マウス前立腺マイクロ解剖と外科的去勢

Summary

この原稿は、実験用マウスにおける前立腺顕微解剖や去勢手術のためのプロトコルについて説明します。また、これらのプロトコルによって生成される代表的な結果を示しています。最後に、我々は長所と、これらのプロトコルの利用を議論します。

Introduction

前立腺は、米国における男性の癌の最も一般的な部位です。ほぼ22万男性毎年前立腺癌と診断され、約27,000人の男性は、自分の病気¹に屈するます。男性は米国¹における前立腺癌の診断の1 7の生涯リスクを持っています。良性前立腺肥大（BPH）、前立腺の年齢関連非癌性拡大は、80 ²以上の男性の80％に影響を及ぼし、また広範な条件である。このように、前立腺はかなりの研究の焦点です。

マウスモデルは、前立腺³の疾患を研究するために広く用いられています。全体的に、マウスの前立腺は、ヒト腺⁴の優れた代表であるが、マウスとヒトの前立腺解剖学と生理学⁵の類似点と相違点があります。両種では、前立腺が尿道を取り囲む、膀胱の基部に位置しています。ヒト前立腺腺は、単一のLOです中央、トランジション、周辺機器、および前部線維筋間質：4つのゾーンに分け、こと。前側、腹、および背外側：これとは対照的に、マウスの前立腺は尿道の周りの異なる位置に3対になった葉で構成されています。 1、それは1：マウス⁶で4細胞レベルでは、主な違いは、ヒトにおける細胞比率を管腔する基底細胞が約1であることです。マウス間質は、ヒトへの相対的なマウスでも異なっている - 筋層は、マウス前立腺における非常に薄いですしながら、人間は、より広範な平滑筋を持っています。マウス前立腺の適切な識別、解剖、およびハンドリングは、マウスの前立腺研究に不可欠です。

ホルモンのレベルが大幅にヒトとマウスの両方で前立腺の開発と恒常性に影響を与えます。エストロゲンは、前立腺の発達⁷において役割を果たすと思われるが、前立腺における最も重要なホルモンはテストステロンです。テストステロンは腺開発ANのために不可欠ですDのメンテナンス。物理的または化学的のいずれかに続いて去勢、成人前立腺apoptose内腔側細胞の約90％、および腺が収縮します。テストステロンを去勢条件下で個体に再導入された場合、前立腺全容量に自分自身を再生することができます。テストステロンはまた、アンドロゲン除去療法が一般的に使用される治療戦略である理由である、前立腺癌を駆動するように思われます。しかし、多くの前立腺癌は、アンドロゲン除去に耐性になります。また、前立腺癌の治療のためのアンドロゲン枯渇療法を受けている男性は去勢、再生条件のサイクルを受けます。マウスでは、外科的去勢は、テストステロンを再導入することにより、前立腺のホルモン再生と共に、去勢抵抗性前立腺に対するテストステロンの循環の影響を研究すると重要なツールです。

この記事では、我々が議論し、locatすることにより、適切な技術のデモンストレーションを行いますeおよびマイクロ解剖マウスの前立腺を、同様にマウスを去勢外科的します。

Protocol

このプロトコルは、ジョンズ・ホプキンス大学施設内動物管理使用委員会によって設定されたガイドラインを満たし、次の。

1.マイクロ解剖マウス前立腺

1. 二酸化炭素窒息または施設の動物の管理と使用のガイドラインに従った代替承認の方法により、マウスを安楽死させます。
2. 4足のそれぞれを通ってピンを置くことによって、解剖ボードに仰臥位でマウスをピン。
3. 70％エタノールで腹部をスプレーします。
4. 鉗子で下腹部の皮膚を持ち、皮膚を介してカットし、ペニスの開口部に約1cmの前方を腹膜するはさみを使用して、任意の臓器を切らないように注意してください。
5. 腹腔を露出させ、アップ腹部の両側胸郭に、下腹部から皮膚及び腹膜を切り取ります。
6. 膀胱と尿生殖路を特定し、優しく側に脂肪および他の器官を動かすことによって、それらを公開。
7. USIngの鉗子、グリップ尿道に近いベースでの輸精管を、そしてそれを離れて引き裂きます。
8. 反対輸精管で繰り返します。
9. 同時に膀胱下の尿道と腹側前立腺（膀胱のベース下の約1cm）を切断するはさみを使用しながら、慎重にグリップ、膀胱を鉗子を使用して、それを引き上げます。
   注：膀胱がプルアップされているように、（膀胱、尿道のセクション、すべての前立腺葉、および精嚢を含む）全体の尿生殖路は、それが付属します。多少の抵抗があるかもしれません。
10. 約5〜10 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む60〜100ミリメートルペトリ皿に尿生殖路（UGT）を配置します。
11. 解剖顕微鏡下でプロトコルの残りの部分を実行します。 2細かい鉗子、それぞれの手で1を使用してください。 「鉛筆のような」鉗子を持ち、それらを安定するように、作業台の上に腕を休ませます。
12. 膀胱があるようUGTを位置決めするために微細なピンセットを使用して上、尿道が下向きされ、精嚢は、膀胱のいずれかの側に配置されています。
13. グリップ1鉗子、慎重に任意の前立腺組織を離れて引き裂くことなく、他の鉗子で脂肪を引き離すと尿道。注：脂肪は周囲の組織に比べて「ピカピカ」が表示されます。
14. 脂肪が除去されると、前立腺の2腹葉間結合組織を引き裂くとそれらを分離するために鉗子を使用しています。
15. 、腹側ローブの1を削除グリップに先端付近の単一腹葉を1鉗子を使用し、可能な限り尿道に近いベースでそのローブグリップに他の鉗子を使用します。まだ葉の基部を把持しながら、グリップに尿道を他の鉗子を使用します。しっかりと、滑らかな動きで離れて尿道から葉を引き出します。何の前立腺組織は尿道に添付残っていないことを確認してください。次の実験段階に応じて、適切な培地に葉を置きます。
    1. Sを固定し、パラフィンに埋め込むには組織学的分析のための十分な、10％中性緩衝ホルマリン^（NBF）8に葉を配置します。
    2. 凍結保存のために、このような10月のように、メディアを凍結し^、8を区画に葉を置きます。
    3. 培養のために単一細胞を単離するための冷PBSで葉を置くか⁹フローサイトメトリー。
16. 他の腹葉と繰り返し手順1.15。
17. 必ず精嚢を穿刺しないようになって、静かに精嚢から葉を引っ張るために鉗子を使用して、前葉の1を削除します。ローブは精嚢から独立していると、ステップ1.15で腹葉と同じ方法でそれを削除します。
18. 他の前方ローブと繰り返し手順1.17。
19. 背側前立腺が表示されていることなどの上に残存尿生殖路を反転します。
20. 2背外側ローブともローブとtとの結合組織の間の結合組織を引き裂くために鉗子を使用し、背外側ローブの1を削除するには彼は精嚢領域を後方。ステップ1.15で腹葉と同様の方法で葉を削除します。
21. 他の背外側葉と繰り返し手順1.20。

2.去勢手術

注：これは生存の手術なので、無菌状態、麻酔、および疼痛管理は、このプロトコルの倫理的、正常に完了することが重要です。すべての機関の動物の管理と使用のガイドラインに従ってください。低体温症を防ぐために、外科手術の際に、このような再循環水ブランケットとして、外部熱源を使用してください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。手術で使用する前に、すべての手術器具をオートクレーブ。

1. 清潔、無菌の表面に適切な措置（ 例えば 2％吸入イソフルラン）を用いてマウスを麻酔し、メートルを配置仰臥位でウーズ。注：例えば、ケタミンのような代替的な麻酔法を、承認された動物プロトコルに応じて、また使用され得ます。
2. つま先をつまんで、マウスの反射神経をチェックしてください。マウスが反応しない場合は、次のステップに進みます。それが反応しない場合は、1-3分待ってから再度確認してください。電気かみそりで手術領域を剃ります。
3. 無菌的に交互に70％エタノールおよびヨウ素のスクラブや制度獣医学のスタッフやIACUCによって推奨される手順を用いてマウスの腹部を準備します。
4. 滅菌メスを使用して、下腹部の正中線に皮膚を介して陰茎に約1.5センチ前方を1センチメートル縦切開を行います。
5. 腹膜を介して小切開（<1センチ）ことを確認し、任意の臓器を切らないように注意してください。
6. 滅菌ピンセット、グリップ腹膜のカットエッジを使用し、下に腹膜腔を見ることができるように静かに持ち上げます。
7. 別の滅菌ピンセットを使用して、目に到達電子膀胱に対する横腹腔とグリップ左右いずれかの睾丸脂肪パッド、。精巣は、同様に出てくるまで、腹膜および皮膚内の開口部を介して脂肪パッドを引き出します。このステップの間に、他の組織や臓器を傷つけないように注意してください。
8. 焼灼ペンを使用して、精巣を保持している脂肪パッドを切断。焼灼ペンノートと精巣動脈を通ってゆっくりとカット：精巣動脈が速すぎてカットされている場合、そこにあまりにも多くの出血であってもよく、マウスを安楽死させなければならないことがあります。
9. 脂肪パッドと動脈が切断されると、精巣および脂肪パッドを削除します。
10. 繰り返して、他の精巣で2.6から2.9を繰り返します。注：精巣を除去するための別の方法は、はさみで血管を切断し、その後、精巣動脈を外科的に結紮することです。
11. 腹膜は、吸収性縫合糸で閉じ縫合糸。
12. ステープル皮膚は、外科的創傷クリップで閉じました。
13. 痛みを管理するための鎮痛剤を投与し、そして場所5-10分間暖かいケージのクリーンケージにマウス。痛みや出血の兆候についてマウスを監視します。

Representative Results

すべての6前立腺葉前立腺顕微解剖（ 図1）を介してマウスから除去しました。完全な尿生殖路（UGT）は、すべての前立腺葉、膀胱、精嚢、尿道（ 図1a）で構成されています。輸精管が尿道に付着するが、前立腺顕微解剖は不要であり、したがって、尿道（ 図1B-1C）を切断することによって、UGTの除去の前に取り外すことができます。腹部（ 図1D）から削除されると尿生殖路が一緒に残ります。この時点で、UGTは、前立腺葉（ 図1E）へのアクセスを得るために除去する必要が脂肪組織に覆われたままです。すべての6ローブ（腹側、前方、および背外側対）は、膀胱の基部に、尿道を取り囲む分かります。純粋な前立腺組織は、その後、（ 図1F）上記プロトコルに従って除去することができます。これらのローブかもしれませんさらなる分析のために適切な培地に置かれます。

去勢は、テストステロンの主要な生産者である精巣の除去です。去勢が発生するまで、テストステロンは、前立腺が（ 図2a）退行その時点で、マウスに存在します。テストステロンの再導入を介したホルモン再生が去勢（ 図2b）に従うことができます。我々は、ホルモンの再生の2つのサイクルに続いて、去勢を行い、テストステロンレベルをELISA（ 図3）により、マウス血清中でモニターしました。去勢条件下、テストステロンレベルが実質的に消滅します。代替的に、タモキシフェン（選択的エストロゲン受容体モジュレーター）は、ホルモン正常に有意な差を示しません。去勢後、テストステロンは、テストステロンのレベルが劇的にスパイクさせ、マウスに再導入された（ 図3）でした。我々は、次に、前立腺Lマイクロ解剖しますマウスののOBEと個々の前方ローブ（ 図4a）としてそれらを画像化しました。我々はまた、ホルマリン固定パラフィン包埋し、組織を切断した。 図4bは、通常下にヘマトキシリンおよびエオシン染色した前部前立腺組織を示し、去勢、および条件を再生します。去勢前立腺ローブ1/10正常前立腺の大きさを近似するために縮小し、そのホルモンの再生が元のサイズに前立腺を復元します。

図1：前立腺マイクロ解剖プロトコルの総組織学 。 （a）は、マウスの腹部にさらされ、その自然状態での尿生殖路（UGT）、。点線は（）前部前立腺（AP）および腹側前立腺（VPここに表示されている）精嚢（SV）、前立腺ローブなど、UGTのさまざまな部分を、包含する（位置である、膀胱（B）、および尿道）膀胱をニースの。輸精管（VD）も見えます。 （b）は輸精管は削除されました。輸精管が除去された領域に対して矢印ポイント。 （c）の UGTは、腹側前立腺ローブ下の尿道を切断することにより、腹部から削除されました。 （D）UGTは、PBS中に配置されており、解剖顕微鏡下に見られます。 （e）の脂肪は前立腺のすべての6つのローブの視認性を考慮して、UGTから削除されました。矢印は、2前葉、腹葉、および背外側ローブを指します。 （f）は、すべての6つの個別の前立腺ローブが除去されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：ティム去勢やホルモンの再生のためのエリン。テストステロンは消え、前立腺の回帰が始まるとき（a）のテストステロンは、去勢まで、生理的レベルで存在します。テストステロンが再導入されるまで、（b）の去勢は、前立腺のホルモンの再生を引き起こし、テストステロンを削除します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：下の各種ホルモンの条件でテストステロンELISA テストステロンレベルは 、ホルモン正常に処理去勢、およびホルモンの条件を再生成タモキシフェン。 ×2回生合成テストステロンの第二ラウンドの移植に続いて、注入および合成テストステロンを除去することを意味します。エラーバーはスタンを表します準の偏差。この図は^、5から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：去勢・再生条件の下で前立腺外観 、去勢ホルモンの正常、およびホルモン、再生条件の下で前部前立腺ローブの（a）の総出現。 ×2回生合成テストステロンの第二ラウンドの移植に続いて、注入および合成テストステロンを除去することを意味します。 （b）は、ホルマリン固定、パラフィン包埋前部前立腺ローブ切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。 大を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のRバージョン。

Discussion

前立腺顕微解剖は、マウス前立腺（ 図1）の葉特有の実験および分析を可能にします。遺伝子操作マウスモデルにおいて、表現型は、他で見られないもので葉に見られます。また、組織学的分析のために、このプロトコルは、純粋な前立腺組織の最大量は節中に存在する他の尿生殖路組織せず、切片と染色することができることを保証します。最後に、単一細胞実験のために、このプロトコルは、ほぼ純粋な前立腺細胞の単離を可能にします。上皮細胞濃縮キットはさらに、間質細胞から前立腺細胞を浄化することができます。顕微解剖に制限は解剖顕微鏡を用いて、解剖顕微鏡を覗きながら細かい鉗子を使用するために必要な学習曲線を含みます。また、前立腺組織は、顕微解剖が不要になって、UGTの一環として、組織学のために区分することができます。しかし、全体のUGTを切片の欠点はということです他の組織は、それがのようにきれいではない作り、セクションに存在するであろう。また、単一の前立腺細胞集団を生成するために、ローブは、汚染を避けるために、UGTから分離しなければなりません。

去勢手術は、多くの前立腺研究室のための基本的な手術であると前立腺開発と疾患に対するテストステロンの効果の研究のために不可欠です。このプロトコルは、迅速であり（経験のあるユーザーのための手術の典型的な時間は約5分である）および循環（図3）からのテストステロンのほぼ100％を削除します。注目すべきは、マウスでのテストステロンのレベルは大幅に異なっており、マウスからマウス¹⁰に限り30倍によって異なる場合があります。去勢は、この変動を除去します。去勢後、研究者は前立腺（ - 4 図3）を再生するために戻って中のテストステロンを追加することを決定してもよいです。これは、浸透圧ポンプ、テストステロン、テストステロンのソースを注入する皮下ことによって行うことができますペレット、またはテストステロン粉末^8を含有する半透過性のシラスティックチューブ。追加されたテストステロンの量に応じて、この手順は、循環中のテストステロンレベルをsuperphysiologicalする生理学的（ 図3）を提供することができます。このプロトコルはまた、前立腺細胞系統を研究し、細胞生物学^11を止めるために使用することができます。別のオプションは、デュタステリド¹²のようなテストステロンの産生を阻害する化合物、でのマウスの治療を経て、化学的去勢、またはアンドロゲン枯渇療法です。これはまた、まれ外科的に去勢された前立腺癌患者の一般的な治療を模倣します。しかし、外科的去勢は、実質的に全てのテストステロンを除去するための信頼できる、恒久的な方法を提供します。精巣に比べ、副腎もはるかに少ない量でも、テストステロンに変換することができ、このようなアンドロステンジオンおよびデヒドロエピアンドロステロンなどのアンドロゲン種を、合成することを考慮することが重要ですこの手順は、より困難であるものの^13。いくつかの場合には、副腎はまた、外科的に除去することができます。

全体的に、これら2つのプロトコルは、前立腺疾患の研究の無数のために有用であるだけでなく、ホルモンの研究。これらのプロトコルは去勢、ホルモンの正常、またはホルモン、再生条件に前立腺生物学を分析するための信頼性の高い、一貫性のある方法です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools	Roboz	Various
Formaldehyde	Sigma	F8775
OCT medium	VWR	25608-930	Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C
PBS	Life Technologies	10010
Isoflurane	Johns Hopkins		Also available from vendors online
Cautery Pen	Medline	ESCT002
Silk suture	AD Surgical	M-S330R19
Surgical Wound Clips	Roboz	RS-9265