Summary
Dieses Manuskript beschreibt die Protokolle für Prostata-Mikrodissektion und chirurgische Kastration im Labor Maus. Wir zeigen auch Vertreter von diesen Protokollen erzeugt Ergebnisse. Schließlich diskutieren wir die Vorteile und die Nutzung dieser Protokolle.
Introduction
Die Prostata ist die häufigste Stelle von Krebs bei Männern in den USA. Fast 220.000 Menschen jedes Jahr wird mit Prostatakrebs diagnostiziert und etwa 27.000 Menschen werden auf ihre Krankheit 1 erliegen. Männer haben eine 1 in 7 Lebensdauer Risiko einer Prostatakrebsdiagnose in den USA 1. Benigner Prostatahyperplasie (BPH), eine altersbedingte noncancerous Vergrößerung der Prostata, ist ebenfalls ein weitverbreiteter Zustand, beeinflussen über 80% der Männer über 80 2. Als solche kann die Prostata ist im Mittelpunkt der Beträchtliche Forschung.
Mausmodelle wurden weitgehend zu studieren Erkrankungen der Prostata 3 verwendet. Insgesamt ist die Maus Prostata eine ausgezeichnete Vertreter der menschlichen gland 4, aber es gibt Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Maus und menschlichen Prostata Anatomie und Physiologie 5. Bei beiden Arten wird die Prostata an der Basis der Blase, umgibt die Harnröhre entfernt. Die menschliche Prostata ist eine einzige losein, aufgeteilt in vier Zonen: zentral, Übergang, periphere und vordere fibromuskuläre Stroma. Im Gegensatz dazu besteht die Maus Prostata von drei gekoppelten Lappen an verschiedenen Positionen um die Harnröhre: vordere, ventralen und dorsolateralen. Auf zellulärer Ebene ist der Hauptunterschied , dass die basalen Zelle luminalen Zellverhältnis in menschlichen etwa 1: 1, aber es beträgt 1: 4 in Mäusen 6. Die murine Stroma unterscheidet sich auch bei Mäusen auf den Menschen - Menschen weitergehende glatte Muskulatur haben, während die Muskelschicht viel dünner in murinen Prostata ist. Die richtige Identifizierung, Präparation und Handhabung der Maus Prostata sind unerlässlich, um Maus Prostata Forschung.
Hormonspiegel beeinflussen stark die Entwicklung und die Homöostase der Prostata in Menschen und Mäusen. Während Östrogen 7 eine Rolle bei Prostata - Entwicklung zu spielen scheint, ist das wichtigste Hormon , das in der Prostata Testosteron. Testosteron ist für Drüsenentwicklung eind Wartung. Im Anschluss an entweder physikalische oder chemische Kastration, etwa 90% der luminalen Zellen im adulten Prostata apoptose und die Drüse schrumpft. Wenn Testosteron an ein Individuum unter Kastrationsbedingungen wieder eingeführt wird, ist die Prostata kann sich der vollen Kapazität zu regenerieren. Testosteron scheint auch Prostatakrebs zu fahren, weshalb Androgenentzugtherapie eine häufig verwendete therapeutische Strategie ist. Allerdings werden viele Prostatakarzinome auf Androgen Deprivation resistent. Darüber hinaus Männer Androgenentzugtherapie für die Behandlung von Prostatakrebs unterziehen laufen Zyklen kastriert und regeneriert Bedingungen. Bei der Maus chirurgische Kastration, zusammen mit hormonellen Regeneration der Prostata durch Testosteron wieder einzuführen, ist ein wichtiges Werkzeug, mit dem Kastrationsbeständigkeit und die Wirkung von Testosteron-cycling auf die Prostata zu studieren.
In diesem Artikel werden wir die richtigen Techniken, mit denen zu diskutieren und demonstrieren zu LOCATe und Mikro sezieren eine Maus Prostata sowie chirurgisch kastriert eine Maus.
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Protocol
Dieses Protokoll erfüllt und folgt den Richtlinien festgelegt von der Johns Hopkins University Institutional Animal Care und Use Committee.
1. Mikro-Dissektion einer Maus Prostata
- Euthanize die Maus durch Erstickung mit Kohlendioxid oder einem alternativen genehmigten Verfahren in Einklang mit den institutionellen Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung.
- Pin der Maus in Rückenlage auf eine Dissektion Bord durch einen Stift, der durch jede der vier Pfoten setzen.
- Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
- Halten Sie die Haut des Unterleibs mit einer Pinzette, und mit einer Schere durch die Haut zu schneiden und ca. 1 cm vor der Öffnung des Penis, vorsichtig, nicht zu schneiden alle Organe Bauchfell.
- Schneiden Sie die Haut und Bauchfell von den unteren Bauch weg, bis beide Seiten des Bauches auf den Brustkorb, die Bauchhöhle ausgesetzt wird.
- Identifizieren Sie die Blase und Urogenitaltrakt, und setzen sie durch leichtes Fett und andere Organe zur Seite bewegt.
- Using Pinzette greifen die Samenleiter an der Basis in der Nähe der Harnröhre, und reißen sie weg.
- Wiederholen Sie mit den gegenüberliegenden Samenleiter.
- Mit einer Pinzette vorsichtig in die Blase Griff und nach oben ziehen, während gleichzeitig der Schere unter der Blase und ventralen Prostata (ungefähr 1 cm unterhalb der Basis der Blase) durch die Harnröhre zu schneiden.
Hinweis: Da die Blase nach oben gezogen wird, die gesamte Urogenitaltrakts (mit Blase, einen Abschnitt der Harnröhre, alle Prostatalappen und den Samenbläschen) mit ihm kommen. Es kann eine gewisse Resistenz sein. - Platzieren Sie den Urogenitaltrakt (UGT) in eine 60-100 mm Petrischale, die etwa 5-10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Führen Sie den verbleibenden Teil des Protokolls unter einem Präpariermikroskop. Verwenden Sie zwei feinen Pinzette, eine in jeder Hand. Halten Sie die Zange "wie ein Bleistift" und die Unterarme auf der Tischplatte ruhen, um sie zu beruhigen.
- Verwenden feinen Pinzette die UGT so zu positionieren, dass die Blaseoben, wird die Harnröhre nach unten gerichtet, und die Samenbläschen sind auf beiden Seiten der Harnblase angeordnet.
- Fassen Sie die Harnröhre mit einer Zange und ziehen Sie sie vorsichtig Fett weg mit den anderen Zange, ohne Prostatagewebe Abreißen. Hinweis: Fat "glänzend" in Bezug auf das umgebende Gewebe erscheint.
- Sobald das Fett entfernt worden ist, Pinzette das Bindegewebe zwischen den beiden ventralen Lappen der Prostata und trennen sie zu zerreißen.
- Um einen der Bauchlappen entfernen, verwenden Sie eine Zange zum Greifen eines einzigen Bauchlappen in der Nähe der Spitze, und verwenden Sie die andere Zange zu greifen, daß Lappen an der Basis so nah an der Harnröhre wie möglich. Während noch die Basis des Lappens Greif, verwenden Sie die andere Zange die Harnröhre zu greifen. Ziehen Sie den Lappen weg von der Harnröhre mit einer festen, glatten Bewegung. Achten Sie darauf, kein Prostatagewebe bleibt an der Harnröhre befestigt. Platzieren Sie den Lappen in dem geeigneten Medium, in Abhängigkeit von der nächsten Versuchsstufe.
- Um dies zu beheben und in Paraffin eingebettet werden, die sausreichend für die histologische Analyse, setzen Sie den Lappen in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) 8.
- Platzieren Sie den Lappen in Gefriermedium, wie OAT für die Kryokonservierung und sectioning 8.
- Platzieren Sie den Lappen in kaltem PBS für Einzelzellisolierung für Kultur oder Durchflusszytometrie 9.
- Wiederholen Sie Schritt 1.15 mit der anderen Bauchlappen.
- Um einen der Vorderlappen zu entfernen, verwenden Pinzette vorsichtig auf die Lappen ziehen weg von der Samenblase, so dass Sie sicher, dass nicht die Samenblase zu durchstechen. Sobald der Lappen unabhängig von der Samenblase, entfernen Sie sie in der gleichen Weise wie die Bauchlappen in Schritt 1.15.
- Wiederholen Sie Schritt 1.17 mit dem anderen Vorderlappen.
- Klappen Sie den restlichen Urogenitaltrakt über, so dass die Rücken Prostata sichtbar ist.
- Um einen der dorsolateralen Lappen entfernen, Zangen verwenden das Bindegewebe zwischen den beiden dorsolateralen Lappen und auch das Bindegewebe zwischen den Lappen und t zu reißener posterioren Bereich der Samenblasen. Entfernen Sie die Lappen in ähnlicher Weise wie die Bauchlappen in Schritt 1.15.
- Wiederholen Sie Schritt 1.20 mit dem anderen dorsolateralen Lappens.
2. Chirurgische Kastration
Hinweis: Dies ist ein Überleben der Operation, so asepsis, Anästhesie und Schmerztherapie sind wichtig, um die ethischen und erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls. Folgen Sie alle institutionellen Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung. Eine externe Wärmequelle, wie beispielsweise einem rezirkulierenden Wasserdecke, während des chirurgischen Eingriffs Hypothermie zu verhindern. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt. Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor dem Gebrauch in der Chirurgie.
- Auf einem sauberen, sterilen Oberfläche der Maus durch geeignete Maßnahmen (zB 2% inhaliert Isofluran) betäuben und die Position mOuse in Rückenlage. Hinweis: Alternative Anästhesieverfahren, wie Ketamin, kann auch verwendet werden, abhängig von dem zugelassenen Tier Protokoll.
- Überprüfen Sie die Reflexe der Maus durch die Zehen einklemmen. Wenn die Maus nicht reagiert, gehen Sie zum nächsten Schritt. Wenn es nicht reagiert, warten 1-3 min und erneut prüfen. Rasieren Sie den OP-Bereich mit einem elektrischen Rasierer.
- Aseptisch bereiten den Bauch der Maus durch die institutionellen Tierärzten oder IACUC empfohlen scheuert von 70% Ethanol und Jod oder Verfahren anwenden abwechseln.
- Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie eine 1 cm vertikalen Schnitt durch die Haut in der Mittellinie der Unterbauch, ca. 1,5 cm vor den Penis.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (<1 cm) durch das Peritoneum, vorsichtig keine Organe zu schneiden.
- Mit einer sterilen Pinzette, greifen die Schnittkante des Peritoneum und heben Sie sie vorsichtig nach oben so in der Lage sein, unter die Bauchhöhle zu sehen.
- Unter Verwendung eines anderen sterilen Zange greifen in the Peritonealhöhle und Griff entweder die linke oder rechte Hodenfettpolster, lateral in die Blase. Ziehen Sie die Fettpolster durch die Öffnung in das Peritoneum und die Haut, bis die Hoden als auch herauskommt. Seien Sie nicht vorsichtig alle anderen Geweben oder Organen bei diesem Schritt zu verletzen.
- Mit einem Kauter Stift, schneiden durch die Fettpolster, die die Hoden hält. Schneiden Sie langsam durch die Hodenarterie mit dem Kauter Stift Hinweis: Wenn die Hodenarterie zu schnell geschnitten wird, kann es zu viel Blutungen und die Maus kann eingeschläfert werden.
- Sobald die Fettpolster und Arterie geschnitten werden, entfernen Sie den Hoden und Fettpolster.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,6-2,9 mit dem anderen Hoden. Hinweis: Ein alternatives Verfahren zur Entfernung der Hoden ligieren die Hodenarterie operativ ist, worauf das Schiff mit einer Schere schneiden.
- Vernähen das Peritoneum mit resorbierbaren Naht verschlossen.
- Staple die Haut geschlossen mit chirurgischen Wundklammern.
- Verwalten Sie eine analgetische Schmerzen zu verwalten, und Platzdie Maus in einem sauberen Käfig auf einem Käfig Wärmer für 5-10 min. Überwachen Sie die Maus auf Anzeichen von Schmerzen oder Blutungen.
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Representative Results
Alle sechs Prostatalappen wurden aus einer Maus über Prostata Mikrodissektion (Abbildung 1) entfernt wird . Der komplette Urogenitaltrakt (UGT) aus allen Prostatalappen besteht, die Harnblase, Samenbläschen und der Harnröhre (Abbildung 1a). Die Samenleiter wird an der Harnröhre, ist aber für Prostata - Mikrodissektion unnötig, und somit vor dem Entfernen des UGT gelöst werden kann durch die Harnröhre (1b-1c) zu schneiden. Der Urogenitaltrakt bleiben zusammen einmal aus dem Bauch (Abbildung 1d) entfernt. Zu diesem Zeitpunkt bleibt der UGT im Fettgewebe bedeckt, die entfernt werden muss , den Zugang zu den Prostatalappen zu gewinnen (Abbildung 1e). Alle sechs Lappen (ventral, anterioren und dorsolateralen Paare) kann an der Basis der Blase umgibt die Harnröhre zu sehen. Reines Prostatagewebe kann dann oben (Abbildung 1f) nach dem Protokoll entfernt werden. Diese Lappen könnenin dem entsprechenden Medium für die weitere Analyse aufgestellt werden.
Kastration ist die Entfernung der Hoden, die die Primärproduzenten von Testosteron sind. Testosteron ist in der Maus , bis Kastration auftritt, an welchem Punkt der Prostata zurückbildet (Abbildung 2a). Hormonal Regeneration über die Wiedereinführung von Testosteron kann Kastration (Abbildung 2b) folgen. Wir führten Kastration, gefolgt von zwei Zyklen der hormonellen Regeneration und Testosteronspiegel wurden in Maus - Serum durch ELISA (Figur 3) überwacht. Unter Kastration Bedingungen verschwinden Testosteronspiegel praktisch. Alternativ zeigt Tamoxifen (ein selektiver Östrogenrezeptor-Modulator) keinen signifikanten Unterschied zu den hormonell normalen Zustand. Nach der Kastration wurde Testosteron an die Maus wieder eingeführt, so dass der Testosteronspiegel dramatisch Dorn (Abbildung 3). Wir haben dann die Prostata l Mikro-seziertobes der Mäuse und abgebildet , sie als einzelne Vorderlappen (Abbildung 4a). Wir haben auch in Formalin fixierten, in Paraffin eingebettet und geschnitten das Gewebe. 4b zeigt Hämatoxylin und Eosin gefärbt anterioren Prostatagewebe unter normalen, sterilisierten, Bedingungen regeneriert. Kastrierte Prostatalappen schrumpfen ein Zehntel der Größe eines normalen Prostata zu nähern, und dass hormonelle Regeneration stellt die Prostata auf seine ursprüngliche Größe.
Abbildung 1: Brutto Histologie der Prostata Micro-Dissektion Protokoll. (A) Der Urogenitaltrakt (UGT) in seinem natürlichen Zustand, in dem murinen Bauch ausgesetzt. Die gepunkteten Linien umfassen, die verschiedenen Teile des UGT, einschließlich der Samenblasen (SV), Prostata-Lappen (anterior Prostata (AP) und die ventrale Prostata (VP) sind hier sichtbar), der Blase (B), und der Harnröhre (angeordnet seinneath die Blase). Die vas deferens (VD) ist ebenfalls sichtbar. (B) Die Samenleiter entfernt wurden. Der Pfeil zeigt auf die Region, aus denen die Samenleiter entfernt wurde. (C) Die UGT wurde durch Schneiden der Harnröhre unterhalb der ventralen Prostatalappen aus dem Abdomen entfernt werden . (D) Die UGT wurde in PBS gelegt und unter einem Präpariermikroskop gesehen. (E) Fett wurde aus dem UGT entfernt, so dass für die Sichtbarkeit aller sechs Lappen der Prostata. Die Pfeile zeigen auf die beiden Vorderlappen, die Bauchlappen und den dorsolateralen Lappen. (F) Alle sechs Einzelprostatalappen entfernt wurden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Timeline für Kastration und Hormonal Regeneration. (a) Testosteron bei physiologischen Konzentrationen bis Kastration vorhanden ist, wenn Testosteron verschwindet und Regression der Prostata beginnt. (B) Die Kastration entfernt Testosteron, bis Testosteron wieder eingeführt wird, so dass hormonelle Regeneration der Prostata. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Testosteronspiegel in verschiedenen Hormonelle Bedingungen Testosteron ELISA unter Tamoxifen behandelt, hormonell normal, kastriert und hormonell Bedingungen regeneriert. Regenerierte x 2 bezieht sich auf die Implantation und Entfernung des synthetischen Testosteron, gefolgt von der Implantation einer zweiten Runde von synthetischen Testosteron. Fehlerbalken stellen standardabweichung. Diese Zahl wurde von 5 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Prostata Aussehen unter Kastration und Regenerationsbedingungen (a) Brutto Aussehen vorderen Prostatalappen unter kastriert, hormonell normal, und hormonell Bedingungen regeneriert.. Regenerierte x 2 bezieht sich auf die Implantation und Entfernung des synthetischen Testosteron, gefolgt von der Implantation einer zweiten Runde von synthetischen Testosteron. (B) Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete vorderen Prostatalappen geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier um ein großes zu sehenr Version dieser Figur.
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Discussion
Prostate Mikrodissektion ermöglicht lappen spezifische Experimente und die Analyse der Maus Prostata (Abbildung 1). In gentechnisch veränderten Maus-Modellen, in einem Lappen kann Phänotypen gesehen, die nicht in anderen gesehen wird. Auch für die histologische Analyse, versichert dieses Protokoll, dass die maximale Menge an reinem Prostatagewebe kann, ohne andere Urogenitaltrakt Gewebe in dem Abschnitt geschnitten und gefärbt werden. Schließlich ist für Single-Cell-Experimente ermöglicht dieses Protokoll für die Isolierung von fast reinen Prostatazellen. Epithelial Zellanreicherung Kits können weiter Prostatazellen von Stromazellen zu reinigen. Einschränkungen bei der Mikro-Dissektion schließen die Verwendung eines Präpariermikroskop, und die Lernkurve notwendig feinen Pinzette zu verwenden, während er durch das Aufschneiden Mikroskop. Alternativ kann Prostatagewebe für die Histologie als Teil des UGT geschnitten werden, Mikrodissektion überflüssig macht. Doch der Nachteil die gesamte UGT sectioning ist, dassandere Gewebe wird in dem Abschnitt vorhanden sein, ist es nicht so sauber zu machen. Darüber hinaus ist für einzelne Prostatazellpopulationen zu erzeugen, müssen die Lappen von der UGT getrennt werden Kontamination zu vermeiden.
Chirurgische Kastration ist eine grundlegende Operation für viele Prostata-Forschungslabors und ist für die Studie über die Auswirkungen von Testosteron auf Prostata-Entwicklung und Krankheit wesentlich. Dieses Protokoll ist schnell (typische Zeit der Operation für einen erfahrenen Benutzer ist ca. 5 min) und entfernt fast 100% des Testosterons aus dem Verkehr (Abbildung 3). Zu beachten ist , unterscheiden sich signifikant in Mäusen Testosteronspiegel und 10 um so viel wie das 30-fache von Maus zu Maus variieren. Die Kastration beseitigt diese Variation. Im Anschluss an die Kastration können Forscher entscheiden Testosteron zurück in hinzufügen , um die Prostata (Abbildungen 3-4) zu regenerieren. Dies kann durch subkutane Implantieren einer Quelle von Testosteron, wie beispielsweise eine osmotische Pumpe, einem Testosteron geschehenPellets oder eine semipermeable Silastic Röhre Testosteron Pulver enthaltend 8. In Abhängigkeit von der Menge an Testosteron zugegeben, kann dieses Verfahren physiologischen liefern zu Testosteronspiegel in dem Kreislauf (Figur 3) superphysiological. Dieses Protokoll kann auch Prostata - Zelllinie verwendet werden und Biologie Stammzellen 11 zu studieren. Eine andere Möglichkeit ist die chemische Kastration oder Androgenentzugtherapie, über die Behandlung von Mäusen mit Verbindungen, die die Produktion von Testosteron, wie dutasteride 12 hemmen. Dies ahmt auch eine gemeinsame Behandlung von Patienten mit Prostatakrebs, die selten chirurgisch kastriert werden. Jedoch stellt chirurgische Kastration eine zuverlässige, dauerhafte Methode zur Entfernung von praktisch allen Testosteron. Es ist wichtig, zu berücksichtigen, dass die Nebennieren auch androgen-Arten, wie Androstendion und Dehydroepiandrosteron, synthetisieren, die in Testosteron umgewandelt werden können, wenn auch in viel kleineren Mengen, bezogen auf den Hoden13. In einigen Fällen können die Nebennieren auch chirurgisch entfernt werden, obwohl dieses Verfahren ist schwieriger.
Insgesamt sind diese beiden Protokolle für eine Vielzahl von Forschung in Prostataerkrankungen nützlich, sowie hormonellen Studien. Diese Protokolle sind eine zuverlässige und konsistente Weise Prostata Biologie in hormonell normal, kastriert oder hormonell regenerierten Bedingungen zu analysieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Einige der Figuren in diesem Manuskript wurden großzügig durch das Labor von Bart O. Williams zur Verfügung gestellt. Die Autoren werden vom National Cancer Institute gewährt U54CA143803, CA163124, CA093900 UND CA143055 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
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