Abstract
baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) ilerleme anlayışı ilerlemelere rağmen, beş yıllık sağkalım oranı nedeniyle lokal nüks ve uzak metastaz düşük kalmaktadır. bu nüksetme açıklamak için bir hipotez içsel kemo ve radyo direnci mevcut kanser kök-benzeri hücreler (rulmanları) varlığıdır. Yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için, hedeflenen tedavi etkinliğini doğrulamak deney modelleri vardır ve bu nedenle CSCS tanımlanması ve izole edilmesi için güvenilir bir yöntem olması gereklidir. Bu amaçla, flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması tarafından gerçekleştirilen iki ardışık hücre sortings (FACS) birleştirilmesine dayanır, insan HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyonu için bir protokol mevcut. İlki, diğerleri arasında, dışlamak böylece Kaset (ABC) taşıyıcı proteinler ATP-bağlama ve aşın için CSCS özelliğine dayanmaktadır gibi Hoechst 33342. hücreleri gibi hayati DNA boyalar th ile sıralanıryöntem, bir "yan nüfus" (SP) olarak tanımlanır edilir. SP hücreleri düşük bir yüzde ebeveyn hücrelerinin (<% 5) 'i temsil olarak, giderek artan bir fazı ikinci hücre sıralama önce sayısını arttırmak için gereklidir. Bir sonraki adım, iki HNSCC kök hücre özellikleri hücresi yüzey markerine CD44 (yüksek CD44) ve aldehit dehidrojenaz aşırı ifadesi (ALDH yüksek) yüksek ekspresyon seviyesi, yani sahip hücrelerin seçilmesine izin verir. Tek bir belirteç kullanımı CSCS, SP kombinasyonu izolasyonu için çok sayıda sınırlamalar ve tuzaklar olduğundan, CD44 ve ALDH belirteçleri canlı hücreleri gerektiren başka analitik ve fonksiyonel testleri için CSCS izole etmek için yararlı bir araç sağlayacaktır. CSCS sap benzeri özellikleri son tumorispheres oluşumu ve β-katenin sentezlenmesi ile in vitro koşullarında doğrulanmıştır.
Introduction
Baş ve boyun yassı hücreli karsinom (HNSCC), tüm dünyada sık görülen ve mevcut tedavilerde kaydedilen ilerlemelere rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların prognozu kötüdür. Hastanın genel 5 yıllık sağ kalım oranı cerrahi, kemo-radyoterapi ve hedeflenen-terapiler dahil terapötik yaklaşımların kombinasyonu rağmen% 30 civarında olduğunu. Son çalışmalar antikanser tedaviler 1 Aşağıdaki kanser kök benzeri hücrelerin hayatta kalma (rulmanları) için lokal nüks ve uzak metastaz bağlıyor. Göğüs, beyin, prostat, akciğer, kolon, pankreas, karaciğer ve deri 2- dahil olmak üzere çeşitli katı tümörlerin kök hücrelerin özelliklerini (farklılaşmamış durum, kendini yenileme ve farklılaşma kapasitelerinin ve telomeraz aktivitesi) sunan hücrelerin varlığını destekleyen artan kanıtlar vardır 10. Ancak, CSCS kökeni 11,12 belirsizliğini koruyor. Normal kök hücreleri 3,13 veya dedifferen malign transformasyonu kaynaklanabilirCSCS benzeri özellikler 14,15 kazanmak tümör hücrelerinin sokan. Bu nedenle, CSCS ilişkin belirgin yollarının anlaşılmasında erken tanı ve dirençli HNSCC tedavisi konusunda bilgi verilecektir.
CSCS ayrıca tümör hücrelerinin 16-19 toplu karşılaştırıldığında tümör nüks sonuçlanan standart kemoterapi ve radyoterapi kaçmasına dirençli fenotipleri, sahip ve 20 nişler hipoksik içine lokalize olduğu öne sürülmüştür. Sayısız faktör gibi sessizliğini eğilimi olarak CSCS bu dirençleri, gelişmiş DNA onarım, up-regüle hücre döngüsü kontrol mekanizmaları ve serbest radikal süpürücü 21 açıklamak için öne sürülmüştür. Dahası, çeşitli onkojenik moleküler yollar özellikle CSCS 17 aktive edilebilir. daha hedefli tedaviler için CSCS bilgi geliştirmek için, kök hücre ile ilgili markörlerin heterojen bağlı, tanımlama ve CSCS izolasyonu için güvenilir yöntemler mikanser 22 çeşitli.
HNSCC olarak, kök benzeri tümör başlatan hücreleri, ilaç dışarı atım taşıyıcıları ifade 23, CD44 yüksek, CD24 düşük CD133 yüksek, c-Met + 10,24 fenotipe gibi farklı CSC biyobelirteçlerini (ifade hücreleri sıralayarak primer hasta tümörlerinden izole edilmiştir, 25 ya da ALDH yüksek aktiviteli 26) ya da CSC özelliklere sahip squamospheres oluşturmak için birincil hasta tümörü yetiştirilmesi. Bununla birlikte, squamospheres sayısı, böylece daha fazla karakterizasyon için küçük bir örneklem büyüklüğü 27 çalışmaları vererek, iki pasaj sonra dramatik azalır. Bu nedenle, in vitro deneyler, köklü hücre hatları başlayarak CSCS bilgisini geliştirmek için deney tasarımı için daha kolay bir çözümdür.
Bu makalenin amacı, multiparametrik akım sitometri analizi a kullanarak HNSCC hücre hatları CSCS izole etmek için bir yöntem önermektirnd hücre sıralama. ALDH aktivitesinin dahil olmak üzere birçok CSCS özellikleri ile ilişki içinde CD44 ekspresyonu, yan Nüfus (SP) fenotipi sferoid oluşturma yeteneğine ve tümör gelişimini izole edilmesi ve CSCS bu alt-nüfusu karakterize etmek için kullanılır. CD44, bir hücre yüzeyi glikoproteini, hücre yapışması ve göçü katılır. CD44 yüksek kafa ve boyun kanseri modelleri 29-31 de dahil olmak üzere, CSCS 28 bir çok katı tümörlerin olarak ifade edilir. Ayrıca, CD44 yüksek hücreler 10 olamaz in vivo CD44 düşük hücrelerin ise heterojen bir tümör oluşturabilir. SP deney CSC zarı içinde aşırı taşıyıcı proteinlerin ATP-bağlayıcı kaset (ABC) ailesi ile Hoechst boya 22 akıttığı hücre ayırıcı potansiyeli dayanır. Bu deney, bu kontrol numunelerinde verapamil ABC transportör inhibitörlerinin kullanılmasını içerir. Aldehit dehidrogenaz (ALDH) ret için retinol dönüştürme görev yapan hücre içi enzimerken kök hücre farklılaşması 25,26 sırasında inoic asit elde edildi. Yüksek ALDH aktivite göstermek HNSCC 26 kök benzeri hücre davranışını ve ALDH yüksek hücrelerin çok az sayıda sergileyen hücreler in vivo 26,32 tümör oluşturmak edebiliyoruz.
Bu belirteçlerin ve özellikleri kombinasyonu başarıyla Bertrand e t arkadaşları tarafından kullanılmıştır. Vitro ve foton bu CSCS in vivo ve karbon iyon radyasyonu 19 direncini incelemek için. Bu sonuçlar açık bir şekilde, çeşitli hücre belirteçleri ve özellikleri kombinasyonu tek markör yaklaşımlara göre HNSCC CSCS popülasyonları hakkında yararlı çalışmalar için daha seçici olduğu gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Butun hayvan prosedürleri, Hayvan Bakım yerel kurallarına göre gerçekleştirildi. Bu çalışmanın tüm detayları CECCAPP, bir Fransız etik komite tarafından kabul edildi.
Hoechst Boya akış Tahlili tarafından bir yan Nüfus (SP) 1. Seçim
- Hoechst 33.342 boya ile 50 milyon hücrelerin boyanması.
- bir "Hoechst" etiketli tüp ve "Hoechst ve Verapamil" etiketli bir: İki 15 ml konik dipli steril tüpler hazırlayın. Steril su içinde 5 mM verapamil hidroklorür çözeltisi 10 ml hazırlayın. Kök hücreleri için kültür ortamı (CM) hazırlayın.
- Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM): F12 (1: 3, hacim: hacim) hidrokortizon, fetal buzağı serumu (% 5 FCS), 0.04 mg / L, CSC (CM-CSC) CM hazırlanması için, aşağıdakileri birleştirerek penisilin, 100 U / ml, 0.1 g / streptomisin L ve epidermal büyüme faktörü (EGFR) ve 20 ug / L'dir.
- Laminer akış kaputu altında, hücreler trypsinize. s ile yıkayın, Ortamı çıkarınterile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 75 cm² şişeye tripsin-EDTA, 1 ml (0,5 g / L) ilave edilir. 37 ° C'de 3 dakika kuluçkalayın. parental hücre çizgisi için kullanılan kültür ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Bir hücre sayacı kullanılarak hücrelerin sayısını.
- ana hücre hattı (CM-P) CM hazırlamak için% 10 FCS, 0.4 mg / hidrokortizon L, penisilin, 100 U / ml ve 0.1 g / streptomisin L) ile DMEM tamamlar.
- CM-P, 10 7 hücre / ml elde etmek üzere aşama 1.1.2 'de elde edilen hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Hazırlanan 2 tüplerde hücre süspansiyonu bölünmüş: tüp "Hoechst ve Verapamil" ve tüp "Hoechst" 4 ml (4 x 10 7 hücre) 100 ul (10 6 hücre) koydu.
- örnek "Hoechst Verapamil" olarak, 5 mM verapamil hidroklorür çözeltisi (nihai konsantrasyon: 0.5 mM) 10 ul ve hafifçe karıştırın. (0.1 g / L son konsantrasyon) 1 g / L Hoechst çözeltisi 5 ul ekle. Örnek & # içinde34; Hoechst ", 1 g 5 ul ekleyin / L Hoechst 10 6 hücre başına çözeltisi (200 ul toplam) Bundan sonra, alüminyum folyo kullanarak doğrudan ışığa maruz kalmaktan korunmuş örnekleri tutmak..
- 1 saat 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüm tüpler inkübe edin. yerleşme hücreleri önlemek için yavaşça her 15 dakikada karıştırın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj tüpleri. Süpernatantı ve 1x PBS 2 mL her pelletini.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj tüpleri. süpernatantı. PBS içinde seyreltilmiş yeniden süspanse "Hoechst Verapamil" 5 mg / L propidyum iyodür (PI) 500 ul tampon maddesiyle topak ve 5 mg / PBS tamponunda seyreltilmiş L PI 4 ml "Hoechst" pelet.
- akış sitometresinde örnek alımı için tüplerde tek hücre agrega kaldırmak ve toplamak için 70 mikron hücre süzgecinden örnek çözümleri aktarın. buz üzerinde örnekleri tutmak ve alüminyum folyo kullanılarak doğrudan ışığa maruz kalmaktan korur.
- bir "Hoechst" etiketli tüp ve "Hoechst ve Verapamil" etiketli bir: İki 15 ml konik dipli steril tüpler hazırlayın. Steril su içinde 5 mM verapamil hidroklorür çözeltisi 10 ml hazırlayın. Kök hücreleri için kültür ortamı (CM) hazırlayın.
- benHücre sıralayarak Hoechst boyası hariç Yan Nüfus solation.
- Bir aşağıdaki parametrelerle sıralayıcı flow sitometri üzerinde Hoechst negatif hücre ayrımı gerçekleştirin: UV lazer (355 nm), mavi Hoechst (BP 450/50) ve kırmızı Hoechst filtreleri (BP 610/20) UV lazer yolda 2 dedektörleri ve 2 toplayıcıları.
- Birincisi, boyama ve sitometresi set-up akış için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir örnek "Hoechst" analiz.
- "Nokta Plot" tıklayın "Küresel Çalışma" penceresinde, sitometresinin yazılımı kullanarak (beşinci sağ resim üst) ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. Ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, FSC-A (ileri dağılım) ve apsis üzerinde, SSC-A (yan dağılım) (Şekil 1A) seçin. Aynı şekilde, SCC-lH nokta arsa karşısında SSC-W oluşturur. Bu ikinci nokta arsa üzerinde, bir P1 bölge oluşturmak için, "Poligon kapısı" (ondördüncü sağ resim üst) (Şekil 1B) 33 tıklatın.
Not: P1 bölge olacaktek hücre kapsayacak ve ikilileri ayrımcılık. - İsteğe bağlı: P1 kapılı PI karşı bir FSC-A oluşturarak PI pozitif hücreleri hariç. Bu nokta arsa üzerinde, PI pozitif ölü hücreleri hariç PI negatif nüfus (P2) seçin.
- "Küresel Çalışma" penceresinde, sitometresi yazılımı kullanarak, "Dot Plot" üzerine tıklayın ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, mavi Hoechst-A seçin ve apsis üzerinde, kırmızı Hoechst-A. nüfus bir sağ tıklama ile "Show nüfus" ve P1 seçin. Bu nokta arsa üzerinde, bir bölgeyi (P2) hücrelerin ana nüfus (Şekil 1C) sol yan kolu olarak görünen negatif Hoechst boya yan nüfus (SP) hücreleri seçmek için oluşturun.
- örnek "Hoechst" Analiz ve 10.000 olayları toplamak. SP nüfusunu temsil kapı P2, iyi konumlandırılmış emin olmak için, örnek analiz "Hoechst ve Verapamil" (10.000 olaylar)SP nüfus (Şekil 1D) ortadan kaybolması gözlemlemek.
- 1.1.1.1 hazırlanan CM-CSC 1 ml içeren 15 ml'lik bir tüp içinde SP Hoechst boya negatif hücreler toplanır.
- hücre sıralama sonunda, santrifüj, 5 dakika boyunca 250 x g'de hücre süspansiyonu, süpernatant kaldırmak ve CM-CSC 1 ml pelletini. Bir hücre sayacı kullanılarak sıralanır hücrelerinin sayısını ve bir kültür şişesine hücrelerin uygun sayıda transferi (bakınız Tablo 1). CM-CSC ekleyin ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 atmosferde inkübe edin.
- 5 x 10 7 hücre (aşama 3, "hücre kültürü yöntemi" bölümüne bakınız) en az kalana kadar 2 geçitlerin en fazla aynı koşullar altında kültür içinde hücreleri korumak.
- Bir aşağıdaki parametrelerle sıralayıcı flow sitometri üzerinde Hoechst negatif hücre ayrımı gerçekleştirin: UV lazer (355 nm), mavi Hoechst (BP 450/50) ve kırmızı Hoechst filtreleri (BP 610/20) UV lazer yolda 2 dedektörleri ve 2 toplayıcıları.
Yan Nüfus'e CD44 yüksek / ALDH yüksek Alt nüfusun 2. Seçim
- ALDH Algılama Kit ve C SP Hücreleri 50 milyon boyanmaD44 antikor.
- "Boyanmamış" (Tüp a) "CD44-APC" (Tüp b) "IgG1-APC" (Tüp c) "ALDH" (Tüp d) "ALDH ve DEAB aşağıdaki gibidir: yedi 15 ml işaretlenmiş steril tüpler hazırlayın "(Tüp e)" ALDH ve CD44-APC "(Tüp f)" ALDH, DEAB ve CD44-APC "(Tüp g). boyama esnasında 4 ° C'de tüm tüpler ve reaktifleri tutun.
- 4,5 (kitte bulunan) tampon 1 ml ve CD44-APC (alofikosiyanin) antikoru (: 100 seyreltme 1) 45 ul tampon A hazırlayın. tampon 1 100 ul ve IgG1-APC antikor 1 ul (: 100 seyreltme 1) ile tampon B hazırlayın. tampon 1 4 ml kiti reaktif 20 ul tampon C hazırlayın.
- 10 7 hücre / ml, daha önce sıralanmış hücreleri (aşama 1.2.5) 'in bir hücre süspansiyonu hazırlanır. A, B ve C, ve tüp f 4 ml (4 x 10 7 hücre) tüplere hücre süspansiyonu 100 uL (10 6 hücre) ekleyin. Şu an için tüpler d, e ve g hücreleri koymayın.
- 5 dakika boyunca 250 x g'de hücreleri içeren tüpler santrifüjleyin. dietilaminobenzaldehit 5 ul (DEAB), borular e ve g bir ALDH inhibitörü ekleme Süpernatantı ve tüpler, a, b ve tamponun 1. 100 ul Cı pelet tekrar süspansiyon.
- 4 ml reaktif C ve hemen f tüp içinde süspanse edin hücreleri tüpler d e ve g içine 100 ul aktarın. 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüm tüpler inkübe ve alüminyum folyo ile doğrudan ışığa maruz kalmaktan korur. çökeltme hücreleri önlemek için 15 dakika sonra vorteks ile yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın.
- Bu andan itibaren, buz üzerinde tüpler tutmak ve alüminyum folyo kullanılarak doğrudan ışığa maruz korunmaktadır. Santrifüj Tüm 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de tüpler ve supernatant çıkarın.
- 4 ml ve borular, tampon B, 100 ul tampon A süspanse boru C, 100 ul, b ve g tüpler yeniden süspanse tüpü F 1. inkübe 10 dakika 4 ° C'de tampon 100 ulC.
- Santrifüj Tüm 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de tüpler ve supernatant çıkarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g hızında tekrar 1 tamponu 1 ml (tüp f 4 mi) ve santrifüj ile bir kez yıkayın. süpernatantı. Yeniden askıya 4 ml tampon maddesi ile 1 ve 1 ml diğer borularda boru F pelet.
- akış sitometresinde örnek alımı için uygun tüplerde tek hücre agrega kaldırmak ve toplamak için 70 mikron hücre süzgeçler ile örnek çözümleri aktarın.
- Floresan CD44 yüksek / ALDH yüksek Hücre Nüfus İzolasyon Hücre Sıralama'yı Aktif.
- Gerçekleştirmek CD44 yüksek / ALDH bir aşağıdaki parametrelerle sıralayıcı flow sitometri üzerinde sıralama yüksek hücre: bir FITC filtresi (530/30), 1 ile mavi lazer yolda Mavi lazer (488 nm) ve kırmızı lazer (633 nm), 1 dedektör APC filtresi (660/20) ve 2 kolektörleri ile kırmızı lazer yolda dedektör.
- sitometresi yazılımı kullanarak, Dot Plo "üzerine tıklayınt "(beşinci sağ üst resim) bölümünde 1.2.1.2 açıklandığı gibi, SSC-A nokta arsa karşısında FSC-A oluşturmak için hücre morfolojisi kontrol ve SSC-H karşısında SSC-W ile tek hücrelerden oluşan bir popülasyon seçmek için nokta arsa.
- "Küresel Çalışma" penceresinde, sitometresi yazılımı kullanarak, "Dot Plot" üzerine tıklayın ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, çift lekeli nüfusu seçmek için APC-A ve apsis, FITC-A seçin. ALDH yüksek hücreleri (Şekil 2A) seçmek için d ve e tüplerini kullanarak bir kapı oluşturun. Not: Pozitif hücreler DEAB (Şekil 2B) ile muamele boru e kaybolur.
- Aynı Grafikte, CD44 yüksek hücreler (Şekil 2C ve 2D) seçmek için tüpler b ve c kullanarak ikinci bir kapı oluşturun. Pozitif hücreler, IgG1-aPC ihtiva eden bir tüp içinde kaybolur. F ve g tüpleri analiz ve CD44 yüksek / ALDH <içeren üçüncü bir kapı oluşturmaksup> yüksek hücreleri (Şekil 2E ve 2F).
Not: pozitif hücreler, IgG1-APC (Şekil 2D) ihtiva eden bir tüp içinde mevcut ise, hücre ve APC lekeli antikor etkileşimi spesifik değildir.
- Aynı Grafikte, CD44 yüksek hücreler (Şekil 2C ve 2D) seçmek için tüpler b ve c kullanarak ikinci bir kapı oluşturun. Pozitif hücreler, IgG1-aPC ihtiva eden bir tüp içinde kaybolur. F ve g tüpleri analiz ve CD44 yüksek / ALDH <içeren üçüncü bir kapı oluşturmaksup> yüksek hücreleri (Şekil 2E ve 2F).
- CM-CSC 1 ml içeren 15 ml tüp içine CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreleri toplayın. CM 19 1 ml içeren 15 ml tüp içine düşük de CD44 düşük / ALDH toplayın. Not: Adım 1.1.1.1 tarif edildiği gibi CM-CSC hazırlayın.
- 5 dakika boyunca 250 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj süpernatant kaldırmak ve CM-CSC 1 ml pelletini. sıralanmış hücrelerin sayısını.
3. Hücre Kültürü Yöntemi
- Yukarıda tarif edildiği gibi hücre çift Ayırma işleminden sonra,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de CM-CSC uygun bir kültür şişesi (Tablo 1) ayrılmıştır hücreler plaka. 18-24 saat sonra,Hücreler yapıştırılır kontrol ve kültür ortamı değiştirin. genişleyen koloniler% 50 konfluent daha büyük olana kadar her 3 günde bir kültür ortamı değiştirin.
- Kültür şişesi hücreleri trypsinize EDTA (Tablo 1) - tripsin 0.5 g / L, uygun hacim kullanın. 37 ° C'de hücreler 3-5 dakika kuluçkalayın. Tripsin hareketi durdurmak için CM-CSC (Tablo 1) uygun hacim.
- Elde edilen hücreler ve plaka CM-CSC ile 175 cm² kültür şişelerinde 4 x 10 5 hücre sayısını. 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 CO2. Bu konsantrasyonda, 24 saatlik bir ikiye katlanma süresi olan hücreler 7 gün içinde% 70 konfluent olacaktır.
- Bunlar 3 pasajlar tabi önce in vitro veya in vivo deneylerde CSCS kullanın.
Tümör Potansiyeli ve CSC Özellikleri 4. Onay
- Tümör Küre Oluşumu CD44 yüksek / ALDH tümör Potansiyeli Onaylayüksek Hücreler.
- 3.2 de tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. 5 dakika boyunca 250 x g'de 15 ml'lik bir tüp ve santrifüj 1 x 10 6 hücre ekleyin. Süpernatantı ve bir DMEM pelet yeniden askıya: F12 (3: 1) rhEGF orta FCS bilgilerini, 20 ng / ml heparin ve 1 x B27 4 mg / l. 37 ° C'de 6, alçak ankraj plakaları kültür şişelerinde hücreleri inkübe ve% 5 CO2.
Not: DMEM: F12 (3: 1) FCS% 5, rhEGF 20 ng / ml, 4 mg / heparin L ve 1 x B27 hücre FCS içermeyen büyümez halinde içeren ortam. - (Şekil 3A) tohumlama sonra 4 ila 10 gün arasında bir optik mikroskop ile tümör küre oluşumunu gözlemlemek.
Not: Tümör küre çapı en fazla 35 mm olmalıdır. CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreler CD44 düşük / ALDH düşük oranla sayısı ve büyüklüğü bakımından daha hızlı ve daha gelişmiş tümör küre oluşumunu gösterecektir.
- 3.2 de tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. 5 dakika boyunca 250 x g'de 15 ml'lik bir tüp ve santrifüj 1 x 10 6 hücre ekleyin. Süpernatantı ve bir DMEM pelet yeniden askıya: F12 (3: 1) rhEGF orta FCS bilgilerini, 20 ng / ml heparin ve 1 x B27 4 mg / l. 37 ° C'de 6, alçak ankraj plakaları kültür şişelerinde hücreleri inkübe ve% 5 CO2.
- İn Vivo tümorijenisite Değerlendirilmesi sonraNOD-SCID Fare CD44 / yüksek ALDH yüksek hücrelerinin deri altına enjekte.
- Ayırma işleminden sonra, üç farklı konsantrasyonda (10 4 hücre / ml, 10 5 hücre / ml ve 10 6 hücre / ml) PBS içinde hücrelerin yeniden askıya. 6 farelerin sağ yan yüz bölgesi içinde deri altına 10 4 hücre / ml (10 3 hücre), 100 ul enjekte edilir. 10 5 hücre / ml (10 4 hücreleri) ve 10 6 hücre / ml (10 5 hücreleri) için de yapın.
Not: 10 3 hücreleri test edilebilir daha düşük seyreltme. - Sol yan bölgede CD44 düşük / ALDH düşük hücrelerin aynı konsantrasyonu enjekte edilir. Kadar 10 hafta boyunca Monitör enjekte edilen fareler tümör ilerlemesi 19 görmek için.
- Ayırma işleminden sonra, üç farklı konsantrasyonda (10 4 hücre / ml, 10 5 hücre / ml ve 10 6 hücre / ml) PBS içinde hücrelerin yeniden askıya. 6 farelerin sağ yan yüz bölgesi içinde deri altına 10 4 hücre / ml (10 3 hücre), 100 ul enjekte edilir. 10 5 hücre / ml (10 4 hücreleri) ve 10 6 hücre / ml (10 5 hücreleri) için de yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyonu ebeveyn hücre çizgisinde CSCS çok az bir kısmının birbirini takip eden iki sıralama gerekli. İlk ayırma ilaç akış taşıyıcılar nedeniyle Hoechst boya hariç tutmak için CSCS yeteneğine dayanmaktadır. Bu sıralama toplam hücre popülasyonunun (Şekil 1) 1-5% satın alınması ile sonuçlanmıştır. Hoechst boyası negatif hücre sıralama sırasında, SSC-A nokta arsa (Şekil 1A) karşı FSC-A bakarak boyutu ve sıralanmış hücrelerin granülasyon kontrol edin. Ardından, nüfus P1 (Şekil 1B) SSC-H nokta arsa karşı SSC-W kullanılarak seçerek çiftleri ve hücreler parçaları ayırt edebilir. Bu P1 nüfus, Hoechst Mavi-A nokta arsa karşısında Hoechst Kırmızı-A oluşturun. "Hoechst" etiketli tüp, SP ana hücreleri nüfus (Şekil 1C) sol tarafta bir yan kolu olarak görünür. onlar ar Bu nüfus yok olmalıdırVerapamil (Şekil 1D) ABC taşıyıcılarının bir önleyicisi ile işlendi, e. Bu nüfus altında ölçekli Hoechst Kırmızı-A ölçek (Şekil 1C ve 1D, mavi elips) üzerinde olduğu için PI boyama PI-pozitif ölü hücreleri hariç tutulmasına izin verir.
İkinci hücre sıralama önceden (Şekil 2) sınıflandırılmaktadır SP hücrelerinden 0,5-2% edinme izin CD44 reseptörü ve yüksek ALDH enzim aktivitesinin yüksek ifadesine dayanıyordu. sıralama önce, çeşitli kontroller kullanıldı. Ilk olanlar "ALDH" ve FITC yüksek hücreler (Şekil 2A ve 2B) ilk kapısı yerleştirmek için gerekli "ALDH + DEAB" tüpler: ALDH yüksek hücreler APC-A nokta karşı FITC-A kapılı edildi "ALDH" tüp (Şekil 2A) kullanılarak arsa. Kapının iyi pozisyon "ALD kullanılarak kontrol edildiH + DEAB "tüp.:. DEAB ALDH inhibe olarak, pozitif hücreler kapısı (Şekil 2B) kaybolur gerekir onlar, (örneğin DEAB miktarını artırarak) reaksiyon koşullarını değiştirmek istemiyorsanız ikinci denetimi" CD44-APC "ve" CD44-APC antikor (Şekil 2C) ile boyandı hücreler kullanarak APC yüksek hücreler (Şekil 2C ve 2D) ikinci kapısı konumlandırmak için izin IgG1-APC "borular. Bu nüfus ile ortadan gerekir öyle değilse IgG1-APC hücreleri (Şekil 2B) içeren kontrol tüpü., antikor ile bağ% 0.5 antikor reaksiyonu sırasında ALDH algılama kiti tampon 1 içine ilave edilmelidir özgü değildir ve BSA. Son olarak, üçüncü kontrol "ALDH ve CD44-APC" tüp ve "ALDH, DEAB ve CD44-APC" borular (Şekil 2E, 2F, 2G ve 2H) ilgilidir. çift staining ALDH / CD44 tüp çift pozitif hücrelerin (Şekil 2E) ve DEAB ile tedavi aynı tüp son kapı konumlandırmak için kullanılır ALDH yüksek hücreleri (Şekil 2F) yok olduğunu doğrulamak için bir kontroldür.
Bu protokol, SQ20B ve Fadu hücre çizgilerinden CSCS sıralamak için kullanılmaktadır. Sıralama sıralanmış kök hücre benzeri hücreler özelliklere sahip olmasını sağlamak için, yeni bir hücre çizgisi ilk kez yapıldığında, kendi tümör potansiyelini teyit etmek gereklidir. Mil benzeri hücre özelliğinin bir FSC barındırmayan ortam içinde in vitro tumorspheres oluşturmak kabiliyetidir. Bu durumda, sadece kanser kök benzeri hücreler yaşayabilir (Şekil 3A) çoğalır. Ayrıca, qPCR deneyleri CD44 / yüksek ALDH yüksek hücreleri (Şekil 3B) β-katenin (mil benzeri karakteristik belirteci) yüksek ekspresyonu gösteren, hem de BMI-1 ve Çentik 19 </ Sup>. Son olarak, CD44 / yüksek ALDH yüksek hücreleri de CD44 / düşük ALDH düşük hücre 19 ile karşılaştırıldığında, düşük miktarlarda enjekte edildiğinde tümör oluşturabildiği.
Şekil 1: Hoechst boya hariç bir yan nüfusun izolasyonu SSC-A nokta arsa karşı (A) FSC-A.. (B) SSC-H nokta arsa karşı SSC-W. (C, D) Hoechst Kırmızı-A Hoechst Mavi-A "Hoechst" tüp (C) veya "Hoechst ve Verapamil" tüp (D) kullanarak nokta arsa. Versus bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Yani Hoechst boyası negatif hücrelerden CD44 yüksek / ALDH yüksek hücrelerin rting. "ALDH" tüp (A), "ALDH + DEAB" tüp (B), "CD44-APC" seçeneğini kullanarak APC-A nokta arsa karşı FITC-A tüp (C) "IgG1 APC" boru (D) "ALDH ve CD44-APC" boru (E ve G) ya da "ALDH, DEAB ve CD44-APC" boru (F ve H). Şekil A, B, C, D, E ve F SQ20B hücre çizgisi kullanılarak elde edildi. Şekiller G ve H Fadu hücre soyu kullanılarak elde edilmiştir. Yeşil CD44 düşük / ALDH düşük hücreleri (Q3) belirtir; koyu mavi CD44 düşük / ALDH yüksek hücreleri (Q1) belirtir; mor CD44 yüksek / ALDH düşük hücreleri (S4) belirtir; açık mavi CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreleri (Q2) gösterir._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. CD44 yüksek / ALDH yüksek hücrelerin Sıralama CD44 yüksek / ALDH yüksek hücrelerin tümör potansiyeli Onay fakir-FCS medyada tumorspheres in vitro (A) oluşturmak başardık. Ölçek çubuğu, 25 mikron. Ayrıca, CD44 yüksek / ALDH yüksek aşırı ifade β-katenin, tümör gelişimini (B) bir işaretleyici. Bu miktar qPCR ve hata çubukları SD temsil yapılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Hücre sayısıkriteri | Kültür şişesi türü | Tripsin Hacmi (ml) | Kültür Orta Hacmi (ml) |
| 10,000-200,000 | 6-plaka 1 de veya 3,5 cm petri | 0.5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | 1 T25 kültürü şişesi | 1 | 4 |
| > 1,000,000 | 1 T75 kültürü şişesi | 2 | 10 |
Tablo 1: Kültür şişeyi tipi sıralanmış hücrelerin sayısına göre kullanmak kültürü şişesi boyutu Detayları verilmiştir sıralanmış hücrelerin yaklaşık sayısı için.. tripsin ve kültürü şişesi türü için gerekli ortamın hacmi hacmi de verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için diğer HNSCC hücre çizgileri için geçerli olan özel bir hücre soyundan CSCS başarıyla izolasyonu için güvenilir bir yöntem tarif eder. İzole baş ve boyun CSCS bağışık yetmezliği olan farelere 19 transplantasyon in vitro ve fonksiyonel doğrulama ileri moleküler karakterizasyonu için daha sonra uygundur. Ancak, bazı değişiklikler yan nüfus veya ebeveyn hücre hattında bulunan CD44 yüksek / ALDH yüksek oranda bağlı test edilebilir. Yan popülasyonda hücrelerin yüzdesi, belirli bir hücre soyu içinde çok düşükse, örneğin, CD44 / yüksek ALDH yüksek bir ayırım ile doğrudan gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada kullanılan belirteçler bu CD133, yüksek 34 veya CD10 35 Yüksek hücre hattına uygun olan diğer belirteçler ile incelenmiştir değiştirilebilir.
Bu protokol, iki hücre sortings dayanmaktadır. SP + CD44 + ALDH ile sıralama Üç renk possibl değildiTest edilen hücre hatları ile E. İlk olarak, ana hücre soyu SP burada SP mevcut% 5'inden az ve en fazla% 10 CD44 / yüksek ALDH yüksek hücreler test. Bu nedenle, SP / CD44 / yüksek ALDH, yüksek ana hücre çizgisi% 0.5'ten daha az temsil etmektedir. Bu nedenle, ilk SP sıralama CD44 yüksek ve / veya ALDH yüksek hücreleri nüfus zenginleştirmek için gereklidir. İkinci olarak, parental hücre çizgisi% 1 sıralamak için, yaklaşık 300,000 hücreleri elde etmek için, 5 saat sürer. 3 renk hücre sıralama yapılmaktadır, bu nedenle, toplanan hücrelerin miktarı çok düşük olacaktır. Ayrıca, uzun bir sıralama hücre canlılığını etkileyebilir olarak tavsiye edilmez.
Bu izolasyon protokolü seçicilik sayesinde, ana sınırlama elde CSCS küçük sayıdır. çünkü CD44 ve A hızlı kaybı 3 geçişten sonra bunları kullanmak için tavsiye edilmez çünkü bu, daha fazla deneyler gerçekleştirmek için sorunlu olabilirLDH işaretleri. Ayrıca, her yeni deneyden önce, hücre süspansiyonu hala mevcut CD44 yüksek / ALDH yüksek hücrelerin yüzdesi farklılaşmış olan CSCS sayısını kontrol etmek için test edilmelidir.
Verapamil hidroklorür çözeltisi ve bu moleküllerin çok kararsız olarak kullanımdan hemen önce EGF içeren kültür ortamı hazırlamak için zorunludur. 20 mg / L'de EGF bir stok çözeltisi, -20 ° C'de üç ay boyunca stabildir. Hoechst protokolü varyasyonları vardır, fakat genel olarak kullanılan nihai boya konsantrasyonu 5 ug / ml'dir. Ayrıca, birinci sıralama sırasında farklı kultur ortamı bileşimler kullanılan hücre hattına göre test edilmelidir. Sıralama koşulları doğrulandıktan sonra, farklı yöntemler (bölüm 4) kullanılarak sıralı hücre popülasyonunun özelliklerini kontrol etmek gereklidir.
Hücre yüzey belirteçleri, ALDH aktivitesi ve hayati boyalar akıttığı yeteneğinin individua kullanılmıştırlly literatürde HNSCC gelen CSCS izole etmek. Ancak, burada açıklanan protokol HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyon yüksek özgüllük elde etmek için çeşitli belirteçlerin kombinasyonları kullanılarak benzersiz bir avantaja sahiptir. Ayrıca, CD44 manyetik sütun 36 manyetik mikro-boncuklar ile konjüge edilmiş ve kriteri bir antikorun bir anti-CD44 ile gerçekleştirilebilir Sıralama, ancak bu yöntem, çift sıralama önlenmesi, hücre yüzeyi işaretçileri için geçerlidir ve ALDH sıralama için kullanılamaz . CSCS elde etmek için kullanılan bir başka yöntem, primer tümörlerin 37 veya xenografts 38 tumorsphere kültürüdür. Bununla birlikte, bu primer tümörler ya da ksenograftlarının kazanılması etik kısıtlamaları ile ilişkilidir.
Bu yöntem, uygun bir HNSCC CSCS izole olduğundan, bu hücrelerin fizyolojik fonksiyonu ölçen deneyler bir dizi (tümör gelişimini kontrol ettikten sonra) kullanılabilir. Bu nedenle davranış değerlendirilmesini sağlarCSCS farklı tedavi yaklaşımları (radyoterapi, kemoterapi) Aşağıdaki. Aynı zamanda vb göç / işgali, DNA onarımı, hücre sinyalizasyonu, gibi çeşitli biyolojik parametrelerin çalışma sağlar. Bu nedenle, farklı hücre hatları CSCS elde CSCS özelliklerini araştırmak için cazip bir seçimdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
