Abstract
細胞性粘菌のアメーバは細菌を餌に、土壌中に発見されています。食料源が不足になると、それらは、単一の細胞が凝集中心1-4向かっ走化その間多開発プログラムを開始する因子を分泌します。このプロセスは、環状アデノシン一リン酸（cAMP）5のリリースに依存しています。 cAMPは、アデニル酸シクラーゼ、およびホスホジエステラーゼの協調作用によって電波で産生され、Gタンパク質共役受容体のcAMP 6,7に結合されています。広く使用されているアッセイは、水没条件8,9における細胞凝集の観察に基づいている下等真核生物細胞性粘菌の発達サイクルに関与するメカニズムを分析します。このプロトコルは、平衡塩溶液（BSS）10の中に沈め組織培養プレート中で飢餓によって発達サイクルのcoronin Aの役割の分析を記載します。 Coronin Aは広く保存された広報のメンバーであります活動11,12の多種多様に関与しているcoroninsの家族otein。coronin Aを欠く細胞性粘菌の細胞は、多細胞凝集体を形成することができない、そしてこの欠陥が上流の行為をcoroninことを示唆し、cAMPのパルスを供給することによって救出することができますcAMPは10をカスケード。これらの研究に記載された技術は、cAMPカスケードの上流細胞性粘菌の発達サイクルの初期段階中にタンパク質の機能を調べるための強力なツールを提供します。したがって、この凝集アッセイを利用して機能をcoroninのさらなる研究を可能にし、coronin生物学の我々の理解を進めることができます。
Introduction
タンパク質のcoroninファミリは、高度真核生物を通じて保存されています。これらのタンパク質は、カルボキシ末端のコイルドコイルドメイン13,14（ 図1）に接続されたユニークな領域が続くアミノ末端トリプトファン、アスパラギン酸（WD）リピート含有領域が存在することを特徴とします。 Coroninsは、細胞骨格調節およびシグナル伝達12を含む、種々の細胞機能に関与しています。哺乳類では、最大6つの短いcoronin分子（coronin 1-6）と同様に7をcoronin「タンデム」は、12,15を共発現させることができます。 Coronin 1は、最も広く研究ファミリーのメンバーであり、病原体の破壊、T細胞の生存および神経伝達に関与することが示されました。どのように、正確に、coronin 1は、これらの活動は不明なままで行います。 coroninながら1は、CAを調節することが示さ2+およびcAMP依存性シグナル伝達だけでなく、F-アクチン細胞骨格の調節16-18、潜在的な共同ました哺乳類で最大7家族の-expressionは、それが困難なこれらのシステムにcoroninsの分子機能を研究するために潜在的な冗長性のために作られました。哺乳類の生物とは異なり、下等真核生物細胞性粘菌は明らかに非冗長機能15,19,20と2つだけcoronin家族（coroninのA、哺乳類coronin 1とcoronin Bのオルソログ、哺乳類coronin 7のオルソログ）を表します。この事実は、 細胞性粘菌に coroninsの機能を研究するための強力なモデルになります。
細胞性粘菌でcoronin Aの役割を研究するために、我々は、10 coronin欠く野生型細胞または細胞のいずれかを用いて平衡塩類溶液（BSS）緩衝液を含む組織培養プレート中で飢餓によって発達サイクルを誘導しました。私たちはcoronin Aを欠く細胞が飢餓時に多細胞凝集体を形成することができなかったことがわかりました。この表現型の正確な定量的評価のためのこのプロトコールに記載の自動化生細胞イメージングは不可欠なツールです。 coronin欠く細胞における早期の飢餓応答の開始における欠陥は、cAMPカスケードの上流の行為をcoroninことを示唆し、cAMPのパルスを供給することによって救出することができます。開発の開始をシミュレートするためのcAMPパルスの外因性の適用は、過去8,9にいくつかの研究室で利用されてきました。しかしながら、この手順は、細胞密度及びタイミングに大きく依存することが知られています。したがって、ここで説明するプロトコルは、再現性の高い度合いを保証するために、これらの変動性を低減することを目的とします。まとめると、これらの研究に利用技術は、 細胞性粘菌の発達サイクルの初期段階でのタンパク質の機能を調査するために強力なツールを提供し、アップ識別だけでなく、機能をcoroninの下流エフェクター可能性を秘めています。
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Protocol
- タイムラプス顕微鏡による細胞性粘菌の早期の飢餓応答を観察します。
- 5グラムプロテオースペプトン、5グラムthiotone Eペプトン、10gのグルコース、5gの酵母エキス、0.35グラムHPO 4 2のNa：DH1.10細胞またはHL-5培地（1L用を含むエルレンマイヤーフラスコ中のコーラ欠損細胞成長* 7H 2 O、0.35グラムのKH 160回転の回転に振盪インキュベーターで22℃で2 PO 4、0.05グラムジヒドロ-硫酸塩、pHは6.6）。 0.01×10 6細胞/ mlおよび2×10 6細胞/ mlの密度で細胞を保管してください。
- 収穫対数期に成長しているDH1.10セル21または22℃でのHL-5培地で振とう培養で増殖させたコーラ欠損細胞DH1.10のバックグラウンドで生成された10、によって、細胞凝集を調べます。これを行うには、400×gで3分間、細胞（通常10〜50 ml）を、遠心分離の適切な量を取り、BSS（10mMの塩化ナトリウム、10mMのKClの中で細胞を2回洗浄、2.5 mMのCaCl 2を、pHは6.5）。
- 血球計数器を用いて細胞を数えます。続いて、（5、10、20、または40）の密度でプレートの細胞を24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。彼らはBSSに22℃で1時間接着させます。
- 10前に説明したように、画像ごとに135秒を取って、タイムラプス顕微鏡により凝集を視覚化します。設定5Xの客観的かつ適切なソフトウェアによって自動化された電子増倍電荷結合素子カメラを搭載したライブセルイメージングを使用して（ 材料表を参照してください）。
- 飢餓時の細胞性粘菌細胞のcAMPのパルス化。
- 外部から細胞を採取することにより、DH1.10細胞21またはDH1.10 コーラ欠損細胞10の開発にcAMPのパルスを適用の効果を調べます。これを行うには、400×gで3分間、適切な細胞の量（通常10〜50ミリリットル）、遠心分離機を取り、BSSで二回洗います。
- COUNT血球計数器を用いて細胞やBSSで1×10 7細胞/ mlの密度に細胞を再懸濁します。パルスを印加する前に、2時間22℃で培養（160 rpm）を振ります。タイマー制御蠕動ポンプを使用したcAMPのパルスを追加します。 5時間かけて5秒パルスに50 nMでのcAMP（最終濃度）の15μlのあらゆる6.5分を提供するためにポンプをプログラムします。
- 血球計数器を用いて細胞を数えます。続いて、（5、10、20、または40）の密度で細胞をプレート24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。 BSSで1時間接着させます。
- 5Xの対物レンズを使用して明視野顕微鏡による22℃で16時間後に凝集を視覚化します。
- 馴化培地への暴露による細胞性粘菌開発の誘導。
- 22に記載されているように 、新鮮な馴化培地を準備します。カルトを振ってから、対数期DH1.10細胞21またはDH1.10 コーラ欠損細胞10を収集400×gで3分間、ピペット、遠心分離器を用いて22℃でHL-5培地でURESとPBMで細胞を3回洗浄し（0.02 Mリン酸カリウム、10μMのCaCl 2、1mMのMgCl 2、pHは6.1）。
- 血球計数器を用いて細胞をカウントし、mlの1×10 7細胞/の密度でPBMでこれらを再懸濁し、110回転数/ 22℃で20時間振とうします。
- 3分間400×gで遠心分離後、馴化培地を収集し、4℃で15分間8000×gで遠心分離することにより明らかにしました。
- 0.45μmフィルターを通してフィルター条件培地は、（ 材料表を参照）、PBMで3倍に希釈します。
- （5、10、20、または40）の密度で血球計およびプレートを用いて細胞をカウントし、24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。彼らは22℃で1時間接着させます。
- 先に調製した馴化培地を用いた細胞の交換上清。
- 集約aを可視化5Xの対物レンズを使用して明視野顕微鏡によるFTER 16時間。
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Representative Results
ショーを開発の初期段階で欠陥をcoroninにおける欠損細胞（ 図2）。細胞をcoroninの不在下では細胞性粘菌の発達サイクル中の初期段階である多細胞凝集体を形成することができません。したがって、coronin Aは初期の飢餓応答および/またはcAMPシグナル伝達の際に役割を果たしていると思われます。実際、coronin Aの非存在下で、多細胞凝集体形成の欠如が減少したcAMPが10をシグナリングすることによって達成されます。しかし、外因性cAMPのパルスの印加は、完全野生型の表現型（ 図3）を復元します。これはcoronin、直接ではなくcAMPシグナル伝達、cAMPのカスケードの上流の機能（ 図5）に関与していることを含意します。 細胞性粘菌の細胞が飢え条件にさらされている場合、それらは初期の飢餓の分泌が22,23因子誘導します。最高のキャラの一つ早期の飢餓応答に関与cterized要因は、媒体因子（CMF）22を調整します。我々の結果に基づいて、我々はcoroninするいずれかこれらの初期の飢餓因子の分泌を調節するか、これらの因子により誘発されるシグナル伝達に関与するという仮説を立てました。我々は、馴化培地の実験を行ったこれらの二つの効果とを区別できるようにするために。野生型またはコーラ欠損細胞が飢餓、野生型またはコーラ欠損細胞10（ 図4）のいずれかからの上清に曝露しました。これらの上清は、多細胞凝集体形成の強力な開始剤であるため、cAMPシグナル伝達を含む下流の発達のシグナル伝達経路を開始要因が含まれています。我々の結果は、 コーラ欠損細胞からの上清は、野生型細胞（ 図4）からの上清のための場合のように現像を誘発するのにも同様に可能であることを示します。これはコーラことを暗示します-欠損細胞は、野生型対照と同様のレベルで初期の飢餓因子を産生し、分泌することができます。しかし、 コーラ欠損細胞はどちらも自分の上清にも野生型細胞（ 図4）から提供された上清に応答することができます。したがって、coronin Aは初期の飢餓の要因ではなく、それらの発現/分泌10（ 図5）により誘導されるシグナル伝達経路に関与していると思われます。
一般的には、さらに発達サイクルを誘導細胞性粘菌の細胞を飢餓状態にすることにより、分泌シグナルを調査することができるように、水没条件の下で凝集アッセイは、強力な読み出しです。自発的に集約により、すべての必要な信号の存在量になります高い密度で播種された細胞。しかし、より低い密度で馴化培地の添加のみが細胞凝集を誘導します（ 図4）22,24
図1：哺乳類と 細胞性粘菌 に存在Coroninタンパク質 coroninファミリは一意のドメインおよびC末端コイルドコイル領域が続くN末端WD-反復領域が存在することを特徴とします。哺乳類は7 coroninタンパク質（A）を発現する一方で、 細胞性粘菌は 、その機能を研究する際に、冗長性の危険性が少なくなって、2家族（B）が含まれています。 Coronin Aは、哺乳動物coronin 1とcoronin Bのオルソログがcoronin 7略語と同様のドメイン構造を示している：CC、コイルドコイルドメインを。 UD、ユニークなドメイン; WDは、トリプトファンを繰り返しますアスパラギン酸塩を繰り返します。長さは、アミノ酸（AA）でマウス配列（A）について説明します。ピータースら 、2013年12から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： コーラ - 細胞性粘菌は 早期飢餓応答の間に集約することができない野生型（A）またはコーラ欠損（B） 細胞性粘菌の細胞は、2×10 5細胞/ cm 2の密度でマルチウェルプレートに播種しましたBSSで飢餓状態、及び20時間の期間にわたり画像化しました。スケールバー=100μmです。.jpgの「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：外部のcAMPは コーラ の初期発生欠陥救出パルス適用 -栄養野生型（AとB） 細胞性粘菌をとコーラ欠損細胞（CおよびD）は （Bでパルスされる前に2時間洗浄し、飢餓状態にしました。およびD）または5時間の間（AとC）50nMのcAMPをせずに、懸濁液中のすべての6.5分。次いで、細胞を洗浄し、BSS中に再懸濁し、そして10×10 4細胞/ cm 2の密度でペトリ皿に置きました。画像は、細胞の播種後20時間に採取しました。スケールバー= 100ミクロン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： コーラ 欠損 細胞性粘菌は、 発達誘導のために必要なすべての要素を生成することができるが、それらに回答することはできません指数関数的に増殖する野生型とコーラ欠損細胞はPBM中で洗浄し、（の密度でマルチウェルプレートに播種しました。 5、10、20、または40）は、野生型（A）から得られた馴化培地またはコーラ欠損飢餓細胞（B）中でインキュベートし、10 4細胞/ cm 2と x。画像は、細胞を播種後16時間に採取しました。スケールバー=100μmです。tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：Coroninの現行モデル 細胞性粘菌 における機能 Coronin AはcAMPのカスケードの誘導および発達サイクルを通じて進行につながる早期の飢餓応答中に分泌因子（複数可）のシグナル伝達に関与します。ビネら変更され、2014年10。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
coroninタンパク質は、真核生物クレードのほとんどの分類群で発見されています。coronin欠損細胞は初期発生時に集計中心を形成することができないので、 細胞性粘菌の coroninのA、哺乳類coronin 1のホモログは、早期の飢餓応答に関与していますサイクル10。定量的かつ正確に系統間で開発の遅れを評価することができるようにするには、自動化されたステージコントローラと顕微鏡、ライブセルイメージングセットアップは不可欠なツールです。
D. discoideumのは、そのライフサイクル1-4のいくつかの段階の間に本質的なシグナル伝達分子としてのcAMPを利用しています。 cAMPのが要求される時にチェックポイントの一つは、多細胞構造を形成する単一のセルからの遷移です。飢餓〜6時間後のcAMP波の開始は、細胞により感知され、集計センタ5に向かって移動する走化性信号を提供します。これらのcAMP波は飢えDをパルスすることによって実験的に模倣することができます5H 8,9の期間にわたってのcAMPとdiscoideumの細胞ごとに6.5分。この手順を使用して、信頼性の高い結果を得るために、cAMPのパルスを適用する前に、2hのまで、細胞を餓死することが重要です。セットアップこの実験を活用し、我々はこれらの外部から印加されるパルスはコーラ欠損細胞での開発救出として、cAMPシグナル伝達の上流に機能していることcoronin Aに示すことができた（ 図3及び 5）。これらの結果はまたcoronin Aが早く飢餓応答を検出するに重要な役割を有するように見えるが、それはそのような走化性および細胞凝集自体 10などのプロセスのために不要であることを示しています。
凝集アッセイ自体は、 細胞性粘菌の早期開発を研究するための堅牢な方法です。しかし、これらの電子の再現性に影響を与えることができるいくつかの落とし穴がありますxperiments、いくつかの要因が考慮されることが重要である。CORA欠損細胞を分析する場合、細胞の年齢が重要な役割を果たしています。これらの細胞は、それらが解凍された時点から2週間後に約表現型および再集計を補償する傾向があります。シグナリングの欠陥ではなく、走化性の欠陥を示す細胞が初期の飢餓の要因の濃度の増加に起因する高い密度で凝集する傾向があるかもしれないように、細胞の密度は、同様に重要な要因です。これらのアッセイにおける細胞の正確な計数および希釈の重要性は誇張することはできません。異なる株については、例えば、細胞密度、付着時間、現像時間としてアッセイの複数の変数の調整が、必要とされます。凝集アッセイ、ここで説明したように別の問い合わせに応じて変更することができる多用途の技術である：細胞を飢餓され得るか、または開発が異なる化合物を用いて刺激または阻害することができ、すべての凝集の特定の変調に起因します。公平なアプローチは、初期の開発のために重要である遺伝子または因子の同定のため、ならびに、初期の発達障害で株を同定するためにここで説明するセットアップもできます。これはまた、方法の主要な欠点である：凝集アッセイは、完全な発達サイクルの縮小版です。したがって、発達サイクルの後の段階に影響する表現型の分析には適していません。主な利点は、大規模かつ自動化された形式に凝集アッセイを採用する可能性である：48ウェルプレートにし、自動化された撮像中に記録された開発の16時間で、凝集アッセイは、上の開発よりも多くの時間と資源効率的に証明します寒天プレート。
我々は、外部から印加されるcAMPのパルスを使用して、初期の飢餓応答をバイパスする実験では、我々はcoronin Aは<によって分泌される因子の感知に関与していることが示されましたem>の飢餓時の細胞性粘菌の細胞。早期の飢餓応答の間に媒介シグナルをcoroninの正確なメカニズムは不明なままです。開発のこの段階で関与するいくつかの要因が、特定の条件培地因子（CMF）25,26に、研究されてきました。しかし、CMFは、独自にまたは共同因子と働くかどうかは不明のままであり、そのシグナル伝達カスケードは、部分的にしか理解されています。 細胞性粘菌の細胞の凝集能を使用して、 開発のための正の読み出しとして説明し、ここで浸漬条件下で寒天表面上に凝集アッセイと比較して時間的に効率的な方法で大規模なスクリーニング実験を実施することを可能にします。しかし、水没条件の下での凝集アッセイは、細胞が初期の集約の段階で逮捕されるような完全な発達サイクルを果たしていないという欠点を持っています。したがって、ここで説明する技術は、後に発達proceの検査には適していませんSSES。要約すると、ここで記述実験的なアプローチは、初期の飢餓応答にcoroninのA-依存エントリを誘発する可能性の早期の飢餓因子（複数可）のさらなる特徴付けを可能にすることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
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