Abstract
Dictyostelium discoideum amibes se trouvent dans le sol, se nourrissant de bactéries. Lorsque les sources de nourriture se font rares, ils sécrètent des facteurs de lancer un programme de développement multicellulaire, au cours de laquelle des cellules individuelles chemotax vers les centres d'agrégation 1-4. Ce processus dépend de la libération de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) 5. AMPc est produit dans les vagues grâce à l'action concertée de l' adénylate cyclase et phosphodiestérases, et se lie à la protéine G couplée AMPc récepteurs 6,7. Un essai largement utilisé pour analyser les mécanismes impliqués dans le cycle de développement de la partie inférieure eucaryote Dictyostelium discoideum est basé sur l'observation de l' agrégation des cellules dans des conditions submergées 8,9. Ce protocole décrit l'analyse du rôle de coronine A dans le cycle de développement par la famine dans des plaques de culture de tissus immergés dans une solution saline équilibrée (BSS) 10. Coronin A est un membre de la pr largement conservéefamille otein de coronins qui ont été impliqués dans une grande variété d'activités 11,12. cellules de Dictyostelium dépourvues Coronin A sont incapables de former des agrégats multicellulaires, ce défaut peut être sauvée en fournissant des impulsions d'AMPc, ce qui suggère que Coronin A agit en amont de la 10 cascade AMPc. Les techniques décrites dans ces études fournissent des outils robustes pour étudier les fonctions des protéines pendant les premières étapes du cycle de développement de Dictyostelium discoideum en amont de la cascade de l' AMPc. Par conséquent, l'utilisation de ce test d'agrégation peut permettre une étude plus approfondie des coronine Une fonction et de faire progresser notre compréhension de la biologie coronine.
Introduction
La famille coronine de protéines est fortement conservée tout au long des eucaryotes. Ces protéines sont caractérisées par la présence d'un tryptophane-aspartate amino-terminale (DEO) répéter contenant la région suivie d'une région unique connecté à un domaine coiled-coil carboxy-terminale 13,14 (figure 1). Coronins ont été impliqués dans une variété de fonctions cellulaires, y compris la régulation du cytosquelette et la transduction du signal 12. Chez les mammifères, jusqu'à six molécules courtes coronine (de coronine 1-6), ainsi que d' un «tandem» coronine 7, peuvent être co-exprimées 12,15. Coronin 1 est membre de la famille le plus étudié, et a été montré pour être impliqué dans la destruction des agents pathogènes, la survie des cellules T et la signalisation neuronale. Comment, exactement, coronine 1 réalise ces activités reste incertaine. Alors que coronine 1 a été montré pour réguler Ca 2+ et dépendante de l' AMPc de signalisation, ainsi que F-actine cytosquelette modulation 16-18, le co potentiel-expression jusqu'à 7 membres de la famille chez les mammifères a fait qu'il est difficile d'étudier la fonction moléculaire coronins dans ces systèmes, en raison de redondances possibles. Contrairement à des organismes mammifères, plus discoideum eucaryote Dictyostelium exprime seulement deux membres de la famille (coronine coronine de A, l'orthologue de mammifères coronine 1 et coronine B, l'orthologue de coronine mammifère 7) avec des fonctions apparemment non redondantes 15,19,20. Ce fait rend Dictyostelium discoideum un modèle puissant pour étudier la fonction de coronins.
Pour étudier le rôle de coronine A dans Dictyostelium discoideum, nous avons provoqué le cycle de développement par la famine dans des plaques de culture de tissus contenant une solution tampon de sel (BSS) équilibrée en utilisant soit des cellules ou des cellules de type sauvage manquant coronine A 10. Nous avons constaté que les cellules dépourvues de coronine A ont été incapables de former des agrégats multicellulaires sur la famine. Pour une évaluation quantitative précise de ce phénotype duimagerie des cellules vivantes automatisé décrit dans ce protocole est un outil essentiel. Le défaut de l'initiation de la réponse précoce de famine dans les cellules dépourvues Coronin A peut être sauvée en fournissant des impulsions d'AMPc, ce qui suggère que Coronin A agit en amont de la cascade AMPc. L'application exogène d'AMPc impulsions pour simuler le début du développement a été utilisé par plusieurs laboratoires dans le passé 8,9. Toutefois, cette procédure est également connu pour être fortement dépendante de la densité des cellules et la synchronisation. Par conséquent, le protocole décrit ici vise à réduire ces variabilités afin de garantir un degré élevé de reproductibilité. Pris ensemble, les techniques utilisées dans ces études fournissent des outils robustes pour étudier les fonctions des protéines au cours des premières étapes du cycle de développement de Dictyostelium discoideum et ont le potentiel d'identifier amont ainsi que effecteurs en aval de coronine Une fonction.
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Protocol
- Observez la réponse de famine précoce de Dictyostelium discoideum par microscopie time-lapse.
- Cultiver des cellules DH1.10 ou des cellules CORA de dans un erlenmeyer contenant HL-5 moyenne (pour 1 litre: 5 g de protéose - peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g de glucose, 5 g d' extrait de levure, 0,35 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g de KH 2 PO 4, 0,05 g de sulfate de dihydrostreptomycine, pH 6,6) à 22 ° C dans un incubateur à agitation avec une rotation de 160 tours par minute. Maintenir les cellules à une densité comprise entre 0,01 x 10 6 cellules / ml et 2 x 10 6 cellules / ml.
- Examiner l' agrégation cellulaire, par récolte phase logarithmique croissance des cellules DH1.10 21 ou les cellules CORA 10 généré en arrière - plan DH1.10, cultivés en secouant la culture avec HL-5 moyenne à 22 ° C. Pour ce faire, prendre quantité appropriée de cellules (généralement entre 10 et 50 ml), centrifuger 3 min à 400 g et laver les cellules deux fois dans BSS (10 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, pH 6,5).
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Par la suite, les cellules de la plaque à une densité de (5, 10, 20 ou 40) x 10 4 cellules / cm 2 dans une plaque à 24 puits. Permettez-leur d'adhérer pendant 1 heure à 22 ° C dans le BSS.
- Visualisez l' agrégation par microscopie time-lapse comme décrit précédemment 10, en prenant des images toutes les 135 secondes. en utilisant une imagerie de cellules vivantes mis en place équipée objectif 5X et une caméra à dispositif à couplage de charge électronique multipliant automatisé par le logiciel approprié (voir tableau des matériaux).
- AMPc pulsation des cellules Dictyostelium discoideum pendant la famine.
- Examiner l'effet des impulsions d'AMPc appliquées de l' extérieur sur le développement des cellules DH1.10 21 ou les cellules de DH1.10 CORA 10, en récoltant les cellules. Pour ce faire, prendre quantité appropriée de cellules (habituellement entre 10 et 50 ml), centrifuger 3 min à 400 g et laver deux fois dans le BSS.
- Count des cellules en utilisant un hémocytomètre et remettre en suspension les cellules à une densité de 1 x 10 7 cellules / ml dans du BSS. Agiter les cultures (160 rpm) à 22 ° C pendant 2 heures avant d'appliquer des impulsions. Ajouter des impulsions AMPc en utilisant une minuterie contrôlée pompe péristaltique. Programmer la pompe pour délivrer une impulsion de 5 secondes à chaque 6,5 min de 15 pi de 50 nM AMPc (concentration finale) sur une période de 5 heures.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Par la suite, la plaque les cellules à une densité de (5, 10, 20, ou 40) x 10 4 cellules / cm 2 dans une plaque de 24 puits. Laisser adhérer pendant 1 h dans BSS.
- Visualisez l'agrégation après 16 heures à 22 ° C par microscopie à champ lumineux en utilisant un objectif 5X.
- Induction du développement Dictyostelium discoideum par l' exposition à un milieu conditionné.
- Préparer un milieu conditionné frais comme décrit 22. Recueillir les cellules DH1.10 en phase logarithmique 21 ou les cellules de DH1.10 CORA 10, de secouer culteUres avec HL-5 moyenne à 22 ° C à l' aide d' une pipette, centrifugeuse pendant 3 min à 400 xg et laver les cellules à trois reprises en PBM (0,02 M de phosphate de potassium, 10 uM de CaCl2 et 1 mM MgCl2, pH 6,1).
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre, resuspendre ceux - ci dans PBM à une densité de 1 x 10 7 cellules / ml et agiter pendant 20 heures à 110 rpm / 22 ° C.
- Collecter milieu conditionné après centrifugation à 400 g pendant 3 min et clarifier par centrifugation à 8000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- Filtre milieu conditionné à travers un filtre de 0,45 um (voir le tableau des matériaux) et diluer triple PBM.
- Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque à une densité de (5, 10, 20 ou 40) x 10 4 cellules / cm 2 dans une plaque à 24 puits. Permettez-leur d'adhérer pendant 1 heure à 22 ° C.
- Échange surnageant des cellules avec le milieu conditionné préalablement préparé.
- Visualisez l'agrégation d'unprès avoir 16 heures par microscopie à champ lumineux en utilisant un objectif 5X.
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Representative Results
Les cellules déficientes en coronine Un spectacle d' un défaut dans le développement précoce (figure 2). En l'absence de Coronin A cellules sont incapables de former des agrégats multicellulaires, qui est l'étape initiale au cours du cycle de développement de Dictyostelium discoideum. Par conséquent, un coronine semble jouer un rôle dans la réponse de famine au début et / ou de signalisation de l'AMPc. En effet, l'absence de formation d' agrégats multicellulaires en l'absence de coronine A est accompagné d'AMPc réduit de signalisation 10. Toutefois, l'application d'impulsions d'AMPc exogènes restaure pleinement le phénotype de type sauvage (figure 3). Ceci implique que Coronin A, au lieu d'être directement impliqué dans la signalisation de l' AMPc, les fonctions en amont de la cascade AMPc (figure 5). Lorsque les cellules Dictyostelium sont exposés à des conditions qui meurent de faim , ils induisent la sécrétion de faim précoce des facteurs 22,23. L'un des meilleurs charafacteurs cterized impliqués dans la réponse de la famine au début est conditionné facteur moyen (CMF) 22. Sur la base de nos résultats, nous avons supposé que coronine A régule soit la sécrétion de ces facteurs de famine début ou est impliqué dans la transduction du signal induit par ces facteurs. Afin d'être en mesure de faire la différence entre ces deux effets nous avons effectué des expériences conditionnées moyennes. De type sauvage ou les cellules CORA ont été exposés à des surnageants provenant de type sauvage affamés ou les cellules CORA de 10 (figure 4). Ces surnageants sont des initiateurs puissants de la formation d'agrégats multicellulaires et contiennent donc des facteurs qui déclenchent en aval des voies de signalisation de développement, y compris la signalisation AMPc. Nos résultats montrent que le surnageant de cellules CORA de était également capable d'induire le développement comme cela a été le cas pour le surnageant de cellules de type sauvage (figure 4). Ceci implique que corA -les cellules déficientes sont capables de produire et de sécréter des facteurs de famine début à des niveaux similaires à leurs contrôles de type sauvage. Cependant, les cellules CORA de ne sont ni en mesure de répondre à leur propre surnageant ni surnageant fourni à partir de cellules de type sauvage (figure 4). Par conséquent, coronine A semble être impliqué dans les voies induites par des facteurs de famine au début de signalisation, plutôt que de leur expression / sécrétion 10 (Figure 5).
En général, pour être en mesure d'étudier plus avant les signaux sécrétées par les cellules de faim Dictyostélium qui induisent le cycle de développement, l'essai d'agrégation dans des conditions submergées est une lecture puissante. Les cellules ensemencées à des densités plus élevées spontanément globale due à une abondance de tous les signaux nécessaires. Cependant, à des densités plus faibles que l'addition du milieu conditionné va induire l' agrégation cellulaire (figure 4) 22,24
Figure 1: Les protéines Coronin présents chez les mammifères et Dictyostelium discoideum coronine La famille est caractérisée par la présence de régions répétées WD-N-terminal suivi d'un domaine unique et une région de superhélice C-terminale.. Bien que les mammifères expriment 7 protéines coronine (A), Dictyostelium discoideum ne contient que deux membres de la famille (B), ce qui rend le risque de redondance moins probable lorsque l' étude de leur fonction. Coronin A est l'orthologue de coronine mammifère 1 et coronine B représente une structure de domaine similaire coronine 7. Abréviations: CC, domaine superhélice; UD, domaine unique; WD répète, le tryptophane répète aspartate. La longueur est donnée pour les séquences de souris (A) dans les acides aminés (aa). Modifié à partir de Pieters et al., 2013 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. CorA - Dictyostelium discoideum sont incapables de regrouper au cours de la réponse de famine au début de type sauvage (A) ou (B) les cellules Dictyostelium de CORA ont été ensemencées dans des plaques multipuits à une densité de 2 x 10 5 cellules / cm 2, affamé dans BSS, et imagée sur une période de 20 heures. Barre d'échelle = 100 um..jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Extérieurement appliquée AMPc impulsions sauver le défaut de développement précoce de corA - Dictyostelium discoideum type sauvage Vegetative (A et B) et les cellules CORA de (C et D) ont été lavés et affamé pendant 2 heures avant d' être puisées avec (B. et D) ou non (A et C) , 50 nM d' AMPc pendant 5 h à partir de 6,5 min en suspension. Les cellules ont ensuite été lavées, remises en suspension dans le BSS, et placées sur une boîte de Pétri , à une densité de 10 x 10 4 cellules / cm 2. Les images ont été prises 20 heures après l'ensemencement des cellules. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Dictyostelium de discoideum de corA sont capables de produire tous les facteurs requis pour l' induction du développement , mais sont incapables de répondre à leur croissance exponentielle de type sauvage et les cellules CORA de ont été lavées dans PBM et ensemencées dans des plaques multipuits à une densité de (. 5, 10, 20, ou 40) x 10 4 cellules / cm 2, incubées dans un milieu conditionné obtenu à partir de type sauvage (A) ou les cellules affamées de CORA (B). Les images ont été prises 16 heures après l'ensemencement des cellules. Barre d'échelle = 100 um.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Modèle actuel de Coronin Une fonction de Dictyostelium discoideum Coronin A est impliquée dans la transduction du signal de facteur (s) sécrété lors de la réponse de privation précoce conduisant à l'induction de la cascade AMPc et la progression à travers le cycle de développement. Modifié à partir de Vinet et al., 2014 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les protéines Coronin se trouvent dans la plupart des taxons de clade eucaryote. Dictyostelium discoideum coronine A, l'homologue de coronine mammifère 1, est impliquée dans la réponse de famine précoce, étant donné que Coronin A déficientes cellules ne sont pas capables de former des centres d'agrégation au cours du développement précoce cycle de 10. Pour être en mesure d'évaluer quantitativement et avec précision le retard dans le développement entre les souches, un microscope imagerie des cellules vivantes set-up avec le contrôleur de scène automatique est un outil essentiel.
D. discoideum utilise l' AMPc comme une molécule de signalisation essentielle pendant plusieurs étapes de son cycle de vie 1-4. L'un des points de contrôle au cours de laquelle l'AMPc est nécessaire est le passage d'une seule cellule à la formation de structures multicellulaires. L'apparition des ondes de AMPc après environ 6 heures de faim est détectée par les cellules et fournit le signal chimiotactique pour se déplacer vers un centre d'agrégation 5. Ces AMPcles vagues peuvent être imitées expérimentalement en pulsant faim D. cellules discoideum avec AMPc tous les 6,5 min sur une période de 8,9. 5h En utilisant cette procédure, il est important de priver les cellules pendant 2h avant d'appliquer les impulsions d'AMPc, afin d'obtenir des résultats fiables. En utilisant ce dispositif expérimental mis en place , nous avons pu montrer que coronine A est agissant en amont de la signalisation AMPc, ces impulsions appliquées à l' extérieur sauvé le développement dans les cellules CORA de (Figure 3 et 5). Ces résultats indiquent également que si coronine A semble avoir un rôle essentiel dans la détection de la réponse de famine au début, il est indispensable pour les processus tels que la chimiotaxie et l' agrégation cellulaire en soi 10.
L'essai d'agrégation elle - même est une méthode robuste pour l' étude du développement précoce de Dictyostelium discoideum. Cependant, il y a plusieurs pièges qui peuvent influencer la reproductibilité de ces eXperiments, et il est donc important que plusieurs facteurs sont pris en compte: l'âge des cellules joue un rôle important lors de l' analyse des cellules CORA de. Ces cellules ont tendance à compenser le phénotype et re-total environ après 2 semaines à partir du point qu'ils sont décongelés. La densité des cellules est un facteur crucial aussi bien, car les cellules qui présentent un défaut de signalisation et non un défaut de chimiotactique pourraient avoir tendance à agréger à des densités plus élevées en raison de la concentration accrue des facteurs de famine début. L'importance du comptage précis et la dilution des cellules dans ces essais ne peut être surestimée. Pour différentes souches, un ajustement de plusieurs variables de l'essai, telles que des densités cellulaires, le temps de l'adhésion, le temps de développement, sera nécessaire. L'essai d'agrégation tel que décrit ici est une technique polyvalent qui peut être modifié pour convenir à différentes questions: les cellules peuvent être privées de nourriture, ou de développement peuvent être stimulées ou inhibées en utilisant différents composés, tousen raison d'une modulation spécifique de l'agrégation. Le voici décrit set-up permet également des approches impartiales pour identifier les souches avec des défauts précoces du développement, ainsi que pour l'identification de gènes ou de facteurs qui sont importants pour le développement précoce. Ceci est également inconvénient majeur de la méthode: l'essai d'agrégation est une version réduite du cycle de développement complet. Par conséquent, il ne convient pas pour l'analyse des phénotypes qui affectent les étapes ultérieures du cycle de développement. Le principal avantage est la possibilité d'adopter le test d'agrégation à une grande échelle et le format automatisé: dans des plaques à 48 puits et 16 h du développement enregistré au cours de l'imagerie automatisée, le test d'agrégation se révèle être plus de temps et de ressources efficaces que le développement sur des plaques d'agar.
Dans des expériences dans lesquelles nous avons contourné la réponse de famine au début, en utilisant des impulsions d'AMPc appliquées de l'extérieur, nous avons montré que coronine A est impliqué dans la détection des facteurs sécrétés par <em> cellules Dictyostelium sur la famine. Le mécanisme précis de coronine A-médiée par la signalisation au cours de la réponse de famine anticipée reste incertaine. Plusieurs facteurs en jeu lors de ce stade de développement ont été étudiés, notamment le facteur milieu conditionné (CMF) 25,26. Toutefois, si CMF agit sur son propre ou avec des co-facteurs reste incertaine et sa cascade de signalisation est que partiellement compris. Utilisation de la capacité d'agrégation des cellules Dictyostelium dans des conditions submergées ici décrites comme une lecture positive pour le développement permet de réaliser des expériences de criblage à grande échelle d'une manière efficace du temps par rapport aux essais d'agrégation sur des surfaces d'agar. Cependant, les tests d'agrégation dans des conditions submergées ont l'inconvénient de ne pas remplir le cycle de développement complet que les cellules seront arrêtés dans le stade de l'agrégation initiale. Par conséquent, la technique décrite ici ne convient pas à l'examen de la suite du développement procésses. En résumé, l'approche expérimentale documentée ici peut permettre une caractérisation plus poussée du potentiel facteur (s) de famine précoce qui induisent coronine A-dépendante entrée dans la réponse de famine au début.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
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