Abstract
Dictyostelium discoideum ameba são encontrados no solo, alimentando-se de bactérias. Quando as fontes de alimentos se tornam escassos, eles secretam fatores para iniciar um programa de desenvolvimento multicelular, durante o qual células individuais chemotax para os centros de agregação 1-4. Este processo é dependente da libertação de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 5. O AMPc é produzido em ondas através da acção concertada de adenilato-ciclase e fosfodiesterase, e liga-se a receptores de G cAMP acoplados à proteína 6,7. Um ensaio amplamente utilizado para analisar os mecanismos envolvidos no ciclo de desenvolvimento do Dictyostelium discoideum eucariota inferior é baseado na observação de agregação de células em condições submersas 8,9. Este protocolo descreve a análise do papel de coronin A no ciclo de desenvolvimento pela inanição em placas de cultura de tecidos imersos em solução salina equilibrada (BSS) 10. Coronin A é um membro da PR amplamente conservadaotein família de coronins que têm sido implicados numa grande variedade de actividades 11,12. Dictyostelium células que carecem coronin A são incapazes de formar agregados multicelulares, e este defeito pode ser resgatado por fornecimento de impulsos de AMPc, o que sugere que coronin A actua a montante do cAMP cascata 10. As técnicas descritas nestes estudos fornecem ferramentas robustas para investigar as funções das proteínas durante as fases iniciais do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum a montante da cascata do AMPc. Assim, a utilização deste ensaio de agregação pode permitir a um estudo mais aprofundado da coronin Uma função e fazer avançar nossa compreensão da biologia coronin.
Introduction
A família de proteínas coronin é altamente conservada durante toda eucariotas. Estas proteínas são caracterizadas pela presença de um triptofano-aspartato amino-terminal (WD) região seguido por uma região única ligado a um domínio em espiral espiralada carboxi-terminal contendo 13,14 repetir-(Figura 1). Coronins têm sido implicados numa variedade de funções celulares, incluindo a regulação do citoesqueleto e transdução de sinal 12. Nos mamíferos, até seis moléculas curtas coronin coronin (1-6), bem como um "conjunto" coronin 7, pode ser co-expressa 12,15. Coronin um membro da família é o mais extensivamente estudado, e foi mostrado para ser envolvido na destruição de agentes patogénicos, a sobrevivência das células T e sinalização neuronal. Como, exatamente, coronin 1 realiza estas actividades ainda não está claro. Enquanto coronin 1 foi mostrado para regular Ca 2+ e de sinalização dependente de cAMP, bem como de F-actina do citoesqueleto modulação 16-18, o potencial de co-expression de até 7 membros da família em mamíferos tornou-se um desafio para estudar a função molecular de coronins nesses sistemas, devido a potenciais despedimentos. Ao contrário de organismos de mamíferos, o discoideum eucariota Dictyostelium inferior expressa apenas dois membros coronin familiares (coronin A, o ortólogo de mamífero coronin 1 e coronin B, ort�logo de coronin mamíferos 7) com funções aparentemente não redundantes 15,19,20. Este fato faz com Dictyostelium discoideum um modelo potente para estudar a função dos coronins.
Para estudar o papel de coronin A em Dictyostelium discoideum, que induziu o ciclo de desenvolvimento pela inanição em placas de cultura de tecidos contendo solução de sal equilibrada tampão (BSS) usando quer células do tipo selvagem ou de células sem coronin Um 10. Descobrimos que as células sem coronin A foram incapazes de formar agregados multicelulares sobre fome. Para uma avaliação quantitativa exacta deste fenótipoimagens de células vivas automatizado descrito neste protocolo é uma ferramenta vital. O defeito na iniciação da resposta de fome no início de células sem coronin A pode ser resgatado por fornecimento de impulsos de AMPc, o que sugere que coronin A actua a montante da cascata do AMPc. A aplicação exógena de impulsos de campo para simular a iniciação do desenvolvimento tem sido utilizado por vários laboratórios no passado 8,9. No entanto, este procedimento é também conhecido por ser altamente dependente da densidade das células e de temporização. Portanto, o protocolo aqui descrito destina-se a reduzir estes variabilidades, a fim de garantir um elevado grau de reprodutibilidade. Tomadas em conjunto, as técnicas utilizadas nestes estudos fornecem ferramentas robustas para investigar as funções das proteínas durante as fases iniciais do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum e tem o potencial para identificar para cima, bem como efectores a jusante de coronin uma função.
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Protocol
- Observe a resposta de fome precoce de Dictyostelium discoideum por microscopia de lapso de tempo.
- Cultivar células DH1.10 ou células cora -deficient num balão de Erlenmayer contendo HL-5 meio (para 1 L: 5 g de proteose peptona, 5 g thiotone E peptona, 10 g de glicose, 5 g de extracto de levedura, 0,35 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g de KH 2 PO 4, 0,05 g de sulfato de di-hidroestreptomicina-, pH 6,6) a 22 ° C numa incubadora com agitação com uma rotação de 160 rpm. Manter as células a uma densidade entre 0.01 x 10 6 células / ml e 2 x 10 6 culas / ml.
- Examinar a agregação de células, por meio da colheita de log-fase de cultivo de células DH1.10 21 ou cora as células -deficient 10 gerado no fundo DH1.10, crescidas em cultura com agitação com HL-5 forma a 22 ° C. Para fazer isso, tomar uma quantidade apropriada de células (normalmente entre 10 e 50 ml), centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar as células duas vezes em BSS (10 mM de NaCl, 10 mM de KCl, CaCl 2 2,5 mM, pH 6,5).
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Subsequentemente, as células em placas a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Permitir-lhes a aderir durante 1 hora a 22 ° C no BSS.
- Visualize a agregação por microscopia de lapso de tempo, tal como descrito antes de 10, a tomada de imagens a cada 135 segundos. utilizando uma imagem de células vivas configurar equipada com objectiva 5X e uma câmara de dispositivo de carga acoplada de multiplicação de electrões automatizado pelo software adequado (ver Materiais Tabela).
- pulsante AMPc das células Dictyostelium discoideum durante inanição.
- Examinar o efeito de impulsos de cAMP aplicados externamente sobre o desenvolvimento de células DH1.10 21 ou DH1.10 Cora -deficient células 10, por colheita de células. Para fazer isso, tomar uma quantidade apropriada de células (normalmente entre 10 e 50 ml), centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar duas vezes em BSS.
- Count células utilizando um hemocitómetro e ressuspender as células a uma densidade de 1 x 10 7 células / mL em BSS. Agitar as culturas (160 rpm) a 22 ° C durante 2 h antes de aplicar pulsos. Adicionar pulsos de cAMP utilizando uma bomba peristáltica controlado temporizador. Programar a bomba para fornecer um impulso de 5 segundos a cada 6,5 min de 15 uL de 50 nM de cAMP (concentração final) durante um período de 5 horas.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Subsequentemente, a chapa células a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Permitir a aderir durante 1 h em BSS.
- Visualizar a agregação após 16 horas a 22 ° C por microscopia de campo brilhante utilizando uma objectiva de 5x.
- Indução de Dictyostelium discoideum desenvolvimento através da exposição ao meio condicionado.
- Prepare meio condicionado fresco como descrito 22. Coletar células DH1.10 de fase log 21 ou DH1.10 Cora -deficient células 10, de tremer cultmentos com HL-5 forma a 22 ° C, utilizando uma pipeta, centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar as células três vezes em PBM (fosfato de potássio 0,02 M, 10 mM de CaCl2, e 1 mM de MgCl2, pH 6,1).
- Células utilizando um hemocitómetro Contagem, ressuspender estas em PBM a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml e agita-se durante 20 h a 110 rpm / 22 ° C.
- Recolhe meio condicionado após a centrifugação a 400 x g durante 3 min e clarificar por centrifugação a 8000 × g durante 15 min a 4 ° C.
- Filtrar o meio condicionado através de um filtro de 0,45 um (ver Tabela Materiais) e dilui-se três vezes em PBM.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro e placa a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Lhes permitem aderir durante 1 hora a 22 ° C.
- Troca de sobrenadante das células com o meio condicionado previamente preparada.
- Visualize a agregação de umepois de 16 horas por microscopia de campo brilhante usando uma objetiva de 5X.
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Representative Results
As células deficientes em coronin Um show de um defeito no desenvolvimento inicial (Figura 2). Na ausência de um coronin células são incapazes de formar agregados multicelulares, que é o passo inicial durante o ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum. Portanto, coronin Um parece desempenhar um papel durante a resposta precoce fome e / ou a sinalização de cAMP. Com efeito, a falta de formação de agregados multicelulares na ausência de coronin A é acompanhada por uma redução da sinalização de cAMP 10. No entanto, a aplicação de pulsos de cAMP exógenos restaura completamente o fenótipo de tipo selvagem (Figura 3). Isto implica que coronin A, em vez de ser directamente envolvido na sinalização de cAMP, as funções a montante da cascata do AMPc (Figura 5). Quando as células Dictyostelium estão expostos a condições famintos eles induzem a secreção de fome no início factores 22,23. Um dos melhores characterized factores envolvidos na resposta precoce inanição é condicionado factor de forma (CMF) 22. Com base nos nossos resultados, a hipótese de que coronin Um quer regula a secreção de factores de fome estes primeiros ou está envolvido na transdução de sinal induzida por estes factores. A fim de ser capaz de diferenciar entre estes dois efeitos que realizada condicionado experiências médias. Células Cora -deficient de tipo selvagem ou foram expostos a sobrenadantes de células quer Cora -deficient 10 (Figura 4) do tipo selvagem faminto ou. Estes sobrenadantes são iniciadores potentes da formação de agregados multicelulares e, por conseguinte, conter factores que iniciam vias de sinalização a jusante de desenvolvimento, incluindo a sinalização de cAMP. Os nossos resultados mostram que o sobrenadante das células cora -deficient foi igualmente capaz de induzir o desenvolvimento, como foi o caso para o sobrenadante a partir de células do tipo selvagem (Figura 4). Isto implica que Cora -células deficientes são capazes de produzir e segregar factores de fome início a níveis semelhantes aos seus controlos do tipo selvagem. No entanto, as células cora -deficient não são nem capaz de responder ao seu próprio sobrenadante nem ao sobrenadante fornecida a partir de células do tipo selvagem (Figura 4). Portanto, coronin Um parece estar envolvida nas vias de sinalização induzidas por factores de fome início, em vez de a sua expressão / secreção de 10 (Figura 5).
Em geral, para ser capaz de investigar ainda mais os sinais secretadas por células de Dictyostelium fome que induzem o ciclo de desenvolvimento, o ensaio de agregação em condições submersas é um potente de leitura. Células semeadas em densidades mais elevadas espontaneamente agregado, devido a uma abundância de todos os sinais necessários. No entanto, a densidades inferiores apenas a adição de meio condicionado irá induzir agregação celular (Figura 4) 22,24
Figura 1: Coronin proteínas presentes em mamíferos e Dictyostelium discoideum coronin A família é caracterizado pela presença de regiões de repetição WD-N-terminal seguido por um domínio único e uma região em espiral enrolada de terminal-C.. Enquanto os mamíferos expressar 7 proteínas coronin (A), Dictyostelium discoideum contém apenas dois membros da família (B), tornando o risco de redundância menos provável quando se estuda a sua função. Coronin A é o ortólogo de coronin mamíferos 1 e coronin B mostra uma estrutura de domínio semelhante ao coronin 7. Abreviaturas: CC, domínio de hélice enrolada; UD, de domínio exclusivo; WD repete, triptofano repete-aspartato. Comprimento é dado para as sequências de rato (A) em aminoácidos (AA). Modificado de Pieters et al., 2013 12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Cora - Dictyostelium discoideum são incapazes de agregar durante a resposta de fome precoce do tipo selvagem (A) ou (B) células de Dictyostelium Cora -deficient foram semeadas em placas com múltiplas cavidades a uma densidade de 2 x 10 5 células / cm2, fome em BSS e trabalhada ao longo de um período de 20 h. Barra de escala = 100 pm..jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: aplicado externamente cAMP pulsa resgatar o defeito de desenvolvimento precoce de Cora - Dictyostelium discoideum do tipo selvagem vegetativo (A e B) e células Cora -deficient (C e D) foram lavadas e carente de 2 horas antes de ser pulsadas com (B. e D) ou sem (a e C) 50 nM de cAMP durante 5 h a cada 6,5 min na suspensão. As células foram então lavadas, ressuspensas em BSS, e colocados numa placa de Petri a uma densidade de 10 x 10 4 células / cm2. As imagens foram recolhidas 20 horas após a inoculação das células. Barra de escala = 100 ^ m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cora -deficient Dictyostelium discoideum é capaz de produzir todos os fatores necessários para a indução do desenvolvimento, mas são incapazes de responder a elas crescimento exponencial do tipo selvagem e células Cora -deficient foram lavadas em PBM e semeadas em placas de múltiplos poços a uma densidade de (. 5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2, incubadas em meio condicionado obtido a partir do tipo selvagem (a) ou as células que passam fome Cora -deficient (B). As imagens foram tiradas 16 horas após a sementeira das células. Barra de escala = 100 pm.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Modelo actual de Coronin Uma função em Dictyostelium discoideum Coronin A está envolvida na transdução de sinal de factor (es) secretado durante a resposta precoce inanição levando à indução da cascata do AMPc e a progressão através do ciclo de desenvolvimento. Modificado de Vinet et al., 2014 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As proteínas coronin são encontrados na maioria dos taxa do clado eucariótica. Dictyostelium discoideum coronin A, o homólogo de coronin mamíferos 1, está envolvida na resposta de fome precoce, uma vez que coronin Um deficiente em células não são capazes de formar centros de agregação durante o início do desenvolvimento ciclo 10. Para ser capaz de avaliar quantitativamente e com precisão o atraso no desenvolvimento entre as cepas, um microscópio imagens de células vivas set-up com o controlador de estágio automatizado é uma ferramenta essencial.
D. discoideum utiliza cAMP como uma molécula de sinalização essencial durante vários estágios de seu ciclo de vida 1-4. Um dos pontos de controlo durante o qual o cAMP é necessário é a transição a partir de uma única célula para a formação de estruturas multicelulares. O aparecimento de ondas acampamento depois ~ 6 horas de fome é detectado pelas células e fornece o sinal quimiotático de avançar para um centro de agregação 5. estes cAMPondas pode ser mimetizado experimentalmente por pulsando fome D. células discoideum com o acampamento a cada 6,5 min durante um período de 5h 8,9. Utilizando este procedimento, é importante para privar as células de até 2h antes de aplicar os impulsos de cAMP, a fim de obter resultados fiáveis. Utilizando esta montagem experimental, fomos capazes de mostrar que A é coronin actuando a montante da sinalização de cAMP, como estes impulsos aplicados externamente resgatou o desenvolvimento em células cora -deficient (Figura 3 e 5). Estes resultados também indicam que enquanto coronin A parece ter um papel essencial na detecção da resposta de fome no início, é dispensável para os processos tais como a quimiotaxia e a agregação das células, por si só 10.
O ensaio de agregação em si é um método robusto para estudar o desenvolvimento precoce de Dictyostelium discoideum. No entanto, existem várias armadilhas que podem influenciar a reprodutibilidade destes experiments, e por isso é importante que vários fatores são levados em conta: a idade das células desempenha um papel importante na análise de células Cora -deficient. Estas células tendem a compensar o fenótipo e re-total, aproximadamente após 2 semanas a partir do ponto que eles são descongelados. A densidade das células é um factor crucial, assim, como as células que exibem um defeito de sinalização e não um defeito quimiotáctico pode tendem a agregar a densidades mais elevadas devido à concentração aumentada de factores de fome início. A importância da contagem precisa e diluição das células nestes ensaios não pode ser exagerada. Para diferentes estirpes, um ajuste de múltiplas variáveis do ensaio, tais como densidades celulares, o tempo de aderência, o tempo de desenvolvimento, serão necessários. O ensaio de agregação como descrito aqui é uma técnica versátil, que pode ser modificado para se adequar a diferentes investigações: as células podem ser fome, ou desenvolvimento pode ser estimulada ou inibida utilizando diferentes compostos, todosdevido a uma modulação específica de agregação. O aqui descrito set-up também permite abordagens imparciais para identificar estirpes com defeitos precoces de desenvolvimento, bem como para a identificação de genes ou factores que são importantes para o desenvolvimento inicial. Esta é também grande desvantagem do método: o ensaio de agregação é uma versão reduzida do ciclo de desenvolvimento completo. Portanto, não é adequado para a análise de fenótipos que afectam estágios posteriores do ciclo de desenvolvimento. A principal vantagem é a possibilidade de adoptar o ensaio de agregação em grande escala e formato automatizado: em placas de 48 poços e com 16 horas de evolução verificada durante a imagem automatizado, o ensaio de agregação revela-se mais tempo e recursos eficientes do que o desenvolvimento de placas de agar.
Em experiências em que a resposta de fome inibidos cedo, utilizando impulsos de cAMP aplicados externamente, que mostrou que coronin A está envolvida na detecção de factores segregados por <em> células Dictyostelium sobre fome. O mecanismo preciso de coronin sinalização mediada por uma resposta durante a fome precoce permanece obscura. Vários fatores envolvidos durante esta fase de desenvolvimento têm sido estudadas, em particular fator de meio condicionado (CMF) 25,26. No entanto, se CMF age por conta própria ou com co-fatores permanece obscuro e sua cascata de sinalização é apenas parcialmente compreendida. Usando a capacidade de agregação de células de Dictyostelium sob condições submersas aqui descrito como um positivo read-out para o desenvolvimento permite a realização de experiências de rastreio em grande escala de uma maneira rápida e eficiente, em comparação com ensaios de agregação em superfícies de agar. No entanto, os ensaios de agregação em condições submersas têm a desvantagem de não cumprir o ciclo de desenvolvimento completo como células será preso na fase inicial de agregação. Portanto, a técnica aqui descrita não é apropriada para a análise de proce desenvolvimento posteriorsses. Em resumo, a abordagem experimental aqui documentado pode permitir a caracterização adicional do potencial de factor (es) que induz início inanição coronin entrada dependente de A para a resposta precoce inanição.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
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