Abstract
Dictyostelium discoideum amebas se encuentra en el suelo, se alimentan de bacterias. Cuando las fuentes de alimentos se vuelven escasos, secretan factores de iniciar un programa de desarrollo pluricelular, durante el cual las células individuales chemotax hacia los centros de agregación 1-4. Este proceso es dependiente de la liberación de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) 5. cAMP se produce en ondas a través de la acción concertada de la adenilato ciclasa y las fosfodiesterasas, y se une a receptores de cAMP acoplados a proteínas G 6,7. Un ensayo ampliamente utilizado para analizar los mecanismos implicados en el ciclo de desarrollo del menor eucariota Dictyostelium discoideum se basa en la observación de la agregación celular en condiciones sumergidas 8,9. Este protocolo describe el análisis de la función de coronin A en el ciclo de desarrollo por el hambre en placas de cultivo de tejidos sumergidos en solución salina equilibrada (BSS) 10. Coronin A es un miembro de la pr ampliamente conservadafamilia Otein de coronins que han sido implicados en una amplia variedad de actividades de 11,12. Dictyostelium células que carecen de Coronin A no son capaces de formar agregados multicelulares, y este defecto puede ser rescatado por el suministro de pulsos de cAMP, lo que sugiere que Coronin A actúa aguas arriba de la cAMP en cascada 10. Las técnicas descritas en estos estudios proporcionan herramientas robustas para investigar funciones de las proteínas durante las etapas iniciales del ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum aguas arriba de la cascada de AMPc. Por lo tanto, la utilización de este ensayo de agregación puede permitir el estudio adicional de coronin una función y avanzar en nuestra comprensión de la biología coronin.
Introduction
La familia de proteínas coronin está altamente conservada en todo eucariotas. Estas proteínas se caracterizan por la presencia de un triptófano-aspartato amino-terminal (WD) región seguido de una región única conectado a un dominio espiral de la bobina carboxi-terminal 13,14 repetir que contienen (Figura 1). Coronins han sido implicados en una variedad de funciones celulares, incluyendo la regulación del citoesqueleto y la transducción de señales 12. En los mamíferos, hasta seis moléculas cortas coronin (coronin 1-6), así como un 'tándem' coronin 7, se pueden co-expresaron 12,15. Coronin 1 es el miembro de la familia más ampliamente estudiado y ha demostrado estar implicado en la destrucción de patógenos, la supervivencia de las células T y la señalización neuronal. ¿Cómo, exactamente, coronin 1 lleva a cabo estas actividades aún no está claro. Mientras coronin 1 se muestra para regular Ca2 + y cAMP-dependiente de señalización, así como F-actina del citoesqueleto de modulación 16-18, el potencial de co-expresión de hasta 7 miembros de la familia de los mamíferos ha hecho que sea difícil para el estudio de la función molecular de coronins en estos sistemas, debido a las posibles redundancias. A diferencia de los organismos mamíferos, la discoideum eucariota inferior Dictyostelium expresa sólo dos miembros de la familia (coronin coronin A, el ortólogo de mamífero coronin 1 y coronin B, el ortholog de mamíferos coronin 7) con funciones aparentemente no redundantes 15,19,20. Este hecho hace que Dictyostelium discoideum un modelo potente para estudiar la función de coronins.
Para estudiar el papel de coronin A en Dictyostelium discoideum, se indujo el ciclo de desarrollo por el hambre en placas de cultivo de tejidos que contienen tampón de equilibrado solución salina (BSS) utilizando ya sea células de tipo salvaje o células que carecen de Coronin A 10. Se encontró que las células que carecen coronin A no fueron capaces de formar agregados multicelulares a la inanición. Para una evaluación cuantitativa exacta de este fenotipo laimágenes de células vivas automatizado descrito en este protocolo es una herramienta vital. El defecto en la iniciación de la respuesta del hambre temprano en las células que carecen Coronin A puede ser rescatado por el suministro de pulsos de cAMP, lo que sugiere que Coronin A actúa aguas arriba de la cascada de AMPc. La aplicación exógena de pulsos de AMPc para simular el inicio del desarrollo ha sido utilizado por varios laboratorios en el pasado 8,9. Sin embargo, este procedimiento también es conocido por ser dependiente de las densidades de células y el tiempo altamente. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí tiene como objetivo reducir estas variabilidades con el fin de garantizar un alto grado de reproducibilidad. En conjunto, las técnicas utilizadas en estos estudios proporcionan herramientas robustas para investigar funciones de las proteínas durante las primeras etapas del ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum y tienen el potencial de identificar arriba, así como efectores aguas abajo de Coronin una función.
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Protocol
- Observar la respuesta del hambre a principios de Dictyostelium discoideum por microscopía de lapso de tiempo.
- Se cultivan las células o células DH1.10 Cora-deficiente en un erlenmeyer que contiene HL-5 medio (para 1 litro: 5 g de peptona proteosa, 5 g thiotone E peptona, 10 g de glucosa, 5 g de extracto de levadura, 0,35 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2 PO 4, 0,05 g dihidroestreptomicina-sulfato, pH 6.6) a 22 ° C en una incubadora de agitación con una rotación de 160 rpm. Mantener las células a una densidad entre 0,01 x 10 6 células / ml y 2 x 10 6 células / ml.
- Examinar la agregación de células, las células DH1.10 recolección de registro en fase de crecimiento o 21 células con deficiencia de Cora 10 generada en el fondo DH1.10, que se cultiva en un cultivo agitado con HL-5 medio a 22 ° C. Para ello, tomar la cantidad adecuada de células (por lo general entre 10 y 50 ml), se centrifuga durante 3 minutos a 400 xg y se lavan las células dos veces en BSS (NaCl 10 mM, KCl 10, CaCl 2,5 mM 2, pH 6,5).
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Posteriormente, las células de la placa a una densidad de (5, 10, 20, o 40) x 10 4 células / cm 2 en una placa de 24 pocillos. Deje que se adhieran durante 1 hora a 22 ° C en BSS.
- Visualizar la agregación mediante microscopía de lapso de tiempo como se describe antes de las 10, tomando imágenes cada 135 seg. utilizando una imagen de células vivas configurar equipado con el objetivo de 5X y una cámara de dispositivo de carga acoplada electrones multiplicando automatizado por el software apropiado (véase Tabla de Materiales).
- cAMP pulsante de las células de Dictyostelium discoideum durante la inanición.
- Examinar el efecto de los pulsos de cAMP aplicadas externamente en el desarrollo de las células o células DH1.10 21 10 DH1.10 Cora-deficiente, por la recolección de las células. Para ello, tomar la cantidad adecuada de células (por lo general entre 10 y 50 ml), se centrifuga durante 3 minutos a 400 xg y lavar dos veces en BSS.
- Coucélulas nt utilizando un hemocitómetro y volver a suspender las células a una densidad de 1 x 10 7 células / ml en BSS. Agitar las culturas (160 rpm) a 22 ° C durante 2 horas antes de la aplicación de pulsos. Añadir pulsos de cAMP usando una bomba peristáltica controlada temporizador. Programar la bomba para entregar un impulso de 5 segundos cada 6,5 min de 15 l de 50 nM de cAMP (concentración final) durante un período de 5 horas.
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Posteriormente, la placa de las células a una densidad de (5, 10, 20, o 40) x 10 4 células / cm 2 en una placa de 24 pocillos. Permitir que se adhieran durante 1 hora en BSS.
- Visualizar la agregación después de 16 horas a 22 ° C por microscopía de campo brillante utilizando un objetivo de 5X.
- La inducción de Dictyostelium discoideum desarrollo a través de la exposición al medio condicionado.
- Preparar medio acondicionado fresco como se describe 22. Recoger las células en fase logarítmica DH1.10-21 o células 10 DH1.10 Cora-deficiente, el temblor de cultoUres con LH-5 medio a 22 ° C utilizando una pipeta, se centrifuga durante 3 minutos a 400 xg y lavar las células tres veces en PBM (0,02 M de fosfato de potasio, 10 mM de CaCl2 y MgCl2 1 mM, pH 6,1).
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro, volver a suspender estos en PBM a una densidad de 1 x 10 7 células / ml y agitar durante 20 horas a 110 rpm / 22 ° C.
- Recoger el medio acondicionado después de centrifugación a 400 xg durante 3 min y clarificar por centrifugación a 8000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Medio de filtro acondicionado a través de un filtro de 0,45 micras (ver Tabla de Materiales) y diluir triple en PBM.
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro y la placa a una densidad de (5, 10, 20, o 40) x 10 4 células / cm 2 en una placa de 24 pocillos. Deje que se adhieran durante 1 hora a 22 ° C.
- Cambio de sobrenadante de las células con el medio acondicionado preparado previamente.
- Visualizar la agregación de unaespués de 16 horas por microscopía de campo brillante utilizando un objetivo de 5X.
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Representative Results
Las células deficientes en coronin Un espectáculo de un defecto en el desarrollo temprano (Figura 2). En ausencia de Coronin A las células no son capaces de formar agregados multicelulares, que es el paso inicial durante el ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum. Por lo tanto, coronin A parece jugar un papel durante la respuesta del hambre temprano y / o la señalización de cAMP. De hecho, la falta de formación de agregados multicelulares en ausencia de coronin A se acompaña por la reducción de cAMP de señalización 10. Sin embargo, la aplicación de pulsos de AMPc exógenos restaura completamente el fenotipo de tipo salvaje (Figura 3). Esto implica que Coronin A, en lugar de estar directamente implicado en la señalización de cAMP, las funciones de aguas arriba de la cascada de AMPc (Figura 5). Cuando las células de Dictyostelium están expuestos a condiciones de hambre que inducen la secreción de factores de inanición temprana 22,23. Uno de los mejores characterized factores que intervienen en la respuesta del hambre temprana está condicionado factor de medio (CMF) 22. En base a los resultados, la hipótesis de que Coronin A o bien regula la secreción de estos factores de hambre primeros o está implicada en la transducción de señales inducida por estos factores. Con el fin de ser capaces de diferenciar entre estos dos efectos hemos realizado experimentos condicionados medianas. De tipo salvaje o células Cora-deficiente fueron expuestos a sobrenadantes de ya sea de tipo salvaje hambriento o células con deficiencia de Cora 10 (Figura 4). Estos sobrenadantes son potentes iniciadores de la formación de agregados multicelulares y por lo tanto contienen factores que inician la señalización de las vías descendentes del desarrollo, incluyendo la señalización cAMP. Nuestros resultados muestran que el sobrenadante de las células con deficiencia de Cora era igualmente capaz de inducir el desarrollo como fue el caso de sobrenadante de células de tipo salvaje (Figura 4). Esto implica que Cora -las células deficientes son capaces de producir y secretar factores de hambre primeros en niveles similares a los controles de tipo salvaje. Sin embargo, las células Cora-deficiente no son ni capaces de responder a su propia sobrenadante ni sobrenadante proporcionado a partir de células de tipo salvaje (Figura 4). Por lo tanto, coronin A parece estar implicado en las vías inducidas por factores de hambre principios de señalización, en lugar de su expresión / secreción de 10 (Figura 5).
En general, para poder investigar más a fondo las señales secretadas por las células de hambre Dictyostelium que inducen el ciclo de desarrollo, el ensayo de agregación en condiciones sumergidas es un potente lectura. Las células sembradas a densidades más altas se espontáneamente agregada debido a la abundancia de todas las señales necesarias. Sin embargo, a densidades más bajas sólo la adición del medio acondicionado se inducir la agregación celular (Figura 4) 22,24
Figura 1: proteínas Coronin presentes en mamíferos y Dictyostelium discoideum La familia coronin se caracteriza por la presencia de regiones de repetición WD-N-terminal seguido por un dominio único y una región de espiral de la bobina C-terminal.. Mientras que los mamíferos expresan 7 proteínas Coronin (A), Dictyostelium discoideum sólo contiene dos miembros de la familia (B), por lo que el riesgo de redundancia menos probable cuando el estudio de su función. Coronin A es el ortólogo de mamífero coronin 1 y coronin B muestra una estructura de dominio similar a coronin 7. Abreviaturas: CC, dominio espiral de la bobina; UD, dominio único; WD repite, triptófano aspartato repeticiones. Longitud se da para las secuencias del ratón (A) en los aminoácidos (aa). Modificado de Pieters et al., 2013 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Cora - Dictyostelium discoideum son incapaces de agregarse durante la respuesta de hambre a principios de tipo salvaje (A) o células de Dictyostelium Cora-deficiente (B) se sembraron en placas de múltiples pocillos a una densidad de 2 x 10 5 células / cm2, muerto de hambre en BSS y fotografiado durante un período de 20 horas. Barra de escala = 100 micras..jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: aplicar externamente cAMP impulsos de rescatar el defecto en el desarrollo temprano de la Cora - Dictyostelium discoideum de tipo salvaje vegetativo (A y B) y se lavaron las células con deficiencia de Cora (C y D) y en ayunas durante 2 horas antes de ser pulsadas con (B. y D) o sin (a y C) 50 nM cAMP durante 5 hr cada 6,5 min en suspensión. Después, las células se lavaron, se resuspendieron en BSS, y se colocan en una placa de Petri a una densidad de 10 x 10 4 células / cm 2. Las imágenes fueron tomadas 20 horas después de la siembra de las células. Barra de escala = 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cora-deficiente Dictyostelium discoideum son capaces de producir todos los factores necesarios para la inducción del desarrollo, pero son incapaces de responder a ellas en crecimiento exponencial de tipo salvaje y se lavaron las células con deficiencia de Cora en PBM y se sembró en placas de múltiples pocillos a una densidad de (. 5, 10, 20, o 40) x 10 4 células / cm 2, se incubaron en medio condicionado obtenido a partir de tipo salvaje (a) o células hambrientas cora-deficiente (B). Las imágenes fueron tomadas 16 horas después de sembrar las células. Barra de escala = 100 micras.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Actual modelo de Coronin Una función en Dictyostelium discoideum Coronin A está implicada en la transducción de señales del factor (s) secretada durante la respuesta del hambre temprano que conduce a la inducción de la cascada de AMPc y la progresión a través del ciclo de desarrollo. Modificado de Vinet et al., 2014 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las proteínas Coronin se encuentran en la mayoría taxones del clado eucariota. Dictyostelium discoideum coronin A, el homólogo de coronin de mamíferos 1, está implicado en la respuesta del hambre temprano, ya Coronin A-deficiente células no son capaces de formar centros de agregación durante el temprano desarrollo ciclo de 10. Para poder evaluar cuantitativamente y con precisión el retraso en el desarrollo entre las cepas, un microscopio de imágenes de células vivas puesta a punto con el controlador etapa automatizado es una herramienta esencial.
D. discoideum cAMP utiliza como una molécula de señalización esencial durante varias etapas de su ciclo de vida 1-4. Uno de los puntos de control durante el cual se requiere cAMP es la transición de una sola célula a la formación de estructuras multicelulares. El inicio de las ondas de cAMP después de ~ 6 horas de inanición es detectado por las células y proporciona la señal quimiotáctica para avanzar hacia un centro de agregación 5. estos cAMPlas ondas se pueden imitar experimentalmente mediante un pulso de hambre D. células discoideum con cAMP cada 6,5 min durante un período de 5 h 8,9. El uso de este procedimiento es importante comer a las células durante hasta 2 horas antes de aplicar los pulsos de campo, con el fin de obtener resultados fiables. La utilización de este montaje experimental hemos sido capaces de demostrar que coronin A está actuando aguas arriba de señalización cAMP, ya que estos impulsos aplicados externamente rescataron el desarrollo de células Cora-deficiente (Figura 3 y 5). Estos resultados también indican que mientras coronin A parece tener un papel esencial en la detección de la respuesta del hambre temprano, es prescindible para procesos tales como quimiotaxis y la agregación de células per se 10.
El ensayo de agregación en sí es un método robusto para estudiar el desarrollo temprano de Dictyostelium discoideum. Sin embargo, hay varias dificultades que pueden influir en la reproducibilidad de estos experimentos, y por ello es importante que varios factores se tienen en cuenta: la edad de las células desempeña un papel importante en el análisis de las células Cora-deficiente. Estas células tienden a compensar el fenotipo y re-agregado aproximadamente después de 2 semanas desde el punto que se descongelan. La densidad de las células es un factor crucial, así, como las células que muestran un defecto de señalización y no un defecto quimiotáctico podrían tender a agregarse en densidades más altas debido a la mayor concentración de factores de hambre temprana. La importancia de la cuenta precisa y la dilución de las células en estos ensayos no puede ser exagerada. Para diferentes cepas, un ajuste de múltiples variables del ensayo, tales como densidades de células, el tiempo de adherencia, el tiempo de desarrollo, se requerirá. El ensayo de agregación tal como se describe aquí es una técnica versátil que puede ser modificado para adaptarse a diferentes investigaciones: las células pueden ser de hambre, o el desarrollo pueden ser estimuladas o inhibidas usando diferentes compuestos, todosdebido a una modulación específica de la agregación. El aquí descrito configuración también permite enfoques imparciales para identificar cepas con defectos del desarrollo temprano, así como para la identificación de genes o factores que son importantes para el desarrollo temprano. Este es también inconveniente principal del método: el ensayo de agregación es una versión reducida del ciclo de desarrollo completo. Por lo tanto, no es adecuado para el análisis de los fenotipos que afectan a las etapas posteriores del ciclo de desarrollo. La principal ventaja es la posibilidad de adoptar el ensayo de agregación a gran escala y formato automatizado: en placas de 48 pocillos y con 16 h de evolución registrada durante la exploración automática, el ensayo de agregación resulta ser más tiempo y que el desarrollo de eficiente de los recursos placas de agar.
En experimentos en los que hemos dejado de lado la respuesta del hambre temprano, el uso de pulsos de cAMP aplicadas externamente, demostramos que coronin A está implicada en la detección de factores secretados por <em> células de Dictyostelium a la inanición. El mecanismo preciso de coronin de señalización A mediada durante la respuesta del hambre temprano sigue siendo poco clara. Varios factores que intervienen en esta etapa de desarrollo se han estudiado, en particular, factor de medio condicionado (CMF) 25,26. Sin embargo, si CMF actúa por sí solo o con co-factores aún no está claro y su cascada de señalización se entiende sólo en parte. El uso de la capacidad de agregación de las células de Dictyostelium en condiciones sumergidas aquí descritos como una lectura positiva para el desarrollo permite llevar a cabo experimentos de cribado a gran escala de una manera eficiente en el tiempo en comparación con los ensayos de agregación en las superficies de agar. Sin embargo, ensayos de agregación en condiciones sumergidas tienen la desventaja de no cumplir con el ciclo de desarrollo completo como células serán detenidos en la etapa inicial de agregación. Por lo tanto, la técnica descrita aquí no es adecuado para el examen de proce desarrollo más tardeEPE. En resumen, el enfoque experimental documentado aquí puede permitir una caracterización adicional de potencial factor de (s) temprana hambre que inducen coronin A-dependiente de la entrada en la respuesta del hambre temprano.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-5 media (for 1 L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4*2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4*2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
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