Abstract
Dictyostelium discoideum अमीबा मिट्टी में पाए जाते हैं, बैक्टीरिया पर खिला। खाद्य स्रोतों दुर्लभ हो जाते हैं, वे एक बहुकोशिकीय विकास कार्यक्रम है, जिसके दौरान एकल कक्षों एकत्रीकरण केंद्रों में 1-4 की ओर chemotax आरंभ करने के लिए कारकों छिपाना। इस प्रक्रिया को चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) 5 की रिहाई पर निर्भर है। शिविर adenylate साइक्लेज और phosphodiesterases की ठोस कार्रवाई के माध्यम से लहरों में उत्पादन किया, और जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स शिविर 6.7 को बांधता है। एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख तंत्र कम यूकेरियोट Dictyostelium discoideum के विकास के चक्र में शामिल जलमग्न की स्थिति 8,9 में सेल एकत्रीकरण के अवलोकन पर आधारित है विश्लेषण करने के लिए। इस प्रोटोकॉल संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) 10 में डूबे हुए ऊतक संस्कृति प्लेटों में भुखमरी से विकास चक्र में coronin एक की भूमिका का विश्लेषण बताता है। Coronin एक व्यापक रूप से संरक्षित जनसंपर्क का एक सदस्य हैcoronins कि गतिविधियों 11,12 की एक विस्तृत विविधता में फंसाया गया है की otein परिवार। ए coronin कमी Dictyostelium कोशिकाओं बहुकोशिकीय समुच्चय के रूप में करने में असमर्थ हैं, और इस दोष शिविर की दालों की आपूर्ति, सुझाव द्वारा बचाया जा सकता है कि नदी के ऊपर एक कृत्यों coronin शिविर में 10 झरना। तकनीक इन अध्ययनों में वर्णित मजबूत उपकरण उपलब्ध कराने शिविर झरना के अपस्ट्रीम Dictyostelium discoideum के विकास चक्र के प्रारंभिक चरणों के दौरान प्रोटीन के कार्यों की जांच करने के लिए। इसलिए, इस एकत्रीकरण परख का उपयोग एक समारोह coronin के आगे के अध्ययन की अनुमति है और coronin जीव विज्ञान की हमारी समझ को अग्रिम कर सकते हैं।
Introduction
प्रोटीन के coronin परिवार अत्यधिक eukaryotes भर में संरक्षित है। ये प्रोटीन एक एमिनो टर्मिनल tryptophan-aspartate (DD) दोहराने युक्त एक अद्वितीय एक carboxy टर्मिनल कुंडलित-तार डोमेन 13,14 से जुड़े क्षेत्र से पीछा क्षेत्र (चित्रा 1) की उपस्थिति की विशेषता है। Coronins cytoskeletal विनियमन और संकेत पारगमन 12 सहित सेलुलर कार्यों की एक किस्म में फंसाया गया है। स्तनधारियों में, अप करने के लिए छह लघु coronin अणुओं (coronin 1-6) के साथ ही एक 'मिलकर' coronin 7, सह व्यक्त किया जा सकता 12,15। Coronin 1 सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन परिवार के सदस्य है, और रोगज़नक़ विनाश, टी सेल अस्तित्व और neuronal संकेतन में शामिल होना दिखाया गया था। कैसे, वास्तव में, coronin 1 इन गतिविधियों से बाहर किया जाता अस्पष्ट बनी हुई है। Coronin 1 सीए 2 और शिविर पर निर्भर संकेत के रूप में अच्छी तरह से एफ actin के रूप में cytoskeleton मॉडुलन 16-18, संभावित सह विनियमित करने के लिए दिखाया गया था जबकिस्तनधारियों में अप करने के लिए परिवार के 7 सदस्यों की -expression यह संभावित redundancies के कारण इन पद्धतियों में coronins की आणविक समारोह का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, बना दिया है। स्तनधारी जीवों के विपरीत, कम यूकेरियोट Dictyostelium discoideum जाहिरा तौर पर गैर-निरर्थक कार्यों 15,19,20 के साथ केवल दो coronin परिवार के सदस्यों (coronin ए, स्तनधारी coronin 1 और coronin बी के ortholog, स्तनधारी coronin 7 की ortholog) को व्यक्त करता है। इस तथ्य को Dictyostelium discoideum coronins के समारोह में अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बनाता है।
Dictyostelium discoideum में coronin एक की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, हम संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) बफर या तो जंगली प्रकार की कोशिकाओं या कोशिकाओं को एक 10 coronin कमी का उपयोग कर युक्त ऊतक संस्कृति प्लेटों में भुखमरी से विकास चक्र प्रेरित किया। हमने पाया है कि coronin एक कमी कोशिकाओं भुखमरी पर बहुकोशिकीय समुच्चय के रूप में असमर्थ थे। इस phenotype का सही मूल्यांकन के लिए मात्रात्मकस्वचालित लाइव सेल इमेजिंग इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक महत्वपूर्ण उपकरण है। एक coronin कमी कोशिकाओं में जल्दी भुखमरी प्रतिक्रिया की दीक्षा में दोष शिविर की दालों की आपूर्ति, सुझाव है कि शिविर झरना नदी के ऊपर एक कृत्यों coronin द्वारा बचाया जा सकता है। विकास की दीक्षा अनुकरण करने के लिए शिविर दालों की बहिर्जात आवेदन अतीत 8,9 में कई प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया गया है। हालांकि, इस प्रक्रिया को भी सेल घनत्व और समय पर अत्यधिक निर्भर हो जाता है। इसलिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल आदेश reproducibility के एक उच्च डिग्री की गारंटी करने के लिए इन variabilities को कम करना है। साथ में ले ली, तकनीक इन अध्ययनों में उपयोग मजबूत उपकरण प्रदान Dictyostelium discoideum के विकास चक्र के प्रारंभिक दौर के दौरान प्रोटीन के कार्यों की जांच करने के लिए और साथ ही साथ ऊपर की पहचान एक समारोह coronin के बहाव प्रभावोत्पादक की क्षमता है।
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Protocol
- समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा Dictyostelium discoideum के शुरुआती भुखमरी प्रतिक्रिया का निरीक्षण करें।
- 5 ग्राम proteose peptone, 5 ग्राम thiotone ई peptone, 10 ग्राम ग्लूकोज, 5 ग्राम खमीर निकालने, 0.35 छ ना 2 HPO 4: 1 के लिए एल एच एल -5 मध्यम (युक्त एक Erlenmayer फ्लास्क में DH1.10 कोशिकाओं या कोरा -deficient कोशिकाओं को विकसित * 7H 2 हे, 0.35 छ के.एच. 2 4 पीओ, 0.05 ग्राम dihydrostreptomycin-सल्फेट, पीएच 6.6) 160 आरपीएम की एक रोटेशन के साथ एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 22 डिग्री सेल्सियस पर। 0.01 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल और 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के बीच एक घनत्व में कोशिकाओं रखें।
- सेल एकत्रीकरण की जांच करना, कटाई लॉग चरण से बढ़ती DH1.10 कोशिकाओं 21 या कोरा -deficient कोशिकाओं 10 DH1.10 पृष्ठभूमि में उत्पन्न, 22 डिग्री सेल्सियस पर एच एल -5 माध्यम के साथ संस्कृति झटकों में उगाया जाता है। ऐसा करने के लिए, 400 XG पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं (आमतौर पर 10 के बीच और 50 मिलीलीटर), सेंट्रीफ्यूज की उचित मात्रा में ले और कोशिकाओं बीएसएस (10 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl में दो बार धोने2.5 मिमी 2 CaCl, पीएच 6.5)।
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। बाद में, (5, 10, 20, या 40) एक घनत्व पर थाली कोशिकाओं को एक 24 अच्छी तरह से थाली में 10 x 4 कोशिकाओं / 2 सेमी। उन्हें बीएसएस में 22 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पालन करने के लिए अनुमति दें।
- के रूप में 10 से पहले वर्णित है, छवियों हर 135 सेकंड लेने के समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा एकत्रीकरण कल्पना। एक लाइव सेल इमेजिंग की स्थापना 5X उद्देश्य और एक इलेक्ट्रॉन गुणा आरोप युग्मित डिवाइस कैमरा उपयुक्त सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित के साथ सुसज्जित का उपयोग कर (देखें सामग्री तालिका)।
- भुखमरी के दौरान Dictyostelium discoideum कोशिकाओं के शिविर स्पंदन।
- DH1.10 कोशिकाओं 21 या DH1.10 कोरा -deficient कोशिकाओं 10 के विकास पर बाहर से लागू शिविर दालों के प्रभाव, कोशिकाओं फसल कटाई से जांच करते हैं। ऐसा करने के लिए, 400 XG पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं की उचित मात्रा में (आमतौर के बीच 10 और 50 मिलीलीटर), सेंट्रीफ्यूज ले और बीएसएस में दो बार धोने।
- couबीएसएस में 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व के लिए एक hemocytometer का उपयोग और कोशिकाओं resuspend NT कोशिकाओं। दालों को लागू करने से पहले 2 घंटे के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों (160 आरपीएम) हिला। एक टाइमर नियंत्रित क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर शिविर दालों जोड़ें। पंप कार्यक्रम एक 5 सेकंड पल्स 5 घंटा की अवधि में 50 एनएम शिविर (अंतिम एकाग्रता) के 15 μl के हर 6.5 मिनट देने के लिए।
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। बाद में, (5, 10, 20, या 40) घनत्व पर थाली कोशिकाओं x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 24 अच्छी तरह से थाली में। बीएसएस में 1 घंटे के लिए पालन करने के लिए अनुमति दें।
- एक 5X उद्देश्य का उपयोग उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा 22 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के बाद एकत्रीकरण कल्पना।
- वातानुकूलित माध्यम से संपर्क के माध्यम Dictyostelium discoideum विकास की प्रेरण।
- के रूप में वर्णित 22 ताजा वातानुकूलित माध्यम से तैयार करें। पंथ झटकों से, लॉग चरण DH1.10 कोशिकाओं 21 या DH1.10 कोरा -deficient कोशिकाओं 10 लीजिए22 डिग्री सेल्सियस पर एच एल -5 माध्यम के साथ ures 400 XG पर 3 मिनट के लिए एक पिपेट, सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर और पीबीएम में कोशिकाओं तीन बार धोने (0.02 एम पोटेशियम फॉस्फेट, 10 माइक्रोन 2 CaCl, और 1 मिमी 2 MgCl, पीएच 6.1)।
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना, 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर पीबीएम में इन resuspend और 110 rpm / 22 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए हिला।
- पर 3 मिनट के लिए 400 × छ centrifugation के बाद वातानुकूलित माध्यम लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कम से 8,000 × छ centrifugation द्वारा स्पष्ट।
- एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर वातानुकूलित मध्यम (देखें सामग्री तालिका) और पीबीएम में तीन गुना पतला।
- (5, 10, 20, या 40) घनत्व पर एक hemocytometer और प्लेट का उपयोग कोशिकाओं की गणना 10 x 4 कोशिकाओं / 2 सेमी 24 अच्छी तरह से थाली में। उन्हें 22 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पालन करने के लिए अनुमति दें।
- पहले से तैयार वातानुकूलित माध्यम से कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला एक्सचेंज।
- कल्पना एकत्रीकरण एकएक 5X उद्देश्य का उपयोग उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा fter 16 घंटा।
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Representative Results
प्रारंभिक विकास में एक शो के एक दोष coronin में कमी कोशिकाओं (चित्रा 2)। एक कोशिकाओं coronin के अभाव में बहुकोशिकीय समुच्चय है, जो Dictyostelium discoideum के विकास चक्र के दौरान प्रारंभिक कदम है के रूप में करने में असमर्थ हैं। इसलिए, coronin एक प्रारंभिक भुखमरी प्रतिक्रिया और / या शिविर सिगनल के दौरान एक भूमिका निभाने के लिए प्रकट होता है। दरअसल, coronin एक के अभाव में बहुकोशिकीय कुल गठन की कमी को कम कर शिविर का संकेत 10 के साथ है। हालांकि, बहिर्जात शिविर दालों के आवेदन पूरी तरह से जंगली प्रकार phenotype (चित्रा 3) पुनर्स्थापित करता है। यह है कि एक coronin, बजाय सीधे शिविर सिगनल, शिविर झरना नदी के ऊपर कार्य (चित्रा 5) में शामिल किया जा रहा implicates। Dictyostelium कोशिकाओं को भूख से मर स्थिति से अवगत कराया जाता है जब वे प्रेरित जल्दी भुखमरी का स्राव कारकों 22,23। सबसे अच्छा chara में से एकcterized जल्दी भुखमरी प्रतिक्रिया में शामिल कारकों वातानुकूलित है मध्यम कारक (सीएमएफ) 22। हमारे परिणामों के आधार पर, हम धारणा है कि एक coronin या तो इन जल्दी भुखमरी कारकों के स्राव को नियंत्रित करता है या संकेत पारगमन इन कारकों से प्रेरित में शामिल है। आदेश में इन दोनों के प्रभाव हम मध्यम प्रयोगों वातानुकूलित प्रदर्शन के बीच अंतर करने में सक्षम हो। जंगली प्रकार या कोरा -deficient कोशिकाओं या तो भूखे जंगली प्रकार या कोरा -deficient कोशिकाओं 10 (चित्रा 4) से supernatants से अवगत कराया गया। ये supernatants बहुकोशिकीय कुल गठन की प्रबल सेवक हैं और इसलिए कारक है कि शिविर सिगनल सहित बहाव के विकास के संकेत दे रास्ते, आरंभ होते हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि कोरा -deficient कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला समान रूप से विकास को प्रेरित करने के लिए सक्षम के रूप में जंगली प्रकार की कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला के लिए मामला (चित्रा 4) था। इस implicates कि कोरा -कमी कोशिकाओं के निर्माण और उनके जंगली प्रकार नियंत्रण करने के लिए समान स्तर पर जल्दी भुखमरी कारकों स्रावित करने में सक्षम हैं। हालांकि, कोरा -deficient कोशिकाओं न तो उनके स्वयं के सतह पर तैरनेवाला के लिए और न ही जंगली प्रकार की कोशिकाओं (चित्रा 4) से प्रदान की सतह पर तैरनेवाला के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं। इसलिए, coronin एक नहीं बल्कि उनकी अभिव्यक्ति / स्राव 10 (चित्रा 5) से, जल्दी भुखमरी कारकों से प्रेरित रास्ते संकेतन में शामिल होना प्रतीत होता है।
सामान्य में, आगे संकेतों Dictyostelium कोशिकाओं है कि विकास के चक्र को प्रेरित भूख से मर द्वारा स्रावित की जांच करने में सक्षम हो, जलमग्न की स्थिति के तहत एकत्रीकरण परख एक शक्तिशाली पढ़ने के लिए बाहर है। अनायास कुल सभी आवश्यक संकेतों के एक बहुतायत के कारण उच्च घनत्व में होगा वरीयता प्राप्त कोशिकाओं। हालांकि, कम घनत्व में केवल वातानुकूलित माध्यम के अलावा सेलुलर एकत्रीकरण प्रेरित करेगा (चित्रा 4) 22,24
चित्रा 1: Coronin स्तनधारियों और Dictyostelium discoideum में मौजूद प्रोटीन coronin परिवार एक अद्वितीय डोमेन और एक सी टर्मिनल कुंडलित कुंडल क्षेत्र से पीछा एन टर्मिनल WD-दोहराने क्षेत्रों की उपस्थिति की विशेषता है।। जबकि स्तनधारियों 7 coronin प्रोटीन (ए) एक्सप्रेस, Dictyostelium discoideum केवल दो परिवार के सदस्यों (बी), अतिरेक कम होने की संभावना का खतरा बना रही है जब उनके कार्य का अध्ययन शामिल है। Coronin एक स्तनधारी coronin 1 और coronin बी के ortholog coronin 7. संकेताक्षर रूप में एक समान डोमेन संरचना से पता चलता है: सीसी, कुंडलित-तार डोमेन; यूडी, अद्वितीय डोमेन; WD को दोहराता है, नियासिन -aspartate दोहराता है। लंबाई अमीनो एसिड (एए) में माउस दृश्यों (ए) के लिए दिया जाता है। पीटर्स एट अल।, 2013 12 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। कोरा - Dictyostelium discoideum जल्दी भुखमरी प्रतिक्रिया के दौरान कुल करने में असमर्थ हैं जंगली प्रकार (ए) या कोरा -deficient (बी) Dictyostelium कोशिकाओं 2 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर multiwell प्लेटों में वरीयता प्राप्त थे, बीएसएस में भूखे, और 20 घंटे की अवधि में imaged। स्केल बार = 100 माइक्रोन।.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: बाह्य शिविर दालों कोरा के प्रारंभिक विकास दोष बचाव लागू - Dictyostelium discoideum वनस्पति जंगली प्रकार (ए और बी) और कोरा -deficient कोशिकाओं (सी और डी) धोया और 2 घंटे के लिए भूखे थे साथ स्पंदित होने से पहले (बी। और डी) या 5 घंटा निलंबन में हर 6.5 मिनट के दौरान बिना (ए और सी) 50 एनएम शिविर। कोशिकाओं तो धो रहे थे, बीएसएस में resuspended, और 10 x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर एक पेट्री डिश पर रखा। छवियाँ कोशिकाओं के बोने के बाद 20 घंटा के लिए ले जाया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: कोरा -deficient Dictyostelium discoideum विकासात्मक शामिल करने के लिए सभी आवश्यक कारकों का उत्पादन करने में सक्षम हैं, लेकिन उन्हें जवाब देने में असमर्थ हैं तेजी से बढ़ रही प्रकार के जंगली और कोरा -deficient कोशिकाओं पीबीएम में धोया और के घनत्व पर multiwell प्लेटों में वरीयता प्राप्त थे (। 5, 10, 20, या 40) एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी, जंगली प्रकार (ए) या कोरा -deficient भूख से मर कोशिकाओं (बी) से प्राप्त वातानुकूलित माध्यम में incubated। छवियों कोशिकाओं बोने के बाद 16 घंटा ले जाया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन।tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5:। Coronin के मौजूदा मॉडल Dictyostelium discoideum में एक समारोह Coronin एक कारक (ओं) जल्दी भुखमरी प्रतिक्रिया शिविर झरना की प्रेरण और विकास चक्र के माध्यम से प्रगति करने के लिए अग्रणी दौरान स्रावित के संकेत पारगमन में शामिल है। से Vinet एट अल। संशोधित, 2014 10। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
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Discussion
Coronin प्रोटीन यूकेरियोटिक क्लेड के सबसे taxa में पाए जाते हैं। Dictyostelium discoideum coronin ए, स्तनधारी coronin 1 की सजात, जल्दी भुखमरी प्रतिक्रिया में शामिल है coronin ए की कमी के बाद से कोशिकाओं को प्रारंभिक विकास के दौरान एकत्रीकरण केंद्रों को बनाने में सक्षम नहीं हैं चक्र 10। मात्रात्मक और सही प्रकारों के बीच विकास में देरी का आकलन करने में सक्षम हो, स्वचालित चरण नियंत्रक के साथ एक खुर्दबीन लाइव सेल इमेजिंग सेट अप एक अनिवार्य उपकरण है।
डी discoideum अपने जीवन चक्र 1-4 के कई चरणों के दौरान एक आवश्यक संकेत अणु के रूप में शिविर का इस्तेमाल करता है। चौकियों के दौरान जो शिविर की आवश्यकता है में से एक बहुकोशिकीय संरचनाओं के गठन के लिए एक एकल कोशिका से संक्रमण है। शिविर लहरों की शुरुआत के बाद भूख से ~ 6 घंटा कोशिकाओं से लगा है और एक एकत्रीकरण केंद्र 5 की दिशा में कदम कीमोटैक्टिक संकेत देता है। इन शिविरलहरों भूख से मर डी स्पंदन द्वारा प्रयोगात्मक मजाक उड़ाया जा सकता शिविर के साथ discoideum कोशिकाओं 5H 8,9 की अवधि में हर 6.5 मिनट। इस प्रक्रिया का उपयोग यह ऊपर आदेश विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, शिविर दालों को लागू करने से पहले 2H करने के लिए कोशिकाओं को भूखा करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रयोगात्मक की स्थापना का उपयोग हम उस coronin एक शिविर सिगनल के ऊपर काम कर रहा है दिखाने के लिए सक्षम थे, के रूप में इन बाह्य लागू दालों कोरा -deficient कोशिकाओं में विकास को बचाया (चित्रा 3 और 5)। इन परिणामों से यह भी संकेत मिलता है कि coronin एक प्रारंभिक भुखमरी प्रतिक्रिया संवेदन में एक आवश्यक भूमिका हो गया लगता है, यह इस तरह के chemotaxis और सेल एकत्रीकरण प्रतिशत से 10 के रूप में प्रक्रियाओं के लिए नगण्य है।
एकत्रीकरण परख खुद Dictyostelium discoideum के प्रारंभिक विकास के अध्ययन के लिए एक मजबूत विधि है। हालांकि, वहाँ कई बाधाएं है कि इन ई के reproducibility प्रभावित कर सकते हैंxperiments, और यह इसलिए महत्वपूर्ण है कि कई कारकों को ध्यान में रखा जाता है: जब कोरा -deficient कोशिकाओं का विश्लेषण कोशिकाओं की उम्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इन कोशिकाओं को लगभग बिंदु वे thawed रहे हैं से 2 सप्ताह के बाद phenotype और फिर से कुल क्षतिपूर्ति करने के लिए करते हैं। कोशिकाओं के घनत्व के रूप में कोशिकाओं है कि एक संकेतन दोष और नहीं दिखा एक कीमोटैक्टिक दोष जल्दी भुखमरी कारकों की वृद्धि की एकाग्रता की वजह से उच्च घनत्व पर कुल जाते हैं हो सकता है, साथ ही एक महत्वपूर्ण कारक है। इन assays में सटीक गिनती और कोशिकाओं के कमजोर पड़ने के महत्व को अतिरंजित नहीं किया जा सकता है। विभिन्न प्रकारों के लिए, इस तरह के सेल घनत्व, पालन के समय, विकास के समय के रूप में परख के कई चर, का एक समायोजन, आवश्यक हो जाएगा। , कोशिकाओं की कमी से जूझ जा सकता है, या विकास को प्रेरित या हिचकते जा सकता है विभिन्न यौगिकों का उपयोग कर सभी: एकत्रीकरण परख के रूप में यहाँ वर्णित एक बहुमुखी तकनीक है कि अलग-अलग पूछताछ के अनुरूप संशोधित किया जा सकता हैएकत्रीकरण की एक विशिष्ट मॉडुलन के लिए कारण। यहाँ वर्णित सेट-अप भी निष्पक्ष दृष्टिकोण जीन या कारक हैं जो प्रारंभिक विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं की पहचान के लिए प्रारंभिक विकास दोष के साथ उपभेदों की पहचान करने के लिए, साथ ही अनुमति देता है। यह भी विधि की बड़ी खामी है: एकत्रीकरण परख पूरा विकास चक्र का एक कम संस्करण है। इसलिए, यह विकास चक्र के बाद के चरणों को प्रभावित करने phenotypes के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है। 48 अच्छी तरह प्लेटों में और स्वचालित इमेजिंग के दौरान दर्ज की गई विकास के 16 घंटा के साथ, एकत्रीकरण परख अधिक समय और संसाधन कुशल पर विकास से साबित होता है: मुख्य लाभ यह संभावना एक बड़े पैमाने पर करने के लिए एकत्रीकरण परख और स्वचालित प्रारूप को अपनाने के लिए है अगर प्लेटें।
प्रयोगों में जो हम जल्दी भुखमरी प्रतिक्रिया को नजरअंदाज कर, बाहर से लागू शिविर दालों का उपयोग में, हम पता चला कि coronin एक <द्वारा स्रावित कारकों में से संवेदन में शामिल हैउन्हें> भुखमरी पर Dictyostelium कोशिकाओं। जल्दी भुखमरी प्रतिक्रिया के दौरान coronin एक की मध्यस्थता संकेतन की सटीक व्यवस्था अस्पष्ट बनी हुई है। कई विकास के इस चरण के दौरान शामिल कारकों का अध्ययन किया गया है, विशेष रूप से वातानुकूलित माध्यम कारक (सीएमएफ) 25,26 में। बहरहाल, चाहे सीएमएफ अपने दम पर या सह कारकों के साथ काम करता है अस्पष्ट बनी हुई है और इसके संकेत झरना केवल आंशिक रूप से समझा जाता है। Dictyostelium कोशिकाओं के एकत्रीकरण क्षमता का उपयोग के तहत जलमग्न की स्थिति यहां विकास के लिए एक सकारात्मक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में वर्णित एक समय कुशल तरीके से बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रयोगों का संचालन करने के लिए अगर सतहों पर एकत्रीकरण assays की तुलना में अनुमति देता है। हालांकि, जलमग्न की स्थिति के तहत एकत्रीकरण assays पूरा विकास चक्र को पूरा नहीं कर के रूप में कोशिकाओं प्रारंभिक एकत्रीकरण चरण में गिरफ्तार कर लिया जाएगा का नुकसान है। इसलिए, तकनीक यहाँ वर्णित बाद में विकास प्रक्रिया की परीक्षा के लिए उपयुक्त नहीं हैsses। सारांश में, प्रयोगात्मक दृष्टिकोण यहाँ प्रलेखित संभावित जल्दी भुखमरी कारक (s) है कि प्रेरित जल्दी भुखमरी प्रतिक्रिया में coronin ए-निर्भर प्रविष्टि के आगे लक्षण वर्णन अनुमति हो सकती है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
- Weijer, C. J.
- Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
- Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
- Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
- Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
- Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
- Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
- Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
- Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
- Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
- Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
- Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
- Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E.
- Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
- Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
- Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
- de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
- Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
- Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
- Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
- Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
- Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
- Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).
