Summary
Este manuscrito descreve os protocolos de próstata micro-dissecção e castração cirúrgica no rato de laboratório. Nós também retratam resultados representativos produzidos por estes protocolos. Finalmente, discutimos as vantagens e utilização desses protocolos.
Introduction
A próstata é o local mais comum de câncer em homens em os EUA. Cerca de 220.000 homens cada ano serão diagnosticados com câncer de próstata, e aproximadamente 27.000 homens vai sucumbir à sua doença 1. Os homens têm um risco de 1 em 7 vida de um diagnóstico de câncer de próstata em os EUA 1. Hiperplasia benigna da próstata (HBP), uma ampliação não canceroso relacionada com a idade da próstata, é também uma condição generalizada, afectando mais de 80% dos homens com mais de 80 2. Como tal, a próstata é o foco de consideráveis pesquisas.
Modelos de ratos têm sido amplamente utilizados para estudar doenças da próstata 3. No geral, a próstata do rato é um excelente representante da glândula humano 4, mas há semelhanças e diferenças entre rato e anatomia da próstata e fisiologia humana 5. Em ambas as espécies, a próstata está localizada na base da bexiga, em torno da uretra. A próstata humana é uma única Loser, dividido em quatro zonas: central, de transição, periférica e estroma fibromuscular anterior. Em contraste, a próstata do rato é composto por três lóbulos emparelhados em diferentes posições em torno da uretra: anterior, ventral, e dorsolateral. A um nível celular, a principal diferença é que a célula basal a proporção de células em luminal humana é de cerca de 1: 1, mas é de 1: 4 em ratinhos 6. O estroma murino também é diferente em ratinhos relativamente a seres humanos - os seres humanos têm mais extenso do músculo liso, enquanto que a camada muscular é muito mais fina na próstata murina. A adequada identificação, dissecção, e manipulação da próstata do rato são essenciais para a investigação do mouse próstata.
Os níveis hormonais afectar drasticamente o desenvolvimento e a homeostase da glândula da próstata em humanos e ratos. Enquanto estrogénio parece desempenhar um papel no desenvolvimento da próstata 7, a hormona mais importante na próstata é a testosterona. A testosterona é essencial para um desenvolvimento glandulard manutenção. No seguimento de castração química ou física, aproximadamente 90% das células luminais na apoptose adulta próstata e a glândula encolhe. Se a testosterona é reintroduzido a um indivíduo em condições de castração, a próstata é capaz de regenerar-se a plena capacidade. A testosterona também parece dirigir o cancro da próstata, que é por terapia de privação de androgénio é uma estratégia terapêutica utilizada. No entanto, muitos cânceres de próstata se tornam resistentes à privação de andrógeno. Além disso, homens submetidos a terapia de privação de andrógeno para o tratamento de câncer de próstata submetidos a ciclos de condições castrados e regeneradas. No ratinho, a castração cirúrgica, juntamente com regeneração hormonal da próstata através da reintrodução de testosterona, é uma ferramenta importante para estudar com os quais a resistência a castração e os efeitos da testosterona sobre ciclismo da próstata.
Neste artigo, vamos discutir e demonstrar as técnicas adequadas que permitam locatE e micro-dissecção de próstata de rato, assim como na cirurgia de castrar um rato.
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Protocol
Este protocolo cumpre e segue as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Johns Hopkins.
1. Micro-dissecando um rato próstata
- Euthanize o mouse por asfixia com dióxido de carbono ou por um método alternativo aprovado em conformidade com as orientações de cuidados de animais e uso institucional.
- Pin o rato em decúbito dorsal para um quadro de dissecção, colocando um pino através de cada uma das quatro patas.
- Pulverizar o abdômen com etanol 70%.
- Segure a pele do abdómen inferior com uma pinça, e usar uma tesoura para cortar através da pele e peritônio aproximadamente 1 cm anterior à abertura do pénis, cuidado para não cortar quaisquer órgãos.
- Cortar a pele e peritônio da parte inferior do abdome, um aumento de ambos os lados do abdômen para a caixa torácica, expondo a cavidade peritoneal.
- Identificar a bexiga e trato urogenital, e expô-los movendo-se delicadamente órgãos de gordura e outros para o lado.
- Usiforceps Ng, aderência do canal deferente na base perto da uretra, e arrancá-la.
- Repita com o canal deferente opostas.
- Utilizando uma pinça, cuidadosamente aderência da bexiga e puxá-lo para cima, ao mesmo tempo, usando uma tesoura para cortar através da uretra abaixo da bexiga e próstata ventral (aproximadamente 1 cm abaixo da base da bexiga).
Nota: Como a bexiga é puxado para cima, o (bexiga contendo, uma secção da uretra, todos os lobos da próstata e as vesículas seminais) toda trato urogenital virá com ele. Pode haver alguma resistência. - Colocar o tracto urogenital (UGT) num prato de Petri contendo 60-100 mm aproximadamente 5-10 ml de fosfato tamponado salino (PBS).
- Realizar a parte restante do protocolo sob um microscópio de dissecção. Use duas pinça fina, um em cada mão. Segure a pinça ", como um lápis" e descansar os antebraços na bancada, de modo a estabilizá-los.
- Utilize uma pinça fina para posicionar a UGT de tal modo que a bexiga estáem cima, a uretra é apontada para baixo, e as vesículas seminais são posicionados em ambos os lados da bexiga.
- Aperto da uretra com um fórceps e puxe cuidadosamente a gordura com os outros fórceps sem rasgar fora qualquer tecido da próstata. Nota: Gordura aparece relativa "brilhante" para o tecido circundante.
- Uma vez que a gordura é removida, utilizar uma pinça para rasgar o tecido conjuntivo entre os dois lóbulos ventrais da próstata e separá-los.
- Para remover um dos lobos ventrais, use uma pinça para agarrar um único lobo ventral perto da ponta, e usar as outras forceps aperto que lóbulo na base tão perto da uretra possível. Enquanto ainda segurando a base do lobo, usar os outros pinça para aperto da uretra. Puxe o lobo longe da uretra com um movimento firme e suave. Certifique-se de não tecido da próstata permanece ligado à uretra. Colocar o lóbulo para o meio apropriado, dependendo da próxima etapa experimental.
- Para corrigir e parafina-incorporar os samplo para análise histológica, coloque o lobo em formalina 10% neutra tamponada (NBF) 8.
- Coloque o lobo no meio de congelamento, como OCT, para criopreservação e secção 8.
- Coloque o lobo em PBS frio para o isolamento de célula única para a cultura ou citometria de fluxo 9.
- Repita o passo 1,15 com o outro lobo ventral.
- Para remover um dos lóbulos anteriores, utilize uma pinça para puxar delicadamente o lobo longe da vesícula seminal, tomando cuidado para não perfurar a vesícula seminal. Uma vez que o lóbulo é independente da vesícula seminal, removê-lo do mesmo modo como no lóbulo ventral no passo 1.15.
- Repita o passo 1,17 com o outro lobo anterior.
- Virar o trato urogenital restante sobre tais que a próstata dorsal é visível.
- Para remover um dos lobos dorsolateral, utilize uma pinça para rasgar o tecido conjuntivo entre os dois lóbulos dorsolateral e também o tecido conjuntivo entre os lobos e tele região posterior das vesículas seminais. Remover o lóbulo de uma forma semelhante como no lóbulo ventral no passo 1.15.
- Repita o passo 1,20 com o outro lobo dorsolateral.
2. castração cirúrgica
Nota: Esta é uma cirurgia sobrevivência, de modo a assepsia, anestesia e gestão da dor são importantes para a conclusão ética e bem sucedida deste protocolo. Siga todas as orientações de cuidados de animais e uso institucional. Utilizar uma fonte de calor externa, tal como um cobertor de água em recirculação, durante o procedimento cirúrgico, para evitar a hipotermia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes do uso em cirurgia.
- Em uma superfície limpa e esterilizada anestesiar o mouse usando medidas adequadas (por exemplo, 2% de isoflurano inalado) e posicione o mOuse em decúbito dorsal. Nota: métodos de anestesia alternativos, tais como a cetamina, que também pode ser utilizado, dependendo do protocolo de animais aprovados.
- Verifique os reflexos do rato por beliscar os dedos dos pés. Se o rato não reagir, avançar para a próxima etapa. Se ele não reagir, espere 1-3 minutos e verifique novamente. Raspar a área cirúrgica com um barbeador elétrico.
- Assepticamente preparar o abdómen do rato usando alternando esfrega de 70% de etanol e iodo ou procedimentos recomendados pela equipe veterinária institucional ou IACUC.
- Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer uma incisão vertical 1 centímetro através da pele na linha média do abdome inferior, aproximadamente 1,5 cm anterior ao pénis.
- Fazer uma pequena incisão (<1 cm) através do peritônio, cuidado para não cortar todos os órgãos.
- Utilizando uma pinça estéril, segure a borda do corte do peritônio e levante-o suavemente de modo a ser capaz de ver a cavidade peritoneal por baixo.
- Usando outra pinça estéril, chegar em the cavidade peritoneal e aderência tanto a almofada de gordura testicular esquerda ou direita, lateral à bexiga. Puxar a almofada de gordura através da abertura no peritoneu e da pele até que o testículo sai bem. Tenha cuidado para não ferir quaisquer outros tecidos ou órgãos durante esta etapa.
- Usando uma caneta cautério, cortar a almofada de gordura que está segurando o testículo. Corta-se lentamente através da artéria testicular com a caneta cautério Nota: Se a artéria testicular é cortado muito rapidamente, não pode ser demasiado sangramento e o rato pode ter que ser sacrificados.
- Uma vez que a almofada de gordura e artéria são cortadas, remover o testículo e gordura pad.
- Repita os passos 2,6-2,9 com o outro testículo. Nota: Um método alternativo para a remoção dos testículos é a ligar cirurgicamente a artéria testicular, seguido pelo corte do recipiente com uma tesoura.
- Suturar o peritônio fechada com sutura absorvível.
- Staple a pele fechada com agrafos cirúrgicos.
- Administrar um analgésico para controlar a dor, e localo rato em uma gaiola limpa em uma gaiola mais quente durante 5-10 min. Monitorar o mouse para sinais de dor ou sangramento.
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Representative Results
Todos os seis lóbulos da próstata foram removidos a partir de um rato através de micro-dissecção de próstata (Figura 1). O tracto urogenital completo (UGT) é constituído por todos os lóbulos da próstata, da bexiga, vesícula seminal, e da uretra (Figura 1A). Os canais deferentes atribui à uretra, mas é desnecessário para próstata micro-dissecação, e pode, portanto, ser separado antes da remoção da UGT cortando a uretra (Figura 1b-1c). O trato urogenital permanecerão juntos uma vez removido do abdômen (Figura 1d). Neste ponto, a UGT permanece coberta no tecido adiposo, o que necessita de ser removida para ter acesso aos lóbulos da próstata (Figura 1E). Todos os seis lóbulos (ventral, anterior, e pares dorsolateral) pode ser visto em torno da uretra, na base da bexiga. Tecido da próstata pura pode então ser removido seguindo o protocolo acima (Figura 1F). Esses lobos podeser colocado no meio adequado para posterior análise.
A castração, é a remoção dos testículos, que são as principais produtoras de testosterona. A testosterona é presente no rato até que a castração ocorre, altura em que a próstata regride (Figura 2a). Regeneração hormonal através de reintrodução de testosterona pode seguir castração (Figura 2b). Foi realizada a castração, seguido por dois ciclos de regeneração hormonal, e os níveis de testosterona foram monitorizadas em soro de rato por ELISA (Figura 3). Sob condições de castração, os níveis de testosterona praticamente desaparecer. Alternativamente, o tamoxifeno (um modulador do receptor de estrogénio selectivo) não mostra nenhuma diferença significativa para o estado normal hormonalmente. Depois da castração, testosterona foi re-introduzido no rato, fazendo com que os níveis de testosterona para cravar dramaticamente (Figura 3). Em seguida, micro-dissecados do l de próstataobes dos ratinhos e fotografada-los como lóbulos anteriores individuais (Figura 4A). Também formalina-fixo, parafina-embedded, e seccionados do tecido. Figura 4b mostra hematoxilina e tecido anterior da próstata manchado eosina em condições normais, castrados e condições regenerado. lóbulos da próstata castrados encolher para aproximar um décimo do tamanho de uma próstata normal, e que a regeneração hormonal restaura a próstata para o seu tamanho original.
Figura 1: Histologia Bruto da próstata Micro-dissecção protocolo. (A) O trato urogenital (UGT) em seu estado natural, exposta no abdômen murino. As linhas a tracejado abrangem as várias partes do UGT, incluindo as vesículas seminais (SV), os lóbulos da próstata (próstata anterior (AP) e da próstata ventral (VP) são visíveis aqui), bexiga (B) e uretra (localizado sejaSob o da bexiga). Os canais deferentes (Vd) é também visível. (B) Os canais deferentes foram removidos. A seta aponta para a região a partir da qual o canal deferente foi removido. (C) A UGT foi removido do abdómen por corte da uretra abaixo dos lóbulos ventrais da próstata. (D) A UGT foi colocado em PBS e é visto sob um microscópio de dissecção. (E) A gordura foi removida a partir da UGT, permitindo a visibilidade de todos os seis lóbulos da próstata. As setas apontam para os dois lóbulos anteriores, os lobos ventrais e os lobos dorsolateral. (F) Todos os seis lóbulos da próstata individuais foram removidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Timeline para castração e hormonais Regeneração. (a) testosterona está presente em níveis fisiológicos até castração, quando desaparece a testosterona e a regressão da próstata começa. (B) A castração elimina a testosterona, até que a testosterona é reintroduzido, fazendo com que a regeneração hormonal da próstata. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Os níveis de testosterona em várias condições hormonais Testosterona ELISA sob tamoxifeno tratados, hormonalmente normal, castrados e condições hormonalmente regenerado. Regenerado X 2 refere-se ao implante e remoção de testosterona sintética, seguido de implantação de uma segunda ronda de testosterona sintética. As barras de erro representam standesvio-. Este valor foi modificado a partir de 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Aspecto da próstata sob Castração e regeneração Condições (a) aparência bruta dos lobos anterior próstata em condições castrados, hormonalmente normais, e hormonalmente regenerados.. Regenerado X 2 refere-se ao implante e remoção de testosterona sintética, seguido de implantação de uma segunda ronda de testosterona sintética. (B) fixado em formalina, anterior lóbulos da próstata embebidos em parafina e os cortes corados com hematoxilina e eosina. Por favor clique aqui para ver um grander Versão desta figura.
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Discussion
Próstata de micro-dissecção de experimentação específica permite-lobo e análise da próstata de ratinho (Figura 1). Em modelos de rato geneticamente modificadas, fenótipos podem ser vistos em um lóbulo que não é observada em outros. Além disso, para análise histológica, este protocolo garante que a quantidade máxima de tecido da próstata puro pode ser seccionados e corados, sem outros tecidos do tracto urogenital presente na secção. Finalmente, para experiências de uma única célula, este protocolo permite o isolamento das células da próstata quase puro. Kits de enriquecimento de células epiteliais pode ainda purificar células da próstata a partir de células do estroma. Limitações dos micro-dissecção incluem a utilização de um microscópio de dissecação, e a curva de aprendizagem necessária a utilização de uma pinça fina enquanto olha através do microscópio de dissecção. Alternativamente, o tecido da próstata pode ser seccionado para histologia como parte da UGT, fazendo micro-dissecção desnecessária. No entanto, a desvantagem para o corte de toda a UGT é queoutros tecidos estará presente na secção, tornando-o não tão limpo. Além disso, para a geração de populações de células de próstata individuais, os lóbulos deve ser separado da UGT para evitar a contaminação.
A castração cirúrgica é uma cirurgia fundamental para muitos laboratórios de investigação e da próstata é essencial para o estudo dos efeitos da testosterona sobre o desenvolvimento da próstata e doença. Este protocolo é rápido (tempo típico de cirurgia para um usuário experiente é de cerca de 5 min) e remove quase 100% da testosterona de circulação (Figura 3). De nota, os níveis de testosterona em ratos diferem significativamente, e podem variar em até 30 vezes de rato para rato 10. Castração remove essa variação. Seguindo a castração, os pesquisadores podem decidir adicionar testosterona de volta para regenerar os da próstata (Figuras 3 - 4). Isto pode ser feito por via subcutânea implantar um fonte de testosterona, tal como uma bomba osmótica, um testosteronapelete, ou um tubo de silastic semi-permeável contendo testosterona em pó 8. Dependendo da quantidade de testosterona adicionado, este procedimento pode fornecer fisiológico para superphysiological níveis de testosterona na circulação (Figura 3). Este protocolo pode também ser utilizado para estudar a linhagem de células de próstata e biologia das células estaminais 11. Outra opção é a castração química, ou terapia de privação de androgénio, por meio do tratamento dos murganhos com os compostos que inibem a produção de testosterona, tais como dutasterida 12. Isso também imita um tratamento comum dos pacientes com câncer de próstata, que raramente são castrados cirurgicamente. No entanto, a castração cirúrgica proporciona um método fiável e permanente para a remoção de praticamente toda a testosterona. É importante considerar que as glândulas supra-renais também sintetizar espécies de androgénio, tais como a androstenediona e desidroepiandrosterona, que podem ser convertidos em testosterona, embora quantidades muito menores, em relação aos testículos13. Em alguns casos, as glândulas supra-renais pode também ser removido cirurgicamente, embora este procedimento é mais difícil.
Em geral, estes dois protocolos são úteis para uma miríade de investigação de doenças da próstata, bem como estudos hormonais. Estes protocolos são uma maneira confiável e consistente para analisar a biologia da próstata em condições normais hormonalmente, castrados, ou hormonalmente regenerados.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Algumas das figuras neste manuscrito foram generosamente fornecidos pelo laboratório de Bart O. Williams. Os autores são suportados pelo Instituto Nacional do Câncer concede U54CA143803, CA163124, CA093900, CA143055 E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
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