Summary
Bu el yazması laboratuvar fare prostat mikro diseksiyon ve cerrahi kastrasyon için protokolleri açıklar. Biz de bu protokoller tarafından üretilen temsilcisi sonuçları tasvir. Son olarak, biz avantaj ve bu protokollerin kullanımını tartışmak.
Introduction
Prostat ABD'de erkeklerde en sık görülen kanser sitedir. Her yıl prostat kanseri tanısı olacak yaklaşık 220.000 erkek ve yaklaşık 27.000 erkeklerin hastalığa 1 yenik düşer. Erkekler ABD 1 bir prostat kanseri tanısı 1 7 ömür boyu riski vardır. İyi huylu prostat hiperplazisi (BPH), prostat yaşla ilgili bir noncancerous genişleme, 80 2 üzerindeki erkeklerin% 80 üzerinde etkileyen, aynı zamanda yaygın bir durumdur. Bu nedenle, prostat önemli araştırmaların odak noktasıdır.
Fare model prostat 3 hastalıklar çalışma yaygın olarak kullanılmaktadır. Genel olarak, fare prostat insan bezinin 4 mükemmel bir temsilcisidir, fakat benzerlikler ve fare ve insan prostat anatomisi ve fizyolojisi 5 arasında farklar vardır. Her iki türde de, prostat üretra çevresindeki, mesane tabanında yer almaktadır. insan prostat bezi, tek bir lomerkezi, geçiş, periferik ve ön fibromusküler stroma: dört bölgeye ayrılmıştır olmak. anterior, ventral ve dorsolateral: aksine, fare prostat üretra etrafında farklı pozisyonlarda üç eşli lob oluşmaktadır. Hücresel seviyede, temel fark insan lümen hücre oranı bazal hücreli 1 olmasıdır: 1, fakat 1: Farelerde 6 4. fare stroma da insanlara göre farelerde farklı - kas tabakası fare prostat daha incedir iken insanlar, daha kapsamlı düz kas vardır. Fare prostat uygun bir şekilde tanımlanması, diseksiyon ve taşıma fare prostat araştırma için gereklidir.
Hormon düzeyleri ölçüde hem insanlarda hem farelerde prostat bezinin gelişim ve homeostazis etkiler. Östrojen prostat gelişiminde 7'de bir rol oynadığı gibi görünüyor olsa da, prostat en önemli hormonu testosteron olduğunu. Testosteron glandüler gelişimin için gereklidird bakım. ya fiziksel ya da kimyasal hadım etme sonra, yaklaşık 90 yetişkin prostat apoptoz luminal hücrelerin% ve bez küçülür. Testosteron hadım etme koşulları altında bir bireye yeniden ortaya çıkar, prostat tam kapasite kendini yeniden edebilmektedir. Testosteron ayrıca androjen baskılayıcı tedavi yaygın olarak kullanılan tedavi stratejisi neden olan prostat kanseri, sürücü görünüyor. Ancak, birçok prostat kanseri androjen yoksunluğu dayanıklı hale gelir. Buna ek olarak, prostat kanserinin tedavisi için androjen blokaj tedavisi gören hastalarda hadım edildi ve yeniden koşulları çevrimi geçirmektedir. Fare, cerrahi kastrasyon, testosteron yeniden devreye sokarak prostatın hormonal rejenerasyon ile birlikte, kastrasyon direnci ve prostat üzerinde testosteron bisiklet etkilerini incelemek amacıyla hangi ile önemli bir araçtır.
Bu yazıda tartışmak ve locat tarafından uygun teknikleri gösterecektirE ve mikro-tahlil fare prostat, hem de fare hadım cerrahi olarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol karşılar ve Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara uyar.
1. Fare Prostat Mikro diseksiyon
- Karbondioksit boğulma ya da kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun bir alternatif onaylı yöntemle fare Euthanize.
- Dört bacak her aracılığıyla bir iğne koyarak bir diseksiyon kurulu bir yatar pozisyonda fare sabitleyin.
- % 70 etanol ile karın püskürtün.
- forseps ile alt karın cildi tutun ve deri yoluyla kesilmiş ve herhangi bir organ kesmek için dikkatli penis açılması, yaklaşık 1 cm anterior periton için makas kullanın.
- periton boşluğuna açığa alt karın, göğüs kafesi karın kadar her iki taraftan deri ve periton kesip.
- mesane ve ürogenital yolu belirlemek ve yavaşça yanına yağ ve diğer organları hareket ettirerek maruz bırakmaktadır.
- using forseps, kavrama üretra yakın üssünde vas deferens ve uzak gözyaşı.
- ters vas deferens ile tekrarlayın.
- Aynı anda mesane ve ventral prostatın (mesane tabanının altında yaklaşık 1 cm) altında üretra yoluyla kesmek için makas kullanırken, dikkatli, mesane kavrama forseps kullanarak ve yukarı doğru çekin.
Not: Mesane çekti gibi, tüm ürogenital sistem (içeren mesane, üretra, tüm prostat loblar ve seminal vezikül bir bölümü) onunla gelecektir. Bazı direnç olabilir. - 5-10 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden bir 60-100 mm Petri kabı içine ürogenital sistem (UGT) koyun.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında protokolün kalan kısmını gerçekleştirin. İki ince forseps, her el birini kullanın. "Bir kalem gibi" forseps tutun ve onları sakinleştirmeye şekilde tezgah üstünde Dirseklerinizi bekletin.
- Mesane olduğunu UGT gibi konumlandırmak için ince forseps kullanınüzerine, idrar yolu basılı işaret edilmektedir, ve seminal veziküller mesane her iki tarafında konumlandırılmıştır.
- Kavrama bir forseps ve dikkatle ile üretra herhangi bir prostat dokusunu uzak yırtmadan diğer forseps ile uzak yağ çekin. Not: Yağ çevre dokuya "parlak" göreli görünecektir.
- yağ çıkarıldıktan sonra, prostat iki ventral lobları arasındaki bağ dokusunu gözyaşı ve onları ayırmak için forseps kullanabilir.
- Ventral lobları birini kaldırmak ucuna yakın kavrama tek bir ventral lobu bir forseps kullanabilir ve kavrama diğer forseps kullanmak için mümkün olduğunca üretraya yakın üssünde lob. hala lobun tabanını sıkarken, kavrama diğer forseps üretra kullanın. Bir firma, düzgün hareket ile uzak üretradan lob çekin. olmamasına dikkat prostat dokusu üretra bağlı kalır emin olun. Bir sonraki deneysel aşamada bağlı olarak uygun ortama lob yerleştirin.
- düzeltmek ve s parafin gömmek içinbol histolojik analiz için% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) 8 lob yerleştirin.
- Dondurulması için, OKT gibi orta, dondurma ve 8 kesit içinde lob yerleştirin.
- Kültür için tek bir hücre izolasyonu için soğuk PBS lob yerleştirin veya 9 akım sitometri.
- diğer ventral lobu ile adımı yineleyin 1.15.
- Emin seminal vezikül delmek değil yapım yavaşça seminal vezikül gelen lob çekmek için forseps kullanabilir, ön lob birini kaldırmak için. lob seminal vezikül bağımsız sonra, adım 1.15 ventral lob aynı şekilde çıkarın.
- diğer ön lob ile adımı yineleyin 1.17.
- dorsal prostat görünür şekilde üzerinde kalan ürogenital yolu çevirin.
- İki dorsolateral lob ve ayrıca loblar ve t arasındaki bağ dokusu arasındaki bağ dokusu gözyaşı forseps kullanabilir, dorsolateral lob birini kaldırmak içinO seminal vezikül posterior bölgeye. Adım 1.15 ventral lob olarak benzer bir şekilde lob çıkarın.
- diğer dorsolateral lob ile adımı yineleyin 1.20.
2. Cerrahi Hadımlaştırma
Not: Bu bir hayatta kalma ameliyat, bu nedenle asepsi, anestezi ve ağrı yönetimi, bu protokolün etik ve başarılı bir şekilde tamamlanması için önemlidir. tüm kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı yönergeleri izleyin. hipotermi önlemek için cerrahi işlem sırasında, böyle bir çevrimli su battaniye gibi harici ısı kaynağı kullanın. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. cerrahide Kullanmadan önce tüm cerrahi aletler otoklav.
- Temiz, steril bir yüzey üzerinde uygun önlemleri (örneğin% 2 inhale izofluran) kullanarak fare uyutmak ve m konumlandırmakBir yatar pozisyonda ouse. Not: ketamin gibi alternatif anestezi yöntemleri, de kullanılabilir, onaylanmış hayvan protokolüne göre.
- ayak kısma farenin refleksleri kontrol edin. Fare tepki vermezse, bir sonraki adıma geçin. o tepki vermezse, 1-3 dakika bekleyin ve tekrar kontrol edin. Bir elektrikli tıraş makinesi ile cerrahi alan tıraş.
- Aseptik kurumsal veteriner personel veya IACUC tarafından önerilen% 70 etanol ve iyot veya prosedürlerin alternatif scrubs kullanarak fare karın hazırlar.
- Steril bir neşter kullanılarak, penise, alt karın orta hattında yaklaşık 1.5 cm ön deri yoluyla 1 cm dikey bir kesi yapmak.
- Dikkatli herhangi organları kesmek için değil, periton içinden küçük bir kesi (<1 cm) olun.
- Steril forseps, kavrama periton kesim kenarı kullanılarak ve altındaki periton boşluğuna görmek mümkün olacak şekilde yavaşça yukarı kaldırın.
- başka bir steril forseps kullanarak, th içine ulaşmake mesaneye yanal periton boşluğu ve kavrama ya sol ya da sağ testis yağ yastığı. Testis yanı çıkana kadar periton ve deride açıklıktan yağ yastığı çekin. Bu adımı sırasında başka doku veya organ zarar vermemek için dikkatli olun.
- Bir koter kalemini kullanarak, testis tutan yağ yastığı kesti. koter kalem Not testis arter yoluyla yavaş yavaş Cut: testiküler arter çok hızlı kesilirse, orada çok fazla kanama olabilir ve fare ötenazi gerekebilir.
- yağ yastığı ve arter kesilir sonra, testis ve yağ yastığı çıkarın.
- Dier testisli 2,6-2,9 adımları. Not: Testis kaldırılması için alternatif bir yöntem, cerrahi makas ile kap kesme ardından testis arter bağlanması için olan.
- Periton emilebilir sütür ile kapatılır dikin.
- Zımba cilt cerrahi yara klipleriyle kapatılmıştır.
- ağrı yönetmek için bir ağrı kesici yönetme ve yer5-10 dakika sıcak bir kafes temiz bir kafeste fare. ağrı veya kanama belirtileri için fare izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Altı prostat lobları prostat mikro diseksiyon yoluyla bir fare (Şekil 1) çıkarıldı. Tam ürogenital sistem (UGT) tüm prostat loblar, mesane, seminal veziküller ve üretra (Şekil 1a) oluşmaktadır. Vaz deferens üretra verdiği, ancak prostat mikro diseksiyon için gereksizdir ve böylece idrar yolu (Şekil 1b-1c) keserek UGT sökülmeden önce ayrılabilir. Ürogenital sistem birlikte kalacağız kez karın (Şekil 1d) kaldırılır olacaktır. Bu noktada, UGT prostat lob (Şekil 1 E) erişmek için çıkarılması gereken, yağ dokusu, kaplı kalır. Altı loblar (ventral, ön ve dorsolateral çifti) mesane tabanındaki üretra çevresindeki görülebilir. Saf prostat dokusu daha sonra (Şekil 1 f) Yukarıdaki protokole göre temizlenebilir. Bu loblar olabilirdaha fazla analiz için uygun bir ortamda yerleştirilebilir.
Kastrasyon testosteron birincil üreticileri testisler, çıkarılmasıdır. Kastrasyon hangi prostat (Şekil 2a) geriler işaret oluşana kadar Testosteron fare mevcuttur. Testosteron yeniden yerleştirilmesi yoluyla hormonal rejenerasyon kastrasyon (Şekil 2b) takip edebilirsiniz. Bu hormon yenileme iki döngü, ardından hadım uygulandı ve testosteron düzeyleri ELISA (Şekil 3) fare serumunda izlenmiştir. kastrasyon koşullar altında, testosteron seviyeleri hemen hemen kaybolur. Seçenek olarak ise, tamoksifen (bir selektif östrojen reseptör modülatörü), hormonal, normal duruma önemli bir farklılık göstermektedir. Kastrasyon sonrası, testosteron testosteron düzeyleri önemli ölçüde (Şekil 3) başak neden fare yeniden tanıtıldı. Daha sonra prostat l mikro-dissekeFarelerin Obes ve bireysel ön lob (Şekil 4a) olarak görüntülenmiştir. Biz de, formalin ile fikse parafine gömülmüş ve doku kesitli. Şekil 4b normal koşullarda hematoksilen ve eozin lekeli ön prostat dokusunu gösterir, hadım ve koşulları yeniden. Hadım prostat lobları onda biri normal prostatın büyüklüğü yaklaştığı küçültmek ve bu hormonal rejenerasyon özgün boyutuna prostat geri yükler.
Şekil 1: Prostat Mikro diseksiyon Protokol Brüt Histoloji. (A) fare karın maruz doğal haliyle ürogenital sistem (UGT). Noktalı çizgiler () ön prostat (AP) ve ventral prostat (VP burada görülebilir) seminal veziküllerin (SV), prostat lobları da dahil olmak üzere UGT çeşitli bölümlerini kapsayacak (yer olması, mesane (B) ve üretra) Mesaneyi neath. vaz deferens (VD) da görülebilir. (B) vas deferens kaldırıldı. vas deferens çıkartılmış olduğu bölgeye okla. (C) UGT ventral prostat lobları altında üretra keserek karın kaldırıldı. (D) UGT PBS yerleştirildi ve bir diseksiyon mikroskobu altında görülmektedir. (E) Yağ prostat altı lob görüş sağlayan, UGT kaldırılmıştır. oklar iki ön lob, ventral lobları ve dorsolateral lob işaret ediyor. (F) altı ayrı prostat lobları kaldırıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: TimTestosteron kaybolur ve ne zaman kastrasyon ve hormonal Rejenerasyon için eline. Testosteron kastrasyon kadar fizyolojik seviyelerde mevcut (a), prostat regresyon başlar. Testosteron yeniden dahil edilinceye kadar, (b) Kastrasyon prostat hormonal rejenerasyon neden, testosteron kaldırır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Altında çeşitli hormonal Koşullar Testosteron ELISA Testosteron Düzeyleri, hormonal, normal tedavi hadım ve hormonal koşulları yeniden tamoksifen. Rejenere X 2, sentetik testosteron ikinci tur implantasyonu takiben, implantasyon ve sentetik testosteron çıkarılması anlamına gelir. Hata çubukları stan temsildard sapma. Bu rakam 5 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Kastrasyon ve Rejenerasyon Koşullarında Prostat Görünüm, kısırlaştırılmış hormonal normal ve hormonal rejenere şartlar altında ön prostat lob (a) Brüt görünüm.. Rejenere X 2, sentetik testosteron ikinci tur implantasyonu takiben, implantasyon ve sentetik testosteron çıkarılması anlamına gelir. (B) Formalin ile fikse, parafine gömülü ön prostat lobları kesitli ve hematoksilen ve eosin ile boyandı. Büyük görmek için buraya tıklayınızBu rakamın r sürümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prostat mikro diseksiyon lob özel deney ve fare prostat analizi (Şekil 1) sağlar. genetiği değiştirilmiş fare modellerinde, fenotipleri diğerlerinde görülmez bir lobun görülebilir. Ayrıca, histolojik analiz için, bu protokol, saf prostat dokusunun maksimum miktarı bölümünde mevcut olan diğer ürogenital sistem doku olmadan kesitli ve lekeli edilebilir olmasını sağlar. Son olarak, tek hücreli deneyler için, bu protokol hemen hemen saf prostat hücrelerinin izolasyonu sağlar. Epitel hücre zenginleştirme kitleri ayrıca stromal hücrelerinden prostat hücreleri arındırmak olabilir. Mikro-diseksiyon Sınırlamalar Diseksiyon mikroskobu bakarken ince forseps kullanmak için gerekli bir diseksiyon mikroskobu kullanımı ve öğrenme eğrisi bulunmaktadır. Seçenek olarak ise, prostat dokusu mikrodiseksiyon gereksiz hale UGT bir parçası olarak histoloji için kesitli olabilir. Ancak, tüm UGT kesit dezavantajı olduğunudiğer dokular o kadar temiz değil yapım bölümünde mevcut olacaktır. Buna ek olarak, tek bir prostat hücre popülasyonlarının üretilmesi için, loblar kirlenmeyi önlemek için UGT ayrılmalıdır.
Cerrahi kastrasyon birçok prostat araştırma laboratuarları için temel bir ameliyattır ve prostat gelişimi ve hastalık üzerine testosteronun etkisinin çalışması için gereklidir. Bu protokol (Deneyimli bir kullanıcı için ameliyat tipik süresi yaklaşık 5 dk), hızlı ve dolaşımdan testosteron neredeyse% 100'ünü (Şekil 3) kaldırır. Not, farelerde testosteron düzeyleri anlamlı farklılık, ve fare 10 fare olduğu kadar 30 kat değişebilir. Kastrasyon bu varyasyonu kaldırır. Kastrasyon ardından, araştırmacılar prostat (- 4 Şekil 3) yenilemek için geri testosteron eklemeye karar verebilir. Bu, bir ozmotik pompa, bir testosteron gibi testosteronun, bir kaynak implante deri altından yapılabilirTopak, veya testosteron tozu 8 ihtiva eden bir yarı-geçirgen bir silastik tüpü. Testosteron ilave miktarına bağlı olarak, bu prosedür, dolaşım (Şekil 3) testosteron düzeylerini superphysiological fizyolojik sağlayabilir. Bu protokol aynı zamanda prostat hücre soyu çalışma ve hücre biyolojisi 11 kök kullanılabilir. Başka bir seçenek de dutasteride 12 olarak testosteron üretimini önleyen bileşikler ile farelerin tedavisi ile kimyasal hadım etme veya androjen baskılayıcı tedavi vardır. Bu aynı zamanda nadiren cerrahi hadım edilir prostat kanseri hastalarının, ortak bir tedavi taklit eder. Ancak cerrahi hadım hemen hemen tüm testosteron çıkarılması için güvenilir ve sürekli bir yöntem sağlar. Böbreküstü bezleri de olsa, testis göre çok daha küçük miktarda, testosteron dönüştürülebilir androstenedion ve dehidroepiandrosteron gibi androjen türler, sentez olduğunu dikkate almak önemlidirBu prosedür daha zor olsa 13. Bazı durumlarda, böbreküstü bezleri de, ameliyatla alınabilir.
Genel olarak, bu iki protokol prostat hastalıklarının yapılan araştırmaların sayısız gibi hormon çalışmaları için de faydalıdır. Bu protokoller hadım, hormonal, normal ya da hormonal rejenere koşullarda prostat biyoloji analiz etmek için güvenilir ve tutarlı bir yoldur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu yazıda bazı rakamlar cömertçe Bart O. Williams laboratuvar tarafından sağlanmıştır. Yazarlar U54CA143803, CA163124, CA093900 VE CA143055 Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından verir desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Roehrborn, C. G.
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Drug discovery in prostate cancer mouse models. Expert Opin Drug Discov. , 1-14 (2015).
- El-Alfy, M., Pelletier, G., Hermo, L. S., Labrie, F. Unique features of the basal cells of human prostate epithelium. Microsc Res Tech. 51 (5), 436-446 (2000).
- Prins, G. S., Huang, L., Birch, L., Pu, Y. The role of estrogens in normal and abnormal development of the prostate gland. Ann N Y Acad Sci. 1089, 1-13 (2006).
- Valkenburg, K. C., et al. Activation of Wnt/beta-catenin signaling in a subpopulation of murine prostate luminal epithelial cells induces high grade prostate intraepithelial neoplasia. Prostate. 74 (15), 1506-1520 (2014).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5 (4), 702-713 (2010).
- Michiel Sedelaar, J. P., Dalrymple, S. S., Isaacs, J. T. Of mice and men--warning: intact versus castrated adult male mice as xenograft hosts are equivalent to hypogonadal versus abiraterone treated aging human males, respectively. Prostate. 73 (12), 1316-1325 (2013).
- Wang, X., et al. A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer. Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).
- Pascal, L. E., et al. 5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy. J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
