Abstract
Dictyostelium discoideum un'ameba si trovano nel terreno, si nutrono di batteri. Quando fonti di cibo diventano scarse, secernono fattori di avviare un programma di sviluppo multicellulare, durante il quale le singole cellule chemiotassi verso i centri di aggregazione 1-4. Questo processo dipende dal rilascio di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) 5. cAMP è prodotto in onde attraverso l'azione concertata di ciclasi e fosfodiesterasi, e si lega al G recettori accoppiati alla proteina cAMP 6,7. Un test ampiamente utilizzato per analizzare i meccanismi coinvolti nel ciclo di sviluppo del eucariote Dictyostelium discoideum inferiore si basa sull'osservazione di aggregazione delle cellule in condizioni sommerse 8,9. Questo protocollo descrive l'analisi del ruolo di Coronin A nel ciclo di sviluppo per fame in piastre tessuto-coltura sommersa in soluzione salina bilanciata (BSS) 10. Coronin A è un membro del pr ampiamente conservatafamiglia otein di coronins che sono stati implicati in una vasta gamma di attività 11,12. Dictyostelium cellule prive Coronin A sono in grado di formare aggregati multicellulari, e questo difetto può essere salvato fornendo impulsi di cAMP, suggerendo che Coronin A agisce a monte della cAMP cascata 10. Le tecniche descritte in questi studi forniscono strumenti robusti per indagare funzioni delle proteine durante le fasi iniziali del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum monte della cascata cAMP. Pertanto, utilizzando questo test aggregazione può consentire l'ulteriore studio della Coronin Una funzione e far progredire la nostra comprensione della biologia Coronin.
Introduction
La famiglia Coronin delle proteine è altamente conservata in tutta eucarioti. Queste proteine sono caratterizzati dalla presenza di un triptofano-aspartato amino-terminale (WD) ripetere contenente regione seguita da una regione unica collegata a un dominio coiled-coil carbossi-terminale 13,14 (figura 1). Coronins sono stati implicati in una varietà di funzioni cellulari, tra cui la regolamentazione del citoscheletro e trasduzione del segnale 12. Nei mammiferi, fino a sei brevi molecole Coronin (Coronin 1-6) e un 'tandem' Coronin 7, possono essere co-espressi 12,15. Coronin 1 è il membro della famiglia più ampiamente studiato, e ha dimostrato di essere coinvolto in distruzione degli agenti patogeni, la sopravvivenza delle cellule T e la segnalazione neuronale. Come, esattamente, Coronin 1 svolge tali attività rimane poco chiaro. Mentre Coronin 1 è stato mostrato per regolare Ca 2+ e cAMP-dipendente di segnalazione così come F-actina citoscheletro modulazione 16-18, il potenziale co-expression di un massimo di 7 membri della famiglia nei mammiferi ha reso difficile per studiare la funzione molecolare di coronins in questi sistemi, a causa di potenziali esuberi. A differenza di organismi dei mammiferi, il più basso eucariote Dictyostelium discoideum esprime solo due membri della famiglia Coronin (Coronin A, la ortologo di mammiferi Coronin 1 e Coronin B, la ortologo di Coronin mammiferi 7) con funzioni apparentemente non ridondanti 15,19,20. Questo fatto rende Dictyostelium discoideum un modello potente per studiare la funzione di coronins.
Per studiare il ruolo di Coronin A in Dictyostelium discoideum, abbiamo indotto il ciclo di sviluppo per fame in piastre di coltura tissutale contenente tampone equilibrata soluzione salina (BSS) utilizzando sia le cellule di tipo selvatico o cellule prive Coronin A 10. Abbiamo scoperto che le cellule prive Coronin A erano in grado di formare aggregati multicellulari su fame. Per una valutazione quantitativa accurata di questa fenotipol'imaging cellulare dal vivo automatizzato descritto in questo protocollo è uno strumento di vitale importanza. Il difetto nella inizio della risposta di inedia nelle prime cellule mancanti Coronin A può essere salvato fornendo impulsi di cAMP, suggerendo che Coronin A agisce a monte della cascata cAMP. L'applicazione esogena di impulsi cAMP per simulare l'apertura di sviluppo è stato utilizzato da diversi laboratori in passato 8,9. Tuttavia, questa procedura è anche noto per essere fortemente dipendente densità cellulari e temporizzazione. Pertanto, il protocollo qui descritto mira a ridurre questi variabilità per garantire un elevato grado di riproducibilità. Nel loro insieme, le tecniche utilizzate in questi studi forniscono strumenti robusti per indagare funzioni delle proteine durante le prime fasi del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum e hanno il potenziale per identificare a monte così come effettori a valle di Coronin Una funzione.
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Protocol
- Osservare la risposta di inedia precoce di Dictyostelium discoideum mediante microscopia time-lapse.
- Crescere le cellule DH1.10 o cellule Corà -carente in un flacone contenente Erlenmayer HL-5 di media (per 1 L: 5 g proteoso peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito, 0,35 g di Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2 PO 4, 0,05 g diidrostreptomicina-solfato, pH 6,6) a 22 ° C in un incubatore agitazione con una rotazione di 160 rpm. Mantenere le cellule ad una densità tra 0,01 x 10 6 cellule / ml e 2 x 10 6 cellule / ml.
- Esaminare l'aggregazione delle cellule, per la raccolta di log-fase di crescita le cellule DH1.10 21 o cellule Cora -carente 10 generata in background DH1.10, coltivate in agitazione cultura con HL-5 di media a 22 ° C. Per fare ciò, adottare le opportune quantità di cellule (di solito tra 10 e 50 ml), centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare le cellule due volte in BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, pH 6,5).
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, le cellule piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Consentire loro di aderire per 1 ora a 22 ° C in BSS.
- Visualizza aggregazione mediante microscopia time-lapse come descritto in precedenza 10, prendendo immagini ogni 135 secondi. utilizzando un imaging cellulare dal vivo istituito dotata di obiettivo 5X e una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica elettrone-moltiplicando automatizzato dal software appropriato (vedi Materiali Tavolo).
- cAMP pulsare delle cellule discoideum Dictyostelium durante il digiuno.
- Esaminare l'effetto degli impulsi di cAMP applicati esternamente sullo sviluppo delle cellule DH1.10 21 o cellule 10 DH1.10 CORA -carente, raccogliendo le cellule. Per fare ciò, adottare le opportune quantità di cellule (di solito tra 10 e 50 ml), centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare due volte in BSS.
- coucellule NT utilizzando un emocitometro e risospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml in BSS. Agitare le culture (160 rpm) a 22 ° C per 2 ore prima di applicare impulsi. Aggiungere impulsi cAMP utilizzando una pompa peristaltica temporizzata. Programmare la pompa per erogare un impulso 5 sec ogni 6,5 min di 15 ml di 50 nM cAMP (concentrazione finale) in un periodo di 5 ore.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Successivamente, le cellule piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Lasciare aderire per 1 ora a BSS.
- Visualizza aggregazione dopo 16 ore a 22 ° C mediante microscopia in campo chiaro con obiettivo 5X.
- Induzione di Dictyostelium discoideum sviluppo attraverso l'esposizione a mezzo condizionato.
- Preparare fresco mezzo condizionato come descritto 22. Raccogliere le cellule DH1.10 log-fase 21 o celle 10 DH1.10 Cora -carente, di tremare cultoUres con HL-5 di media a 22 ° C con una pipetta, centrifugare per 3 minuti a 400 xg e lavare le cellule tre volte in PBM (0,02 M di fosfato di potassio, 10 mM CaCl 2, e 1 mm MgCl 2, pH 6.1).
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro, risospendere questi in PBM ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml e agitare per 20 ore a 110 rpm / 22 ° C.
- Raccogliere mezzo condizionato dopo centrifugazione a 400 g per 3 min e chiarire per centrifugazione a 8.000 xg per 15 min a 4 ° C.
- Filtro condizionata mezzo attraverso un filtro da 0,45 micron (vedi Materiali Tavolo) e diluire in triplice PBM.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e la piastra ad una densità di (5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2 in una piastra da 24 pozzetti. Consentire loro di aderire per 1 ora a 22 ° C.
- Scambio supernatante delle cellule con il mezzo precedentemente preparato condizionata.
- Visualizza l'aggregazione di unopo 16 ore al microscopio in campo chiaro utilizzando un obiettivo 5X.
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Representative Results
Le cellule carenti di Coronin Uno spettacolo un difetto di sviluppo precoce (figura 2). In assenza di Coronin A cellule sono in grado di formare aggregati multicellulari, che è la fase iniziale durante il ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum. Pertanto, Coronin A sembra giocare un ruolo durante la risposta di inedia precoce e / o segnalazione cAMP. Infatti, la mancanza di formazione degli aggregati multicellulare in assenza di Coronin A è accompagnato da segnalazione ridotta cAMP 10. Tuttavia, l'applicazione di impulsi di cAMP esogeni ripristina completamente wild-type fenotipo (Figura 3). Questo implica che Coronin A, non sono direttamente coinvolti nella cAMP segnalazione, funzioni a monte della cascata cAMP (figura 5). Quando le cellule di Dictyostelium sono esposti a condizioni di affamati inducono la secrezione di fame primi fattori di 22,23. Uno dei migliori Charafattori cterized coinvolti nella risposta di inedia precoce è condizionato fattore medio (CMF) 22. Sulla base dei nostri risultati, abbiamo ipotizzato che Coronin Una regola sia la secrezione di questi fattori fame primi o è coinvolta nella trasduzione del segnale indotta da questi fattori. Al fine di essere in grado di distinguere tra questi due effetti abbiamo effettuato esperimenti condizionati medie. Wild-type o cellule Cora -carente sono state esposte a supernatanti da entrambi Starved wild-type o cellule Cora -carente 10 (figura 4). Questi surnatanti sono iniziatori potenti di formazione di aggregati multicellulare e quindi contengono fattori che avviano percorsi di segnalazione di sviluppo a valle, tra cui la segnalazione cAMP. I nostri risultati mostrano che il surnatante dalle cellule Cora -carente era ugualmente in grado di indurre lo sviluppo come è stato il caso per il surnatante dalle cellule wild-type (Figura 4). Questo implica che CORA -cellule carenti sono in grado di produrre e secernere fattori fame primi a livelli simili ai loro controlli wild-type. Tuttavia, le cellule CoRA -carente non sono né in grado di rispondere alla propria surnatante né di surnatante fornite dalle cellule wild-type (Figura 4). Pertanto, Coronin A sembra essere coinvolto in vie di segnalazione indotte da fattori fame primi, piuttosto che la loro espressione / secrezione 10 (Figura 5).
In generale, per essere in grado di approfondire i segnali secrete dalle cellule di fame Dictyostelium che inducono il ciclo di sviluppo, il test di aggregazione in condizioni sommerse è un potente read-out. Cellule seminate a densità più elevate spontaneamente aggregato a causa di una grande varietà di tutti i segnali necessari. Tuttavia, a densità inferiori solo l'aggiunta di mezzo condizionato indurrà l'aggregazione cellulare (Figura 4) 22,24
Figura 1: proteine Coronin presenti nei mammiferi e Dictyostelium discoideum La famiglia Coronin è caratterizzato dalla presenza di regioni WD-repeat N-terminale seguito da un dominio unico ed una regione coiled coil C-terminale.. Mentre i mammiferi Express 7 proteine Coronin (A), Dictyostelium discoideum contiene solo due membri della famiglia (B), rendendo il rischio di licenziamento meno probabile quando si studia la loro funzione. Coronin A è il ortologo di Coronin mammiferi 1 e Coronin B mostra una struttura di dominio simile a Coronin 7. Abbreviazioni: CC, dominio coiled-coil; UD, unico dominio; WD ripete, triptofano ripete -aspartate. Lunghezza è dato per sequenze di topo (A) in aminoacidi (aa). Modificato da Pieters et al., 2013 12. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. CORA - discoideum Dictyostelium sono in grado di aggregare durante la risposta di inedia primi Wild-tipo (A) o (B), le cellule di Dictyostelium Cora -carente sono state seminate in piastre a pozzetti multipli ad una densità di 2 x 10 5 cellule / cm 2, fame nel BSS, e ripreso in un periodo di 20 ore. Barra di scala = 100 micron..jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: esternamente applicata cAMP pulsa il salvataggio del primo difetto di sviluppo di Cora - discoideum Dictyostelium Vegetativo wild-type (A e B) e le cellule Cora -carente (C e D) sono stati lavati e fame per 2 ore prima di essere pulsato con (B. e D) o senza (a e C) 50 nM cAMP durante 5 ore ogni 6,5 min in sospensione. Le cellule sono state quindi lavate, risospese in BSS, e posti su un piatto Petri ad una densità di 10 x 10 4 cellule / cm 2. Le immagini sono state prese 20 ore dopo la semina delle cellule. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cora -carente Dictyostelium discoideum sono in grado di produrre tutti i fattori necessari per l'induzione di sviluppo, ma non sono in grado di rispondere alle loro crescita esponenziale wild-type e le cellule Corà -carente sono state lavate in PBM e seminati in piastre a pozzetti multipli ad una densità di (. 5, 10, 20, o 40) x 10 4 cellule / cm 2, incubati in mezzo condizionato ottenuto da wild-type (a) o le cellule che muoiono di fame Cora -carente (B). Le immagini sono state prese 16 ore dopo la semina delle cellule. Barra di scala = 100 micron.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Il modello attuale di Coronin Una funzione in Dictyostelium discoideum Coronin A è coinvolta nella trasduzione del segnale del fattore (s) secreto durante la risposta di inedia presto porta alla induzione della cascata cAMP e la progressione attraverso il ciclo di sviluppo. Modificato da Vinet et al. 2014 10. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le proteine Coronin si trovano nella maggior parte dei taxa del clade eucariotica. Dictyostelium discoideum Coronin A, l'omologo di Coronin mammiferi 1, è coinvolto nella risposta di inedia in anticipo, dal momento che Coronin Un deficit di cellule non sono in grado di formare centri di aggregazione durante l'inizio dello sviluppo ciclo 10. Per essere in grado di valutare quantitativamente e con precisione il ritardo di sviluppo tra i ceppi, un set-up microscopio imaging cellulare dal vivo con il controller palcoscenico automatizzato è uno strumento essenziale.
D. discoideum utilizza campo come una molecola essenziale di segnalazione durante le diverse fasi del suo ciclo di vita 1-4. Uno dei punti di controllo in cui è richiesta cAMP è la transizione da una singola cella per la formazione di strutture multicellulari. L'insorgenza di onde campo dopo ~ 6 ore di fame viene rilevata dalle cellule e fornisce il segnale chemiotattico di muoversi verso un centro di aggregazione 5. questi cAMPle onde possono essere imitate sperimentalmente dal pulsare di fame D. cellule discoideum con campo ogni 6,5 min per un periodo di 5 ore 8,9. Utilizzando questa procedura è importante fame le cellule fino a 2h prima di applicare gli impulsi cAMP, per ottenere risultati affidabili. Utilizzando questo set up sperimentale siamo stati in grado di dimostrare che Coronin Un agisce a monte della segnalazione cAMP, come questi impulsi applicati esternamente in salvo lo sviluppo di cellule Cora -carente (Figura 3 e 5). Questi risultati indicano inoltre che mentre Coronin A sembra avere un ruolo essenziale nel rilevare la risposta inedia precoce, è superflua per processi quali la chemiotassi e aggregazione cellulare per sé 10.
Il saggio di aggregazione per sé è un metodo affidabile per studiare lo sviluppo precoce di Dictyostelium discoideum. Tuttavia, ci sono diverse insidie che possono influenzare la riproducibilità di queste experiments, ed è quindi importante che diversi fattori sono presi in considerazione: l'età delle cellule svolge un ruolo importante quando si analizzano le cellule cora -carente. Queste cellule tendono a compensare il fenotipo e ri-aggregato di circa dopo 2 settimane dal punto vengono scongelati. La densità delle cellule è un fattore fondamentale pure, come cellule che mostrano un difetto di segnalazione e non un difetto chemiotattico potrebbero tendere ad aggregare a densità più elevate a causa della maggiore concentrazione di fattori primi fame. L'importanza del conteggio preciso e la diluizione di cellule in questi test non può essere esagerato. Per diversi ceppi, un adeguamento dei più variabili del test, come la densità delle cellule, il tempo di aderenza, il tempo di sviluppo, sarà richiesto. Il test di aggregazione, come descritto qui è una tecnica versatile che può essere modificato per soddisfare richieste diverse: le cellule possono essere affamati, o lo sviluppo possono essere stimolate o inibite utilizzando composti diversi, tuttigrazie per una specifica modulazione di aggregazione. Il qui descritto set-up permette anche approcci imparziali di identificare ceppi con i primi difetti di sviluppo, così come per l'identificazione di geni o fattori che sono importanti per lo sviluppo iniziale. Questo è anche grave inconveniente del metodo: il saggio aggregazione è una versione ridotta del ciclo di sviluppo completo. Pertanto, non è adatto per l'analisi dei fenotipi interessano fasi successive del ciclo di sviluppo. Il vantaggio principale è la possibilità di adottare il dosaggio aggregazione larga scala e formato automatizzato: in 48 pozzetti e 16 ore di sviluppo riscontrato durante l'imaging automatizzato, il saggio aggregazione rivela più tempo e risorse efficiente di sviluppo su piastre di agar.
Negli esperimenti in cui abbiamo scavalcato la risposta di inedia in anticipo, utilizzando impulsi di cAMP applicati esternamente, abbiamo dimostrato che Coronin A è coinvolta nella rilevazione dei fattori secreti dalle <em> cellule di Dictyostelium su fame. L'esatto meccanismo di Coronin A-mediata segnalazione durante la risposta di inedia precoce rimane poco chiaro. Diversi fattori coinvolti in questa fase di sviluppo sono stati studiati, in particolare fattore di mezzo condizionato (CMF) 25,26. Tuttavia, se la CMF agisce da solo o con co-fattori rimane poco chiara e la sua cascata di segnalazione è solo parzialmente compreso. Utilizzando la capacità di aggregazione delle cellule di Dictyostelium in condizioni sommerse qui descritto come un read-out positivo per lo sviluppo permette di condurre esperimenti di screening su larga scala in maniera tempo-efficiente rispetto a metodiche di aggregazione su superfici agar. Tuttavia, i saggi di aggregazione in condizioni sommerse hanno lo svantaggio di non rispettare il ciclo di sviluppo completo come cellule saranno arrestati nella fase di aggregazione iniziale. Pertanto, la tecnica qui descritta non è adatta per l'esame di seguito proce sviluppoSSES. In sintesi, l'approccio sperimentale documentato qui può consentire un'ulteriore caratterizzazione del potenziale fattore precoce fame (s) che inducono Coronin A-dipendente ingresso nella risposta di inedia in anticipo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
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