, связанных вразличные виды рака 22.
В ПРГШ, стволовой как опухолевые инициирующие клетки были выделены из первичных опухолей пациентов с помощью сортировки клеток , экспрессирующих различные биомаркеры КАН (такие как транспортеров выражение эффлюксного препарат 23, CD44, CD24 высокой низкой CD133 высокой, с-Met + фенотип 10,24, 25, или ALDH высокая активность 26) или культивирования первичной опухоли пациента с образованием squamospheres , которые имеют свойства CSC. Тем не менее, количество squamospheres резко уменьшается после двух пассажей, таким образом , давая небольшой размер выборки для дальнейшей характеристики исследования 27. Таким образом, в пробирке анализы , начиная от хорошо зарекомендовавших клеточных линий является простое решение для разработки экспериментов с целью улучшения знаний о ОКК.
Цель данной статьи состоит в том, чтобы предложить способ изолировать CSCs из линий ПРГШ клеток с использованием многопараметрической проточной цитометрии анализамй сортировки клеток. Выражение CD44 в корреляции с несколькими свойствами ОКК включая ALDH активности, со стороны населения (SP) фенотип, сфероид способность формирования и туморогенность используются, чтобы изолировать и охарактеризовать этот субпопуляции ЦОНов. CD44, клеточной поверхности гликопротеин, участвует в клеточной адгезии и миграции. CD44 экспрессируется на высоком уровне во многих солидных опухолях ЦОК 28, в том числе и в моделях рака головы и шеи 29-31. Кроме того, CD44 высокие клетки могут генерировать в естественных условиях гетерогенной опухоли , тогда как CD44 низкие клетки не могут 10. Анализ SP основана на дифференциальном потенциала клеток в оттоке красителя Hoechst 22 посредством семейства АТФ-связывающего кассетного (ABC) из белков - переносчиков избыточно экспрессируется в мембране CSC. Этот анализ включает в себя применение ингибиторов ABC-переносчиков, такие как верапамил в контрольных образцах. Альдегиддегидрогеназа (ALDH) является внутриклеточным ферментом, который участвует в превращении ретинол в РЭТinoic кислоты во время дифференцировки ранних стволовых клеток 25,26. Клетки , которые обладают высокой ALDH активность шоу стволовых клеток , как поведение в ПРГШ 26 и очень небольшое число ALDH высоких клеток способны генерировать опухоли в естественных условиях 26,32.
Сочетание этих маркеров и свойств был успешно использован Бертрана е т др. , Чтобы изучить сопротивление в пробирке и в естественных условиях этих ЦОК для фотонов и иона углерода излучения 19. Их результаты ясно показали, что сочетание различных маркеров и свойств клеток являются более селективными в отношении полезных исследований на популяции ПРГШ ОКК по сравнению с однократной маркерных подходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были проведены в соответствии с местными правилами по уходу за животными. Все детали этого исследования были одобрены CECCAPP, французского комитета по этике.
1. Выбор Side населения (SP) по Hoechst Dye оттоку Пробирной
- Окрашивание 50 миллионов клеток с Hoechst 33342 красителя.
- Приготовьте два 15 мл стерильные пробирки с коническим дном: одну трубку с надписью "Hoechst" и один с надписью "Hoechst и Верапамил". Приготовьте 10 мл 5 мМ раствора гидрохлорида верапамила в стерильной воде. Подготовка культуральной среды (CM) для стволовых клеток.
- Для подготовки см для CSC (CM-CSC), сочетают в себе следующее: модифицированной среде Дульбекко Eagle (DMEM): F12 (1: 3, по объему), 5% фетальной сыворотки теленка (FCS),, 0,04 мг / л гидрокортизона , 100 ед / мл пенициллина, 0,1 г / л стрептомицина, и 20 мкг / л эпидермального фактора роста (EGFR).
- Под капотом ламинарного потока, Trypsinize клетки. Удалить СМИ, мыть сterile фосфатно-солевой буфер (PBS), и добавляют 1 мл трипсин-ЭДТА (0,5 г / л) в течение 75 cm² колбу. Выдержите в течение 3 мин при 37 ° С. Остановить реакцию путем добавления культуральной среды, используемый для родительской линии клеток. Подсчитайте число клеток с использованием счетчика клеток.
- Для подготовки см для исходной клеточной линии (см-P), дополняют DMEM с добавлением 10% FCS, 0,4 мг / л гидрокортизона, 100 ед / мл пенициллина и 0,1 г / л стрептомицина).
- Развести клеточной суспензии , полученной на стадии 1.1.2 , чтобы получить 10 7 клеток / мл в СМ-P. Разделение суспензии клеток в 2 пробирки , подготовленные: положить 100 мкл (10 6 клеток) в трубке "Hoechst и верапамил" и 4 мл (4 х 10 7 клеток) в трубке "Hoechst".
- В образце "Hoechst и верапамил", добавьте 10 мкл 5 мМ раствора Верапамил гидрохлорид (конечная концентрация: 0,5 ммоль) и аккуратно перемешать. Добавьте 5 мкл 1 г / л раствора Hoechst (конечная концентрация: 0,1 г / л). В образце & #34; Hoechst ", добавьте 5 мкл 1 г / л Hoechst раствора на 10 6 клеток (200 мкл всего) В дальнейшем, держать образцы , защищенные от прямого воздействия света с помощью алюминиевой фольги..
- Инкубируйте все пробирки в водяную баню при температуре 37 ° С в течение 1 ч 30 мин. Осторожно перемешать каждые 15 минут, чтобы предотвратить клетки от успокаивается.
- Пробирки центрифужные при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют каждую гранулу с 2 мл 1x PBS.
- Пробирки центрифужные при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант. Ресуспендируют "Хехст и верапамил" осадок в 500 мкл 5 мг / л пропидийиодидом (PI), разведенного в PBS буфере и "Хехст" осадок в 4 мл 5 мг / л PI разведенного в буфере PBS.
- Передача растворов образцов через 70 мкм клеточный фильтр с для удаления агрегатов и собирать отдельные клетки в пробирки для поглощения образца на проточном цитометре. Храните образцы на льду и защищенном от прямого воздействия света с помощью алюминиевой фольги.
- Приготовьте два 15 мл стерильные пробирки с коническим дном: одну трубку с надписью "Hoechst" и один с надписью "Hoechst и Верапамил". Приготовьте 10 мл 5 мМ раствора гидрохлорида верапамила в стерильной воде. Подготовка культуральной среды (CM) для стволовых клеток.
- яsolation из боковых населения Без учета Hoechst красителя с помощью сортировки клеток.
- Выполните Hoechst отрицательное разделение клеток на проточной цитометрии сортировщика со следующими параметрами: УФ-лазера (355 нм), 2 детекторов на УФ-лазера пути с голубым Hoechst (450/50 ВР) и красной Hoechst (610/20 BP) фильтры и 2 коллектора.
- Во-первых, анализ образца "Hoechst", который служит в качестве положительного контроля для окрашивания и проточного цитометра настройки.
- Использование цитометра программного обеспечения, в окне "Глобальный рабочий лист", нажмите на "Dot земля" (пятый правый верхний рисунок) и создать диаграмму на глобальном листе. По оси ординат, с правой кнопкой мыши, выберите FSC-A (вперед разброс) и по оси абсцисс, SSC-A (боковой разброс) (Рис . 1А) Таким же образом, создать SSC-W по сравнению с точечным участке SCC-H. На втором участке точка, чтобы создать область P1, нажмите на кнопку "Polygon ворота" (четырнадцатый правый верхний рисунок) (рисунок 1В) 33.
Примечание: P1 регионохватывают отдельные клетки и дискриминировать дублеты. - Дополнительно: Исключить PI-положительных клеток путем создания FSC-A в сравнении с PI коттеджный на P1. На этой точке участка, выберите PI отрицательное население (P2), чтобы исключить PI положительные мертвые клетки.
- Использование цитометра программного обеспечения, в окне "Глобальный рабочий лист", нажмите на "Dot земля" и создать диаграмму на глобальном листе. По оси ординат, с правой кнопкой мыши, выберите синий Hoechst-А и по оси абсцисс, красный Hoechst-A. С помощью правой кнопки мыши на население, выберите "Показывать населения" и P1. На этой точке сюжет, создать область (P2) для выбора отрицательной Hoechst стороне красителя населения (SP) клеток , которые появляются в виде бокового рычага слева от основной популяции клеток (рис 1C).
- Анализировать образец "Hoechst" и собрать 10000 событий. Для того, чтобы убедиться, что ворота P2, которая представляет население SP, хорошо позиционируется, анализировать образец "Hoechst и Верапамил" (10000 событий)наблюдать исчезновение SP населения (рис 1D).
- Соберите SP Hoechst красителя отрицательных клеток в 15 мл пробирку, содержащую 1 мл CM-CSC, приготовленные в 1.1.1.1.
- В конце сортировки клеток, центрифугируют суспензию клеток при 250 мкг в течение 5 мин, удалить супернатант и ресуспендируют осадок с 1 мл CM-CSC. Подсчитайте число отсортированных клеток с использованием счетчика клеток и передают соответствующее количество клеток в культуральной колбе (таблица 1). Добавить CM-CSC и инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2 атмосферы.
- Поддержание клеток в культуре при тех же самых условиях в течение максимум 2 пассажей до тех пор , пока не будет не менее 5 х 10 7 клеток (этап 3, "метод культуры клеток").
- Выполните Hoechst отрицательное разделение клеток на проточной цитометрии сортировщика со следующими параметрами: УФ-лазера (355 нм), 2 детекторов на УФ-лазера пути с голубым Hoechst (450/50 ВР) и красной Hoechst (610/20 BP) фильтры и 2 коллектора.
2. Выбор высокого / ALDH высокого субпопуляция CD44 в Сиде населения Сортировка
- Окрашивание 50 миллионов клеток SP с Detection Kit и C ALDHD44 антител.
- Подготовьте всемеро 15 мл стерильные пробирки, маркированные следующим образом: "Безупречный" (Tube а), "CD44-APC" (Tube б), "IgG1-APC" (Tube с), "ALDH" (Tube d), "ALDH и DEAB "(Tube е)," ALDH и CD44-APC "(Tube е)," ALDH, DEAB и CD44-APC "(Tube г). Держите все пробирки и реагенты при 4 ° С в течение окрашивания.
- Подготовка буфера А с 4,5 мл буфера 1 (входит в комплект) и 45 мкл CD44-Арс (аллофикоцианин) антителом (разведение 1: 100). Подготовка буфера В с 100 мкл буфера 1 и 1 мкл IgG1-APC антител (разведение 1: 100). Готовят буфера С 4 мл буфера 1 и 20 мкл реагента набора.
- Приготовить клеточную суспензию из предварительно отсортированных клеток (этап 1.2.5) в количестве 10 7 клеток / мл. Добавляют 100 мкл (10 6 клеток) клеточной суспензии в пробирки , а, б и в, и 4 мл (4 х 10 7 клеток) к трубке ф. На данный момент не ставят клетки в пробирки D, Е и г.
- Центрифуга пробирки, содержащие клетки при 250 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют гранул в трубах а, Ь и с в 100 мкл буфера 1. Добавьте 5 мкл diethylaminobenzaldehyde (DEAB), ингибитор ALDH к трубкам е и г.
- Ресуспендируют клеток в трубке F с 4 мл реагента С и немедленно передать 100 мкл в пробирки д, е и г. Инкубируйте все пробирки в водяную баню при температуре 37 ° С в течение 30 мин и защиты от прямого воздействия света с помощью алюминиевой фольги. Смешайте суспензии клеток осторожно встряхивая через 15 мин, чтобы предотвратить клетки от оседания.
- С этого момента, держите пробирки на льду и защищенном от прямого воздействия света с помощью алюминиевой фольги. Центрифуга все пробирки при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° C и удалить супернатант.
- Ресуспендируют труба F в 4 мл и трубки б и г с 100 мкл буфера А. Ресуспендируют трубки C с 100 мкл буфера B. Для других трубок, добавьте 100 мкл буфера 1. Инкубировать 10 мин при 4 °; С.
- Центрифуга все пробирки при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° C и удалить супернатант. Полоскание один раз с 1 мл буфера 1 (4 мл для трубки F) и снова центрифуге при 250 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант. Ресуспендируйте труба ф гранулу в 4 мл и все другие пробирки в 1 мл буфера 1.
- Передача решений образца через клеточные мкм стяжек 70 для удаления агрегатов и собирать отдельные клетки в соответствующие пробирки для поглощения образца на проточном цитометре.
- Выделение CD44 высокой / ALDH высокой клеточной популяции с помощью флуоресцентной Активированный сортировки клеток.
- Выполните CD44 высокой / ALDH высокой сортировки клеток на проточной цитометрии сортировщика со следующими параметрами: Голубой лазер (488 нм) и красный лазер (633 нм), 1 детектор на синем лазерном пути с FITC фильтром (530/30), 1 детектор на красный лазерный путь с APC фильтром (660/20) и 2 коллекторов.
- Использование цитометра программного обеспечения, нажмите на "Dot Плот "(пятый справа вверху на фото), чтобы создать FSC-A в сравнении с SSC-точечным участке, как описано в разделе 1.2.1.2, для проверки морфологии клеток и выбрать популяцию, состоящую из отдельных клеток с SSC-W по сравнению с SSC-H точечный участок.
- Использование цитометра программного обеспечения, в окне "Глобальный рабочий лист", нажмите на "Dot земля" и создать диаграмму на глобальном листе. По оси ординат, с правой кнопкой мыши, выберите APC-A, а также на абсциссе, FITC-A, чтобы выбрать двойной окрашенную населения. Создайте ворота с помощью трубки d и е , чтобы выбрать ALDH высокие клетки (рис 2А). Примечание: Положительные клетки исчезают в трубе е обрабатывают DEAB (рис 2В).
- На том же графике, создать вторые ворота с помощью трубки б и в для того , чтобы выбрать CD44 высокие клетки (рис 2С и 2D). Положительные клетки исчезают в трубке, содержащей IgG1-APC. Анализировать трубы и е г и создать третьи ворота , который включает CD44 высокий / ALDH <SUP> высокие клетки (рис 2E и 2F).
Примечание: Если положительные клетки присутствуют в трубке , содержащей IgG1-Арс (рис 2D), взаимодействие между клетками и АРС-окрашенного антитела не является специфическим.
- На том же графике, создать вторые ворота с помощью трубки б и в для того , чтобы выбрать CD44 высокие клетки (рис 2С и 2D). Положительные клетки исчезают в трубке, содержащей IgG1-APC. Анализировать трубы и е г и создать третьи ворота , который включает CD44 высокий / ALDH <SUP> высокие клетки (рис 2E и 2F).
- Сбор CD44 высоко / ALDH высоких клеток в 15 мл пробирку , содержащую 1 мл CM-CSC. Сбор также CD44 низкий / ALDH низко в 15 мл пробирку , содержащую 1 мл CM 19. Примечание: Подготовка CM-CSC, как описано в шаге 1.1.1.1.
- Центрифуга клеточной суспензии при 250 х г в течение 5 мин, удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл CM-CSC. Подсчитайте количество отсортированных клеток.
3. Сотовый метод Культура
- После двойного сортировки клеток , как описано выше, пластинчатые отсортированных клеток в соответствующей культуральной колбе (таблица 1) с СМ-CSC при температуре 37 ° С с 5% CO 2. Через 18-24 ч,проверить, если клетки придерживались и изменения культуральной среды. Изменение культуральной среды через каждые 3 дня, пока расширяющиеся колонии не больше, чем 50% сплошности.
- Используйте соответствующий объем трипсина 0,5 г / л - ЭДТА (таблица 1) в Trypsinize клеток из колбы культуры. Инкубируйте клетки от 3 до 5 мин при 37 ° С. Добавьте соответствующий объем СМ-CSC (таблица 1) , чтобы остановить действие трипсина.
- Подсчитайте количество клеток , полученных и пластины 4 × 10 5 клеток в 175 см ² культуральной колбе с СМ-CSC. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. При этой концентрации клеток с увеличением вдвое 24 ч будет составлять 70% сливающийся в течение 7 дней.
- Используйте CSCs для в пробирке или в естественных условиях экспериментов , прежде чем они подверглись 3 места.
4. Подтверждение потенциал опухоли и ЦОК характеристики
- Опухоль Sphere Формирование , чтобы подтвердить потенциал опухоли CD44 высокой / ALDHвысокие клетки.
- Trypsinize клетки, как описано в разделе 3.2. Добавляют 1 × 10 6 клеток в 15 мл пробирку и центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок в среде DMEM: F12 (3: 1) среда FCS, свободный, 20 нг / мл rhEGF, 4 мг / л гепарина и 1x В27. Инкубируйте клетки в анкерные пластины культуральный флакон 6 хорошо низкой при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
Примечание: Используйте DMEM: F12 (3: 1), содержащей 5% FCS, 20 нг / мл rhEGF, 4 мг / л гепарина и 1x B27, если клетка не растут без FCS. - Наблюдать образование сферы опухоли с помощью оптического микроскопа с 4 -х до 10 дней после посева (фиг.3А).
Примечание: Опухоль диаметр сферы должна быть более 35 мкм. CD44 высокие / ALDH высокие клетки будут показывать более быстрый и более расширенной опухоли формирование сферы с точки зрения количества и размера по сравнению с CD44 с низким / ALDH минимума.
- Trypsinize клетки, как описано в разделе 3.2. Добавляют 1 × 10 6 клеток в 15 мл пробирку и центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок в среде DMEM: F12 (3: 1) среда FCS, свободный, 20 нг / мл rhEGF, 4 мг / л гепарина и 1x В27. Инкубируйте клетки в анкерные пластины культуральный флакон 6 хорошо низкой при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Оценка in vivo на туморогенности ПослеПодкожная инъекция CD44 высокой / ALDH высоких клеток в NOD-SCID мышей.
- После сортировки, повторно приостанавливать клетки в PBS при трех различных концентрациях (10 4 клеток / мл, 10 5 клеток / мл, и 10 6 клеток / мл). Вводят подкожно 100 мкл 10 4 клеток / мл (10 3 клеток) в правой боковой поверхности области 6 мышей. Сделайте то же самое в течение 10 5 клеток / мл (10 4 клеток) и 10 6 клеток / мл (10 5 клеток).
Примечание: Нижняя разбавление , чем 10 3 клеток могут быть испытаны. - Внедрить такую же концентрацию CD44 низких / ALDH низких клеток в области левого фланга. Монитор вводили мышам в течение 10 недель , чтобы увидеть прогрессии опухоли 19.
- После сортировки, повторно приостанавливать клетки в PBS при трех различных концентрациях (10 4 клеток / мл, 10 5 клеток / мл, и 10 6 клеток / мл). Вводят подкожно 100 мкл 10 4 клеток / мл (10 3 клеток) в правой боковой поверхности области 6 мышей. Сделайте то же самое в течение 10 5 клеток / мл (10 4 клеток) и 10 6 клеток / мл (10 5 клеток).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляция ОКК от линий ПРГШ клеток необходимы два последовательных сортировкой из-за очень низкий процент ЦОК в родительской линии клеток. Первая сортировка была основана на способности ЦОНов исключить Hoechst краситель из-за эффлюксных препарат транспортеров. Это привело к приобретению 1-5% от общей популяции клеток отсортированный (Рисунок 1). Во время сортировки отрицательной клетки Hoechst красителя, проверьте размер и гранулирование отсортированных клеток, глядя на FSC-A по сравнению с SSC-A участка точка (рис 1А). Затем, дискриминировать дублеты и клетки фрагментов с помощью SSC-W по сравнению точка участка SSC-H и выбора P1 населения (рис 1B). На этой P1 населения, создать Hoechst Red-A против Hoechst Blue-точечным сюжет. С помощью трубки с надписью "Хехст", СП выступает в качестве бокового плеча слева от основной популяции клеток (рис 1C). Это население должно исчезнуть, когда они аре обрабатывали Верапамил (рис 1D), ингибитор ABC транспортеров. PI окрашивания позволяет исключить из PI-положительных мертвых клеток , поскольку эта популяция находится под шкалой на Hoechst Red-A масштабе (рис 1C и 1D, синие эллипсов).
Второй сортировки клеток была основана на высокой экспрессии ферментативной активности CD44 рецепторов и высокой ALDH , что позволило приобретение 0,5-2% по сравнению с SP клеток , ранее отсортированных (рисунок 2). Перед сортировкой, были использованы различные средства управления. Первые из них являются "ALDH" и пробирки "ALDH + DEAB" , необходимые для того , чтобы разместить первые ворота на FITC высоких клеток (рис 2А и 2В): ALDH высокие клетки закрытого типа на FITC-А по сравнению с APC-A точка участок с использованием "ALDH" трубки (рисунок 2А). Хорошая позиция ворот была проверена с помощью "ALDН + DEAB "труба:.. , Как DEAB ингибирует ALDH, позитивные клетки должны исчезнуть из ворот (Фигура 2В) Если этого не произойдет , изменения условий реакции ( за счет увеличения количества DEAB, например) второго элемента управления является" CD44-APC "и" "трубки IgG1-APC , которые позволили позиционировать вторые ворота на APC высоких клеток (рис 2C и 2D) с использованием клеток , окрашенных с CD44-APC антитела (Рисунок 2C). Это население должно исчезнуть с контрольную пробирку , которая содержала клетки IgG1-APC (рис 2D). Если этого не произойдет , то связь с антителом не является специфическим и БСА 0,5% должен быть добавлен в буфер 1 из набора обнаружения ALDH во время реакции антител. и, наконец, третий контроль касается "ALDH и CD44-APC" трубки и "ALDH, DEAB и CD44-APC" трубки (рис 2E, 2F, 2G и 2H). двойной STAоцен- ками ALDH / CD44 трубка используется для позиционирования последние ворота на двойных положительных клеток (рис 2E) и той же трубы , обработанной DEAB является контроль , чтобы убедиться , что ALDH высокие клетки исчезают (рис 2F).
Этот протокол используется для сортировки CSCs из SQ20B и линий Фаду клеток. Когда сортировка производится в первый раз на новой клеточной линии, для того, чтобы гарантировать, что сортированные клетки имеют стволовых как клетки свойствами, необходимо, чтобы подтвердить свой потенциал опухоли. Один из собственности стволовых клеток , как это его способность образовывать tumorspheres в пробирке в FSC свободной среде. При выполнении этого условия, только рак стволовых клеток , как могут выживать и размножаться (фиг.3А). Кроме того, эксперименты КПЦР показывают высокую экспрессию бета-катенина (маркер стволовой как характеристика) в CD44 высокий / высокий клеток ALDH (фигура 3В), а также 1-Bmi и Паз 19 </ SUP>. И, наконец, CD44 высокие клетки высокого / ALDH также способны образовывать опухоли при введении в небольших количествах по сравнению с CD44 низким / ALDH низких клеток 19.
Рисунок 1: Выделение побочного населения , за исключением красителя Hoechst (A) FSC-A по сравнению с SSC-точечным участке.. (B) , SSC-W по сравнению с точечным участком SSC-H. (C, D) Hoechst Red-A по сравнению с Hoechst Blue-Точка участок с помощью "Hoechst" трубку (С) или с "Hoechst и Верапамил" трубки (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Так rting из CD44 высоких / ALDH высоких клеток из Hoechst красителя отрицательных клеток. FITC-A по сравнению с APC-А сюжет точка с использованием "ALDH" трубку (А), "ALDH + DEAB" трубка (В), "CD44-APC" трубка (С), "IgG1-АРС" трубка (D), то "ALDH и CD44-АРС" трубка (Е и G) , или "ALDH, DEAB и CD44-АРС" трубка (F и Н). Цифры А, В, С, D, Е и F были получены с использованием клеточной линии SQ20B. Рисунки G и H, полученный с использованием клеточной линии Фаду. Зеленый цвет указывает на CD44 низкий / ALDH низкие клетки (Q3); темно - синий показывает CD44 низкий / ALDH высокие клетки (Q1); фиолетовый указывает CD44 высокой / низкой ALDH клетки (Q4); светло - голубой показывает CD44 высокий / ALDH высокие клетки (Q2)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Подтверждение опухоли потенциала CD44 высоких / ALDH высоких клеток CD44 Рассортировано высоких / ALDH высоких клеток были способны образовывать tumorspheres в пробирке (А) в средствах массовой бедных FCS. Шкала бар, 25 мкм. Кроме того, CD44 высокий / ALDH высокой гиперэкспрессией β-катенин, маркер туморогенности (B). Это количественное определение было выполнено с помощью кПЦР и Столбики ошибок обозначают SD. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Количество ячеекотсортированный | Культура Тип колбы | Трипсин Объем (мл) | Культуральная среда Объем (мл) |
| 10000-200000 | 1 лунку 6-луночного планшета или см чашку Петри 3.5 | 0,5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | 1 T25 культуры колбу | 1 | 4 |
| > 1000000 | 1 T75 культуры колбу | 2 | 10 |
Таблица 1: Культура колбу использовать в соответствии с количеством клеток , отсортированных детали размера культуральный флакон для приблизительного количества клеток , отсортированных приведены.. Также предоставляется Объем трипсина и объема среды, необходимых для типа культуральный флакон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает надежный метод успешного выделения ЦОК от конкретной клеточной линии, которая применима к другим линиям ПРГШ клеток. Изолированные ОКК головы и шеи затем пригодны для дальнейшей молекулярной характеристики в пробирке и функциональной проверки путем трансплантации в иммунодефицитных мышей 19. Тем не менее, некоторые модификации могут быть проверены в зависимости от популяции стороне или CD44 высокий / ALDH высокий процент присутствующих в исходной клеточной линии. Например, если процент клеток в боковой популяции слишком низка в определенной клеточной линии, CD44 высокий / ALDH высокая сортировка может быть выполнена непосредственно. Маркеры , используемые в данном исследовании , могут быть заменены другими маркерами , соответствующими клеточной линии изучали такие как CD133 высокой 34 или CD10 с высоким 35.
Этот протокол основан на двух клеточных сортировок. Три цвета сортировки с SP + CD44 + ALDH не possiblе с протестированной клеточной линии. Во- первых, клеточные линии родительские испытания здесь присутствует менее 5% от SP и менее чем на 10% CD44 высокий / ALDH высокие ячейки в SP. Поэтому, SP / CD44 высокой / ALDH высокой составляют менее 0,5% от родительской линии клеток. Следовательно, первая сортировка SP необходима для того , чтобы обогатить население в CD44 высоких и / или ALDH высокие клетки. Во-вторых, для сортировки 1% от исходной клеточной линии, занимает 5 часов, чтобы получить около 300 000 клеток. Поэтому, если сортировочную 3 цвета клеток предпринимается, количество клеток, собранных будет очень низким. Кроме того, больше сортировка не рекомендуется, поскольку это может повлиять на жизнеспособность клеток.
Благодаря селективности этого протокола изоляции, основным ограничением является небольшое количество ЦОК полученных. Это может быть проблематичным для проведения дальнейших экспериментов, так как не рекомендуется использовать их после того, как 3-х пассажей, из-за быстрой потери CD44 и AЛДГ маркеры. Кроме того, перед каждым новым экспериментом, процент CD44 высокой / ALDH высоких клеток все еще присутствующих в клеточной суспензии должны быть проверены, чтобы проверить количество ЦОК , который дифференцированными.
Крайне важно, чтобы приготовить раствор гидрохлорида верапамила и культуральной среды, содержащей EGF непосредственно перед использованием, как эти молекулы очень нестабильны. Исходный раствор EGF при 20 мг / л, стабилен в течение трех месяцев при температуре -20 ° C. Вариации протокола Hoechst существуют, но конечная концентрация красителя обычно используется 5 мкг / мл. Кроме того, во время первой сортировки, различные композиции питательные среды должны быть испытаны в соответствии с используемой клеточной линии. После того, как условия сортировки подтверждены, необходимо проверить свойства популяции отсортированных клеток с использованием различных методов (раздел 4).
клеточной поверхности маркеры, ALDH активность и способность к оттоку витальных красителей уже используются индивидамиLLY в литературе, чтобы изолировать CSCs от ПРГШ. Тем не менее, протокол, описанный здесь, имеет уникальное преимущество использования комбинации различных маркеров для того, чтобы достичь высокой специфичности в ОКК изоляции от ПРГШ клеточных линий. Кроме того, CD44 сортировкой может быть реализован с помощью антитела анти-CD44 , конъюгированных с магнитными микро бусинок и сортировали с магнитной колонке 36, но этот метод применим лишь к маркеров клеточной поверхности и не может быть использован для сортировки ALDH, предотвращая двойной сортировкой , Другой способ , используемый для получения CSCs является tumorsphere культуры от первичных опухолей 37 или ксенотрансплантатов 38. Тем не менее, приобретение этих первичных опухолей или ксенографтов связаны с этическими ограничениями.
Так как этот метод изолирует жизнеспособные ПРГШ CSCs, они могут быть использованы (после проверки их онкогенность) в ряде экспериментов, которые измеряют физиологические функции этих клеток. Поэтому она позволяет оценить поведениеЦОНов следующие различные терапевтические подходы (лучевая терапия, химиотерапия). Он также позволяет проводить исследования различных биологических параметров , таких как миграция / инвазия, репарации ДНК, клеточной сигнализации и др. Следовательно, получение CSCs из различных клеточных линий является привлекательным выбором для изучения ОКК свойств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
