Abstract
Dictyostelium discoideum Amöbe sind im Boden und ernähren sich von Bakterien gefunden. Wenn Nahrungsquellen knapp werden, sie Faktoren absondern einen vielzelligen Entwicklungsprogramm zu initiieren, in denen 1-4 einzelne Zellen chemotax zur Aggregation Zentren. Dieser Prozess ist abhängig von der Freisetzung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) 5. cAMP wird in Wellen durch die konzertierte Aktion der Adenylatcyclase und Phosphodiesterasen produziert und bindet an G - Protein-gekoppelten Rezeptoren cAMP 6,7. Ein weit verbreiteter Test die Mechanismen in dem Entwicklungszyklus des niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum beteiligt zu analysieren ist in submersen Bedingungen 8,9 auf der Beobachtung der Zellaggregation basiert. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der Rolle von Coronin A im Entwicklungszyklus durch Verhungern in Gewebekulturplatten unter Wasser in ausgewogener Salzlösung (BSS) 10. Coronin A ist ein Mitglied der weitgehend konservierten protein Familie von Coronine , die 11,12 in einer Vielzahl von Aktivitäten eine Rolle spielen . Dictyostelium Zellen ohne A Coronin sind unfähig mehrzelligen Aggregate zu bilden, und dieser Fehler kann durch Zuführen von Pulsen von cAMP gerettet werden, was darauf hindeutet , dass eine Akte stromaufwärts von der Coronin cAMP Kaskade 10. Die Techniken , die in diesen Studien beschriebenen liefern robuste Werkzeuge Funktionen von Proteinen während der Anfangsstadien des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum stromauf der cAMP - Kaskade zu untersuchen. Daher erlauben die weitere Untersuchung der Coronin Eine Funktion und unser Verständnis der Biologie Coronin kann diese Aggregation Assay verwendet.
Introduction
Die Coronin Familie von Proteinen ist stark in ganz Eukaryoten konserviert. Diese Proteine werden durch die Gegenwart eines Amino-terminalen Tryptophan-aspartat (WD) wiederholen haltigen Bereich , gefolgt von einer einzigartigen Region verbunden mit einem carboxy-terminalen coiled-coil Domäne 13,14 (Figur 1) charakterisiert. Coronine wurden in einer Vielzahl von zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Zytoskelett - Regulation und Signaltransduktion 12. Bei Säugetieren bis zu sechs kurze Coronin Moleküle (Coronin 1-6) sowie ein "Tandem" Coronin 7 können coexprimiert 12,15 werden. Coronin 1 ist das am intensivsten untersuchten Familienmitglied und wurde pathogen Zerstörung, T-Zell-Überleben und die neuronalen Signalübertragung beteiligt werden gezeigt. Wie genau Coronin 1 trägt diese Aktivitäten aus, bleibt unklar. Während Coronin 1 wurde gezeigt , Ca 2+ und cAMP-abhängige Signalgebung sowie F-Aktin - Zytoskelett Modulation 16-18, das Potential co zu regulieren-Ausdruck von bis zu 7 Familienmitglieder in Säugetieren hat es schwierig, das Molekular Funktion Coronine in diesen Systemen zu untersuchen, aufgrund potentieller Redundanzen. Im Gegensatz zu Säugetierorganismen exprimiert die niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum nur zwei Coronin Familienmitglieder (Coronin A, das Ortholog von Säugetier Coronin 1 und Coronin B, das Ortholog von Säugetier Coronin 7) mit scheinbar nicht-redundante Funktionen 15,19,20. Diese Tatsache macht Dictyostelium discoideum ein starkes Modell , um die Funktion von Coronine zu studieren.
Um die Rolle von Coronin A in Dictyostelium discoideum studieren, induziert wir den Entwicklungszyklus durch Verhungern in Gewebekulturplatten mit ausgeglichener Salzlösung (BSS) Puffer entweder Wildtyp - Zellen oder Zellen mit fehlenden A 10 Coronin. Wir fanden heraus, dass Zellen ohne Coronin A waren nicht in der Lage mehrzelligen Aggregate auf Hunger zu bilden. Für eine genaue quantitative Beurteilung dieser Phänotyp derautomatisierte Live Cell Imaging in diesem Protokoll beschrieben ist ein wichtiges Instrument. Der Defekt in der Einleitung des frühen Verhungern Reaktion in Zellen Coronin A fehlt, kann durch Zuführen von Pulsen von cAMP gerettet werden, was darauf hindeutet, dass eine Akte vor der cAMP-Kaskade Coronin. Die exogene Applikation von cAMP Impulse für die Einleitung der Entwicklung zu simulieren wurde von mehreren Laboratorien in der Vergangenheit 8,9 verwendet worden. Jedoch ist dieses Verfahren auch in hohem Maße von Zelldichten und den Zeitpunkt bekannt sein. Daher beschrieben das Protokoll hier zum Ziel, diese Variabilitäten zu reduzieren, um ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Zusammengenommen sind die verwendeten Techniken in diesen Studien liefern robuste Werkzeuge Funktionen von Proteinen während der frühen Phasen des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum zu untersuchen und haben das Potenzial , zu identifizieren Up- sowie Downstream - Effektoren einer Funktion Coronin.
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Protocol
- Beachten Sie die frühen Hunger Reaktion von Dictyostelium discoideum durch Zeitraffer-Mikroskopie.
- Wachsen DH1.10 Zellen oder CORA - defizienten Zellen in einem Erlenmeyerkolben, der HL-5 - Medium (für 1 L: 5 g Proteosepepton, 5 g thiotone E Pepton, 10 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 0,35 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2 PO 4, 0,05 g Dihydrostreptomycin-Sulfat, pH 6,6) bei 22 ° C in einem Schüttelinkubator mit einer Rotation von 160 Umdrehungen pro Minute. Halten Zellen mit einer Dichte zwischen 0,01 x 10 6 Zellen / ml und 2 x 10 6 Zellen / ml.
- Untersuchen Zellaggregation durch Ernte log-Phase wachsende Zellen DH1.10 21 oder CORA - defizienten Zellen 10 im Hintergrund DH1.10 erzeugt wird , bei 22 ° C in Schüttelkultur mit HL-5 - Medium gezüchtet. Um dies zu tun, nehmen Sie entsprechende Menge an Zellen (in der Regel zwischen 10 und 50 ml), Zentrifuge 3 min bei 400 xg und waschen Sie die zweimal Zellen in BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, pH 6.5).
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Anschließend Platten Zellen bei einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Damit sie für 1 h bei 22 ° C in BSS zu haften.
- Visualisieren Sie die Aggregation von Zeitraffer-Mikroskopie wie vor 10 beschrieben, Bilder alle 135 sec nehmen. unter Verwendung der entsprechenden Software automatisiert eine Live - Cell - Imaging eingerichtet , ausgestattet mit 5X Objektiv und einer Elektronenvervielfachungs charge-coupled device - Kamera (siehe Materialien Tabelle).
- cAMP Pulsieren von Dictyostelium discoideum Zellen während der Hungertod.
- Untersuchen die Wirkung von außen aufgebrachten cAMP Impulse auf die Entwicklung von Zellen DH1.10 21 oder DH1.10 CORA - defizienten Zellen 10, durch die Zellen zu ernten. Um dies zu tun, nehmen Sie entsprechende Menge an Zellen (in der Regel zwischen 10 und 50 ml), Zentrifuge 3 min bei 400 xg und waschen zweimal in BSS.
- count - Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Resuspendieren der Zellen zu einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml in BSS. Schütteln der Kulturen (160 rpm) bei 22 ° C für 2 Stunden vor der Anwendung von Impulsen. In cAMP Impulse mit einer Zeitschaltuhr gesteuert peristaltische Pumpe. alle 6,5 Minuten von 15 ul 50 nM cAMP (Endkonzentration) über einen Zeitraum von 5 Stunden zu liefern Programmieren Sie die Pumpe mit einem 5 s Puls.
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Anschließend wird die Platte , die Zellen in einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Lassen Sie für 1 Stunde in BSS einzuhalten.
- Visualisieren Aggregation nach 16 Stunden bei 22 ° C von Hellfeld-Mikroskopie ein 5fach Ziel verwenden.
- Die Induktion von Dictyostelium discoideum Entwicklung durch den Zugang zu konditionierten Medium.
- Bereiten Sie frisch konditioniertes Medium als 22 beschrieben. Sammeln Sie log-Phase DH1.10 Zellen 21 oder DH1.10 CORA - defizienten Zellen 10, von Kult Schüttelnmen mit HL-5 - Medium bei 22 ° C mit einer Pipette, Zentrifuge für 3 min bei 400 xg und wasche die Zellen dreimal in PBM (0,02 M Kaliumphosphat, 10 & mgr; M CaCl 2 und 1 mM MgCl 2, pH 6.1) verwendet wird .
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers resuspendieren diese in PBM in einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml und schüttle 20 Stunden bei 110 rpm / 22 ° C.
- Sammeln konditionierten Medium nach der Zentrifugation bei 400 × g für 3 min und Klärung durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min bei 4 ° C.
- Filter konditionierte Medium durch ein 0,45 - um - Filter (siehe Materialien Tabelle) und dreifach in PBM verdünnen.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Platte bei einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Damit sie für 1 h bei 22 ° C zu halten.
- Wechselüberstand der Zellen mit dem vorher konditionierten Medium hergestellt.
- Visualisieren Aggregation einN ach 16 Stunden von Hellfeld-Mikroskopie ein 5fach Ziel verwenden.
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Representative Results
Die Zellen einen Mangel an einer Show einen Defekt in der frühen Entwicklung Coronin (Abbildung 2). In Abwesenheit von A - Zellen nicht in der Lage Coronin mehrzellige Aggregate zu bilden, die der erste Schritt während des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum ist. Daher erscheint Coronin A eine Rolle während der frühen Hungerantwort und / oder cAMP-Signalisierung zu spielen. Tatsächlich ist das Fehlen von mehrzelligen Aggregatbildung in Abwesenheit von Coronin A durch verringerte cAMP - Signalisierungs 10 begleitet. Allerdings stellt die Anwendung von exogenen cAMP Impulse vollständig die Wildtyp - Phänotyp (Abbildung 3). Dies impliziert , dass A Coronin, anstatt direkt in cAMP - Signalisierung, Funktionen stromaufwärts der Kaskade cAMP beteiligt sind (Abbildung 5). Wenn Dictyostelium - Zellen hungern Bedingungen ausgesetzt sind , induzieren sie die Sekretion von frühen Hunger 22,23 Faktoren. Eines der besten characterized Faktoren im frühen Hungerantwort beteiligt ist mittel Faktor (CMF) 22 konditioniert. Basierend auf unseren Ergebnissen, die Hypothese aufgestellt, dass Coronin entweder A die Sekretion dieser frühen Hunger Faktoren oder in der Signaltransduktion durch diese Faktoren ausgelösten reguliert. Um zwischen diesen beiden Effekten zu unterscheiden zu können wir Medium Experimente Anlage durchgeführt. Wildtyp- oder CORA - defizienten Zellen wurden entweder starved Wildtyp- oder CORA - defizienten Zellen Überständen ausgesetzt 10 (Abbildung 4). Diese Überstände sind potente Initiatoren von mehrzelligen Aggregatbildung und damit Faktoren enthalten, die Downstream-Entwicklungs-Signalwege initiieren, einschließlich cAMP-Signalisierung. Unsere Ergebnisse zeigen , dass Überstand von CORA - defizienten Zellen war gleichermaßen in der Lage Entwicklung zu induzieren , wie der Fall für Überstand von Wildtyp - Zellen (Abbildung 4) war. Dies hat zur Folge , dass CORA -defizienten Zellen sind in der Lage zu produzieren und zu früh Verhungern Faktoren auf ähnlichem Niveau zu ihren Wildtyp-Kontrollen absondern. Jedoch sind CORA - defizienten Zellen weder in der Lage, ihre eigenen Überstand noch zur Überstand von Wildtyp - Zellen (Figur 4) vorgesehen , zu reagieren. Daher scheint Coronin A in Signalwege durch frühe Verhungern Faktoren, anstatt ihre Expression / Sekretion 10 (Figur 5) induziert beteiligt.
Im allgemeinen Lage sein , die Signale , die durch Verhungern Dictyostelium Zellen sezerniert weiter zu untersuchen, die den Entwicklungszyklus, die Aggregationsassay unter submersen Bedingungen ist ein potenter Auslese induzieren. Zellen, die bei höheren Dichten ausgesät werden spontan Aggregat aufgrund einer Fülle aller erforderlichen Signale. Bei niedrigeren Dichten 22,24 nur jedoch die Zugabe von konditioniertem Medium induziert zelluläre Aggregation (Figur 4)
Abbildung 1: Coronin Proteine , die in Säugetieren und Dictyostelium discoideum Die Coronin Familie durch die Anwesenheit von N-terminal-repeat WD Regionen , gefolgt von einer einzigartigen Domäne und eine C-terminale Coiled Coil - Region gekennzeichnet.. Während Säugetiere 7 Coronin Proteine (A) exprimieren, nur Dictyostelium discoideum enthält zwei Familienmitglieder (B), das Risiko der Redundanz macht weniger wahrscheinlich , wenn ihre Funktion zu studieren. Coronin A ist die ortholog von Säugetier Coronin 1 und Coronin B zeigt eine ähnliche Domänenstruktur wie Coronin 7. Abkürzungen: CC, Coiled-Coil-Domäne; UD, einzigartige Domain; WD wiederholt, Tryptophan -Aspartat wiederholt. Länge wird für Maus - Sequenzen (A) in Aminosäuren (aa) angegeben. Geändert von Pieters et al., 2013 12. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 2: CORA - Dictyostelium discoideum sind nicht imstande , während des frühen Verhungern Antwort zu aggregieren Wildtyp (A) oder CORA defizienten (B) Dictyostelium Zellen wurden in Mikrotiterplatten in einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / cm 2, ausgehungert in BSS, und über einen Zeitraum von 20 Stunden abgebildet. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m..jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Äußerlich angewendet cAMP - Impulse die frühe Entwicklungsstörung von CORA retten - Dictyostelium discoideum Vegetative Wildtyp (A und B) und CORA - defizienten Zellen (C und D) wurden gewaschen und für 2 Stunden ausgehungert , bevor sie mit gepulst (B. und D) oder ohne (A und C) 50 nM cAMP während 5 Stunden alle 6,5 min in Suspension. Die Zellen wurden dann gewaschen und in BSS resuspendiert und bei einer Dichte von 10 x 10 4 Zellen / cm 2 auf eine Petrischale gelegt. Bilder wurden 20 h nach dem Aussäen der Zellen genommen. Maßstabsbalken = 100 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: CORA -Mangel Dictyostelium discoideum sind in der Lage , alle erforderlichen Faktoren für Entwicklungs Induktion zu erzeugen , sind aber nicht in der Lage, darauf zu reagieren Exponentiell wachsende Wildtyp und CORA - defizienten Zellen wurden in PBM gewaschen und entkernt in Multiwell - Platten mit einer Dichte von (. 5, 10, 20, oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2, konditioniertes Medium aus Wildtyp (A) oder CORA - defizienten hungernde Zellen (B) erhalten inkubiert. Die Bilder wurden 16 h genommen, nachdem die Zellen der Aussaat. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Aktuelle Modell Coronin Eine Funktion in Dictyostelium discoideum Coronin A in der Signaltransduktion von Faktor beteiligt ist (n) während der frühen Hunger Reaktion abgesondert auf die Induktion der cAMP - Kaskade und die Progression durch den Entwicklungszyklus führt. Geändert von Vinet et al., 2014 10. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Coronin Proteine werden in den meisten Taxa der eukaryotischen Klade. Dictyostelium discoideum Coronin A, das Homolog von Säuger Coronin 1, gefunden wird im frühen Verhungern Antwort beteiligt, da Coronin A-defizienten Zellen Aggregationsstellen nicht in der Lage sind , während der frühen Entwicklungs zu bilden Zyklus 10. Um in der Lage sein, um quantitativ und genau die Verzögerung in der Entwicklung zwischen den Stämmen beurteilen zu können, ein Mikroskop Live Cell Imaging Set-up mit dem automatisierten Stufensteuerung ist ein wichtiges Instrument.
D. discoideum nutzt cAMP als wesentliche Signalmolekül während mehrerer Phasen des Lebenszyklus 1-4. Einer der Prüfpunkte, während der cAMP erforderlich ist, ist der Übergang von einer Zelle zur Bildung von vielzelligen Strukturen. Der Beginn der cAMP - Wellen nach ~ 6 Stunden von Hunger durch die Zellen gemessen wird und stellt die chemotaktischen Signal hin zu einem Aggregationszentrum 5 zu bewegen. Diese cAMPWellen können durch Pulsieren am Verhungern D. experimentell nachgeahmt werden discoideum Zellen mit cAMP alle 6,5 min über einen Zeitraum von 5 Stunden 8,9. Mit diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen zu verhungern bis die cAMP-Pulse bis 2h vor der Anwendung, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Unter Verwendung dieser Versuchsanordnung wir konnten zeigen, dass Coronin A zu zeigen , ist stromaufwärts von cAMP - Signalisierung wirkt, da diese extern angelegten Impulse die Entwicklung in CORA - defizienten Zellen gerettet (Abbildung 3 und 5). Diese Ergebnisse zeigen auch , dass während Coronin A erscheint in Abfühlen der frühen Verhungern Reaktion eine wesentliche Rolle zu spielen, ist es entbehrlich , für Prozesse wie Chemotaxis und Zellaggregation per se 10.
Der Aggregationstest selbst ist ein robustes Verfahren für die frühe Entwicklung von Dictyostelium discoideum zu studieren. Es gibt jedoch mehrere Fallen, die die Reproduzierbarkeit dieser e beeinflussenXperiments, und es ist daher wichtig , dass mehrere Faktoren berücksichtigt werden: das Alter der Zellen eine wichtige Rolle spielt , wenn CORA - defizienten Zellen zu analysieren. Diese Zellen sind in der Regel den Phänotyp und Re-Aggregat nach ca. 2 Wochen ab dem Punkt, den sie aufgetaut sind, zu kompensieren. Die Dichte der Zellen ist ein entscheidender Faktor, wie gut, wie Zellen, die eine Signaldefekt zeigen und kein chemotaktische Defekt bei höheren Dichten zu der erhöhten Konzentration der frühen Hunger Faktoren aufgrund aggregieren dazu neigen könnten. Die Bedeutung der genauen Zählen und Verdünnung der Zellen in diesen Assays kann nicht genug betont werden. Für verschiedene Stämme eine Anpassung mehrerer Variablen des Assays, wie beispielsweise Zelldichten, die Zeit der Anhaftung, die Zeit der Entwicklung, werden benötigt. Der Aggregationsassay, wie hier beschrieben, ist eine vielseitige Technik, die modifiziert werden können, verschiedene Anfragen zu entsprechen: Die Zellen ausgehungert werden kann, oder die Entwicklung kann unter Verwendung verschiedener Verbindungen stimuliert oder inhibiert werden, allaufgrund einer spezifischen Modulation der Aggregation. Die hier beschriebenen Set-up ermöglicht auch unvoreingenommene Ansätze Stämme mit frühen Entwicklungsfehler zu identifizieren, sowie für die Identifizierung von Genen oder Faktoren, die für die frühe Entwicklung von Bedeutung sind. Dies ist auch der Hauptnachteil der Methode: Der Aggregationstest eine reduzierte Version des vollständigen Entwicklungszyklus ist. Daher ist es nicht geeignet für die Analyse von Phänotypen späteren Phasen des Entwicklungszyklus zu beeinflussen. Der Hauptvorteil ist die Möglichkeit, den Aggregationstest zu einem großen Maßstab und automatisierten Format zu übernehmen: in 48-Well-Platten und mit 16 Stunden der Entwicklung während der automatisierten Bildgebung, die Aggregationsassay aufgenommen erweist sich mehr Zeit und ressourceneffizienter zu sein als die Entwicklung auf Agarplatten.
In Experimenten, in denen wir die frühen Verhungern Reaktion umgangen, extern angelegten cAMP Impulsen haben wir gezeigt, dass Coronin A in der Erfassungs von sekretierten Faktoren von <beteiligt istem> Dictyostelium - Zellen nach Hunger. Der genaue Mechanismus der Coronin A-vermitteltes Signalisieren während der frühen Verhungern Antwort bleibt unklar. Mehrere Faktoren während dieser Phase der Entwicklung insbesondere konditionierten Medium Faktor (CMF) 25,26 studiert haben beteiligt. Ob jedoch CMF wirkt für sich allein oder mit Co-Faktoren, bleibt unklar und ihre Signalkaskade ist nur teilweise verstanden. Mit der Aggregationskapazität von Dictyostelium - Zellen unter hier unter Wasser Bedingungen als positive Auslese für die Entwicklung beschrieben ermöglicht große Screening-Experimente in einer zeiteffiziente Art und Weise durchzuführen, wie zum Aggregationsassays auf Agarflächen verglichen. Allerdings Aggregationstests unter submersen Bedingungen zu tun haben den Nachteil, nicht den kompletten Entwicklungszyklus erfüllen als Zellen in der Anfangsaggregationsstufe werden verhaftet werden. Daher beschriebene Technik ist hier nicht geeignet für die Prüfung der späteren Entwicklungs processe. Zusammenfassend dokumentiert Der experimentelle Ansatz hier erlauben kann die weitere Charakterisierung von potentiellen frühen Verhungern Faktor (en), die Coronin A-abhängigen Eintritt in den frühen Verhungern Antwort induzieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
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