Summary
该原稿描述了在实验室小鼠前列腺显微解剖和手术去势的协议。我们还通过描绘这些协议产生代表性的结果。最后，我们讨论的优点和这些协议的利用率。
Introduction
前列腺是癌症在美国男性中最常见的部位。近22人，每年将被诊断患有前列腺癌，并且约27,000人会屈服于他们的疾病1。男人有美国1前列腺癌诊断的1/7的寿命风险。良性前列腺增生（BPH），前列腺的年龄有关的非癌性增大，也是一个普遍的状况，影响男性超过80％，超过80 2，因此，前列腺是相当多的研究的重点。
小鼠模型已被广泛用来研究前列腺3的疾病。总体而言，小鼠前列腺是人类腺4的优秀代表，但也有相似性和小鼠和人前列腺解剖学和生理学5之间的差异。在这两个物种中，前列腺位于膀胱的基础上，环绕尿道。人类前列腺是一个LO定，分为四个区域：中部，过渡，外设和前纤维肌性基质。与此相反，在小鼠前列腺包括在尿道周围的不同位置三次配对裂片：前壁，腹和背外侧。在细胞水平上，主要的区别在于，基底细胞至管腔细胞比在人为约1：1，但它是1：4小鼠6。鼠基质也是相对于人类的小鼠不同 - 人类有更广泛的平滑肌，而肌肉层是在小鼠前列腺薄得多。正确的识别，解剖和小鼠前列腺的处理是小鼠前列腺的研究是必不可少的。
激素水平显着影响在人类和小鼠中的前列腺的发育和内环境稳定。而雌激素似乎在前列腺发育7发挥作用，在前列腺的最重要的激素是睾酮。睾酮是腺发展的重要d维持。以下物理或化学去势，在成人前列腺apoptose的管腔细胞的约90％，和腺收缩。如果睾丸激素去势条件下重新引入个人，前列腺能自己再生满负荷生产。睾酮也似乎驱动前列腺癌，这是为什么雄激素剥夺疗法是一种常用的治疗策略。然而，许多前列腺癌成为去势抵抗性。此外，男性接受雄激素剥夺治疗前列腺癌的治疗经历的阉割和再生条件的周期。在小鼠中，手术去势，通过重新引入睾酮前列腺激素再生沿，是一个重要的工具，使用它来研究去势抗性和睾酮循环对前列腺的作用。
在本文中，我们将讨论并演示通过其中LOCAT适当的技术e和微解剖小鼠前列腺，以及通过外科手术阉割鼠标。
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Protocol
该协议符合并遵循约翰·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会的指导方针。
1.微解剖一个小鼠前列腺
- 安乐死的二氧化碳窒息或按照机构动物护理和使用指南替代批准的方法鼠标。
- 通过将销穿过每个四爪的针在仰卧位置到夹层板鼠标。
- 喷用70％乙醇的腹部。
- 握住钳下腹部的皮肤，并用剪刀通过皮肤切割和腹膜约1cm前阴茎的开通，注意不要剪的任何器官。
- 从下腹部，腹部到肋笼最多两侧切掉皮肤和腹膜，暴露腹腔。
- 识别膀胱和泌尿生殖道及脂肪等器官轻轻地移动到侧面揭露他们。
- USI吴钳，握在尿道口附近的基地输精管，和它扯下来。
- 与异性输精管重复。
- 使用镊子，小心地握膀胱和拉起来，同时使用剪刀通过气囊和腹侧前列腺（大约1cm膀胱的基部下面）下面尿道削减。
注：由于膀胱拉升，整个泌尿生殖道（包括膀胱，尿道，前列腺的所有叶和精囊的部分）将随之而来。可能会有一些阻力。 - 放置泌尿生殖道（UGT）到含有约5-10磷酸盐毫升缓冲盐水（PBS）60-100毫米的培养皿。
- 解剖显微镜下执行协议的其余部分。使用两个细镊子，一手一个。抓住镊子“像铅笔”，并停留在台式前臂，以稳住他们。
- 用细镊子定位UGT使得膀胱在上面，尿道朝下，和精囊定位在膀胱的两侧。
- 握一个镊子，仔细尿道拉出与其他钳远离脂肪没有撕掉的前列腺组织。注意：脂肪会出现“闪亮”相对于周围的组织。
- 一旦脂肪被去除，使用镊子撕前列腺两腹侧裂片之间的结缔组织和将它们分开。
- 以除去腹侧裂片之一，使用一个镊子夹住一个单一腹叶的尖端附近，并使用其他镊子夹住该叶在底部尽量靠近尿道越好。同时仍然夹持瓣的基础上，使用其他镊子夹住尿道。以坚定的，平滑的运动拉叶从尿道路程。确保没有前列腺组织仍然附着到尿道。放置叶到适当的介质中，根据下一次的实验步骤。
- 要修复和石蜡嵌入在S充足用于组织学分析，将在10％的中性缓冲的福尔马林（NBF）8瓣。
- 放置在冷冻介质中，例如OCT中，用于冷冻保存和切片8瓣。
- 将单细胞分离冷PBS耳垂文化或流式细胞仪9。
- 重复步骤1.15与其他腹叶。
- 要删除前叶中的一个，使用镊子轻轻一拉叶从精囊走，确保不要刺破精囊。一旦叶是独立的精囊，删除它以相同的方式如在步骤1.15腹侧叶。
- 重复步骤1.17与其它前叶。
- 翻转剩余泌尿生殖道通过使得背侧前列腺是可见的。
- 以除去背外侧裂片之一，使用镊子撕两个背外侧叶并凸角和叔之间的结缔组织之间的结缔组织他后路精囊的区域。以类似的方式在步骤1.15腹侧叶除去叶。
- 重复步骤1.20与其他背外侧叶。
2.手术阉割
注：这是一个生存的手术，所以无菌，麻醉和疼痛管理是该协议的道德和顺利完成至关重要。按照所有机构动物护理和使用指南。使用外部热源，如一个循环水毯，在外科手术过程中，以防止体温过低。无人看管，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物。不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到完全康复的动物。在手术前用高压灭菌所有的手术器械。
- 在一个无尘，无菌表面采用适当的措施（ 例如 2％异氟烷吸入）麻醉鼠标和M位置乌斯在仰卧位置。注意：可替代麻醉的方法，如氯胺酮，也可以使用，这取决于批准的动物协议。
- 按捏脚趾检查老鼠的反射。如果鼠标没有反应，继续执行下一步。如果它没有反应，等待1-3分钟，并再次检查。用电动剃须刀刮胡子手术区。
- 无菌制备使用由机构兽医人员或IACUC推荐70％的乙醇和碘或程序的交替磨砂鼠标的腹部。
- 用无菌解剖刀，使通过皮肤1cm的垂直切口在下腹的中线，大约1.5 cm前方阴茎。
- 做一个小切口（<1厘米）通过腹膜，注意不要剪的任何器官。
- 使用无菌镊子，把手腹膜的切割边缘并轻轻将其提起，以便能够下方看到腹膜腔。
- 使用另一无菌镊子，将手伸入日È腹膜腔和抓握左或右睾丸脂肪垫，横向于膀胱。直到睾丸出来，以及通过拉在腹膜和皮肤开幕脂肪垫。注意不要在这个步骤中可破坏任何其它组织或器官。
- 使用烧灼笔，通过持有睾丸脂肪垫切割。通过与烧灼笔注睾丸动脉慢切：如果睾丸动脉被切断太快，可能有太多的出血和鼠标可能不得不被安乐死。
- 一旦脂肪垫和动脉被切断，去除睾丸和脂肪垫。
- 重复步骤2.6-2.9与其他睾丸。注意：用于除去睾丸的另一种方法是通过手术结扎睾丸动脉，然后用剪刀切割容器中。
- 缝合腹膜与可吸收线缝合关闭。
- 装订皮肤封闭手术伤口剪辑。
- 辖止痛药管理的痛苦和地点鼠标在笼子里温暖5-10分钟一个干净的笼子。监测小鼠疼痛或出血的迹象。
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Representative Results
所有六个前列腺叶从经由前列腺显微解剖小鼠（ 图1）移除。完整的泌尿生殖道（UGT）由所有前列腺叶，膀胱，精囊和尿道（ 图1a）。输精管连接到尿道，但这是没有必要的前列腺显微解剖，并因此可以去除UGT之前通过削减尿道（ 图1b，1c）的分离。泌尿生殖道将保持一起一旦从腹部（ 图1d）中除去。在这一点上，UGT仍然覆盖脂肪组织，需要被去除以获得对前列腺叶（ 图1E）英寸所有六个叶片（腹侧，前壁，和背外侧对）可以看出包围气囊的基部尿道。纯的前列腺组织然后可以按照上述（ 图1F）的协议被删除。这些瓣可能被放置在用于进一步分析的适当介质。
阉割是切除睾丸，这是睾丸激素的主要生产商。睾酮存在于小鼠，直到发生去势，在该点处前列腺退化（ 图2a）。通过睾酮激素放归再生可以按照去势（ 图2b）。我们进行了阉割，随后激素再生的两个周期，和睾酮水平通过ELISA（ 图3）在小鼠血清监视。在阉割的条件下，睾丸激素水平几乎消失。可替代地，他莫昔芬（选择性雌激素受体调节剂）是表示向激素正常条件没有显著差异。阉割后，睾酮被重新引入到小鼠，导致睾酮水平穗大幅度（ 图3）。然后，我们显微切割前列腺升小鼠的OBE和成象它们作为单独的前叶（ 图4a）。我们还福尔马林固定，石蜡包埋，并切片的组织。 图4b示出在正常苏木精和伊红染色前的前列腺组织，阉割，和再生条件。去势的前列腺叶萎缩近似十分之一正常前列腺的大小和激素再生恢复前列腺到原来的大小。
图1：前列腺微解剖协议的总组织学 。 （ 一 ）在自然状态下的泌尿生殖道（UGT），在小鼠腹部露出。虚线包围UGT的各个部分，包括精囊（SV），前列腺叶（前前列腺（AP）和腹侧前列腺（VP）是可见这里），膀胱（B）和尿道（位于可尼思膀胱）。输精管（VD）也是可见的。 （ 二 ）输精管已被删除。箭头指向该区域从输精管已被删除。 （ 三 ）UGT已经从腹部切下的腹侧前列腺叶尿道被移除。 （d）本UGT已放置在PBS中，被认为是一个解剖显微镜之下。 （ 五 ）脂肪已从UGT除去，允许前列腺所有六个叶片的可见性。箭头指向两个前叶，腹侧裂片，以及背外侧瓣。 （f）所有六个独立前列腺叶已被删除。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：蒂姆ELINE去势和荷尔蒙再生。（ 一 ）睾酮出现在生理水平直至去势，当睾丸 激素消失，前列腺回归开始。 （ 二 ）阉割消除睾酮，睾酮之前重新引入，引起前列腺的荷尔蒙再生。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：在各种激素睾酮的条件 ELISA 睾酮的影响下，他莫昔芬，激素正常，阉割和激素再生的条件。再生×2指的是植入和去除合成睾酮，接着进行第二轮的合成睾酮植入。误差棒表示斯坦准偏差。这个数字已经从5修改。 请点击此处查看本图的放大版本。
图4：在阉割和再生条件前列腺外观前列腺前叶去势，激素正常，激素再生条件（ 一 ）总的外观。再生×2指的是植入和去除合成睾酮，接着进行第二轮的合成睾酮植入。 （ 二 ）福尔马林固定石蜡包埋前列腺前叶切片并用苏木和伊红染色。 请点击此处查看大- [R版本这个数字。
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Discussion
前列腺显微解剖允许特定瓣实验和小鼠前列腺的分析（ 图1）。在遗传工程小鼠模型，表型可能在未在其他见过叶中看到。此外，对于组织学分析，该协议确保了纯的前列腺组织的最大量可以被切片，染色，而不存在于所述部分中的其他泌尿生殖道的组织。最后，对于单细胞实验，该协议允许几乎纯质的前列腺细胞的分离。上皮细胞富集试剂盒可以进一步净化从基质细胞前列腺细胞。限制显微解剖包括必要使用解剖显微镜，和学习曲线用细镊子同时期待通过解剖显微镜。可替代地，前列腺组织可切片用于组织学的UGT的一部分，使得显微解剖不必要的。但是，缺点切片整个UGT的是，其它组织将存在于该部分中，使得它不干净。此外，用于产生单前列腺细胞群，凸起必须从UGT分开，以避免污染。
手术去势是很多前列腺研究实验室的一个基本的手术，是睾酮在前列腺发育和疾病的影响的研究是必不可少的。这个协议是快速（手术对于有经验的用户的典型时间为约5分钟），并移除睾酮几乎100％的从循环（图3）。值得注意的是，在小鼠中睾酮水平显著不同，并且可以通过从小鼠高达30倍至鼠标10而有所不同。阉割消除这种变化。去势之后，研究人员可以决定早在添加睾酮生成前列腺（ 图3 - 4）。这可以通过皮下植入睾酮，源来完成，例如渗透泵，睾酮沉淀，或含睾酮粉末8半透硅橡胶管中。取决于睾酮的添加量，此过程可以提供生理到superphysiological在循环（ 图3）的睾酮水平。该协议也可以用来研究前列腺细胞系和干细胞生物学11。另一种选择是化学去势，或雄激素剥夺疗法，通过治疗小鼠与抑制生产睾酮化合物，如度他雄胺12。这也模仿前列腺癌患者，谁也很少阉割手术的常见治疗方法。但是，手术去势提供用于除去几乎所有的睾酮的可靠的，永久的方法。考虑到肾上腺还合成雄激素物质，例如雄烯二酮和脱氢表，其可被转化成睾酮，虽然在更小的量，相对于睾丸是很重要13，在一些情况下，肾上腺也可手术切除，虽然此过程是比较困难的。
总体而言，这两个协议是无数的研究前列腺疾病，以及内分泌研究是有用的。这些协议来分析激素正常，阉割，或者激素再生条件前列腺生物学中的一个可靠和一致的方法。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
一些在本手稿的数字是慷慨巴特O.威廉姆斯的实验室提供。作者由美国国家癌症研究所授予U54CA143803，CA163124，CA093900，和CA143055支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
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