Summary
Detta manuskript beskriver protokollen för prostatamikro dissekering och kirurgisk kastrering i laboratoriet musen. Vi skildrar också representativa resultat som produceras av dessa protokoll. Slutligen, vi diskutera fördelar och användning av dessa protokoll.
Introduction
Prostatan är den vanligaste platsen för cancer hos män i USA. Nästan 220.000 män varje år kommer att diagnostiseras med prostatacancer, och cirka 27.000 män kommer att ge efter för sin sjukdom en. Män har en 1 i 7 livstidsrisken för en prostatacancer diagnos i USA ett. Godartad prostataförstoring (BPH), en åldersrelaterad noncancerous förstoring av prostatan, är också en utbredd sjukdom, som påverkar mer än 80% av män över 80 två. Som sådan är prostatan i fokus för omfattande forskning.
Musmodeller har använts i stor utsträckning för att studera sjukdomar i prostata 3. Sammantaget är musen prostatan en utmärkt representant för den mänskliga körtel 4, men det finns likheter och skillnader mellan mus och människa prostata anatomi och fysiologi 5. Hos båda arterna, är prostata belägen vid basen av urinblåsan, som omger urinröret. Den humana prostatakörteln är en enda lovara uppdelad i fyra zoner: central, övergång, perifer och främre fibromuskulär stroma. I motsats till detta mus prostata består av tre parade lober vid olika positioner runt urinröret: anterior, ventrala och dorsolaterala. På en cellulär nivå, är den huvudsakliga skillnaden att den basala cellen till luminala cellförhållandet i människa är ca 1: 1, men det är 1: 4 i möss 6. Den murina stroma är också annorlunda i möss i förhållande till människor - människor har mer omfattande glatt muskulatur, medan muskellagret är mycket tunnare i murin prostata. Korrekt identifiering, dissektion och hantering av mus prostata är avgörande för mus prostata forskning.
Hormonnivåer drastiskt påverka utveckling och homeostas av prostatakörteln hos både människor och möss. Medan östrogen verkar spela en roll i prostata utveckling 7, är det viktigaste hormonet i prostata testosteron. Testosteron är nödvändigt för körtel utveckling end underhåll. Efter antingen fysikalisk eller kemisk kastrering, krymper ca 90% av den luminala celler i den vuxna prostata apoptose, och bussningen. Om testosteron återinförs till en individ i kastrerings förhållanden, är prostata kan regenerera sig till full kapacitet. Testosteron verkar också för att driva prostatacancer, vilket är anledningen till androgendeprivationterapi är ett vanligt använt terapeutisk strategi. Men många prostatacancer blivit resistenta mot androgendeprivation. Dessutom män som genomgår androgendeprivationterapi för behandling av prostatacancer genomgår cykler av kastrerade och regenere villkor. I mus, kirurgisk kastrering, tillsammans med hormonella regenerering av prostata genom att återinföra testosteron, är ett viktigt verktyg för att studera kastrering motstånd och effekterna av testosteron cykling på prostatan.
I denna artikel kommer vi att diskutera och påvisa tekniker som att Locate och mikro-dissekera en mus prostata, såväl som att kirurgiskt kastrera en mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll uppfyller och följer de riktlinjer som fastställts av Johns Hopkins University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Mikro dissekera en mus Prostate
- Euthanize musen genom kvävning med koldioxid eller en alternativ godkänd metod i enlighet med institutionella riktlinjer djurskötsel och användningsområden.
- Stift musen i ryggläge till en dissektion ombord genom att sätta ett stift genom vart och ett av de fyra tassar.
- Spraya buken med 70% etanol.
- Håll huden på nedre delen av buken med pincett, och använda sax för att klippa genom huden och bukhinna ca 1 cm anterior till öppnandet av penis, noga med att inte skära några organ.
- Skär bort huden och bukhinnan från nedre delen av buken, upp båda sidorna av buken till bröstkorgen, exponera bukhålan.
- Identifiera blåsan och urogenitalsystemet, och utsätta dem genom att försiktigt röra fett och andra organ åt sidan.
- using pincett, grepp sädesledaren vid basen nära urinröret, och riva bort.
- Upprepa med de motsatta sädesledaren.
- Använd pincett försiktigt tag i urinblåsan och dra upp den, samtidigt som du använder sax för att klippa genom urinröret under urinblåsan och ventrala prostatan (ca 1 cm under botten av blåsan).
OBS: Eftersom blåsan dras upp, kommer hela urogenitalsystemet (innehållande urinblåsan, en sektion av urinröret, alla prostata lober, och sädesblåsorna) kommer med den. Det kan finnas ett visst motstånd. - Placera det urogenitala området (UGT) in i ett 60 till 100 mm petriskål innehållande ungefär 5-10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Utför den återstående delen av protokollet under ett dissektionsmikroskop. Använd två fin pincett, en i varje hand. Håll tången "som en penna" och vila underarmarna på bänken toppen, så att stabilisera dem.
- Använd fin pincett för att placera UGT så att blåsan ärpå toppen, är urinröret pekade nedåt, och sädesblåsorna är placerade på vardera sidan av blåsan.
- Ta tag i urinröret med en pincett och dra försiktigt bort fett med andra pincett utan att riva bort någon prostatavävnad. Obs: Fett visas "blanka" i förhållande till den omgivande vävnaden.
- När fettet tas bort, använd pincett för att riva bindväven mellan de två ventrala lober av prostata och skilja dem åt.
- För att ta bort en av de ventrala lober, använd en pincett för att gripa en enda ventralloben nära spetsen, och använda andra pincett att greppa att lob vid basen så nära urinröret som möjligt. Medan fortfarande gripa basen av lob, använder de andra pincett för att gripa urinröret. Dra loben bort från urinröret med en fast, jämn rörelse. Se till att ingen prostatavävnad förblir fäst till urinröret. Placera lob i lämpligt medium, beroende på nästa experimentella steg.
- För att åtgärda och paraffin bädda Sgott för histologisk analys, placera loben i 10% neutral formalin (NBF) 8.
- Placera lob i frysmedium, såsom oktober, för frysförvaring och sektionering 8.
- Placera lob i kall PBS för enskild cell isolering för kultur eller flödescytometri 9.
- Upprepa steg 1,15 med den andra ventrala loben.
- För att ta bort en av de främre lober, använder pincett för att försiktigt dra lob från sädesblåsor, se till att inte punktera sädesblåsor. När lob är oberoende av sädesblåsor, ta bort den på samma sätt som den ventrala loben i steg 1,15.
- Upprepa steg 1,17 med det andra främre lob.
- Vänd den återstående urogenitalsystemet över så att ryggens prostatan är synlig.
- För att ta bort en av de dorsolaterala lober, använder pincett för att riva bindväven mellan de två dorsolaterala lober och även bindväv mellan lober och than bakre regionen av sädesblåsorna. Ta bort loben på ett liknande sätt som den ventrala loben i steg 1,15.
- Upprepa steg 1,20 med den andra dorsolaterala lob.
2. Kirurgisk Kastrering
Notera: Detta är en överlevnads operation, så aseptik, anestesi och smärtlindring är viktiga för den etiska och framgångsrikt slutförande av detta protokoll. Följ alla institutionella riktlinjer djurskötsel och användningsområden. Använda en yttre värmekälla, såsom en återcirkulerande vatten filt, under det kirurgiska förfarandet för att förhindra hypotermi. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt. Autoklav alla kirurgiska instrument före användning i kirurgi.
- På en ren, steril yta söva musen med hjälp av lämpliga åtgärder (t.ex. 2% inhaleras isofluran) och placera mOuse i ryggläge. Obs: Alternativa bedövningsmetoder, såsom ketamin, kan också användas, beroende på den godkända djur protokollet.
- Kontrollera musens reflexer genom att klämma tårna. Om musen inte reagerar, gå vidare till nästa steg. Om det reagerar, vänta 1-3 minuter och kontrollera igen. Raka operationsområdet med en elektrisk rakapparat.
- Aseptiskt förbereda buken av musen med hjälp av alternerande skurar av 70% etanol och jod eller procedurer som rekommenderas av den institutionella veterinärpersonal eller IACUC.
- Med användning av en steril skalpell görs en 1 cm vertikalt snitt genom huden i mittlinjen av de nedre delen av buken, cirka 1,5 cm anterior till penis.
- Gör ett litet snitt (<1 cm) genom bukhinnan, noga med att inte skära några organ.
- Använda steril tång, grepp klippkanten av bukhinnan och lyft upp försiktigt så att kunna se bukhålan under.
- Använda en annan steril pincett, når in the bukhålan och grepp antingen vänster eller höger testikel fettkudden, lateral till urinblåsan. Dra fettkudden genom öppningen i peritoneum och huden tills testis kommer ut också. Var noga med att inte skada andra vävnader eller organ under detta steg.
- Med hjälp av en diatermi penna, skär genom fettkudden som håller testiklarna. Skär långsamt genom testikel artären med diatermi penna Obs: Om testikel artären skärs för fort, kan det bli för mycket blödning och musen kan behöva avlivas.
- När fettkudden och artär skärs bort testiklarna och fettkudden.
- Upprepa steg 2,6-2,9 med den andra testikeln. Notera: En alternativ metod för avlägsnande av testiklarna är att kirurgiskt ligera testikel artären, följt av att skära av kärlet med en sax.
- Sutur bukhinnan stängd med absorberbar sutur.
- Staple huden försluts med kirurgiska sårklämmor.
- Administrera en smärtstillande för att hantera smärta och platsmusen i en ren bur på en bur varmare för 5-10 min. Övervaka musen för tecken på smärta eller blödning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla sex prostata loberna avlägsnades från en mus via prostatamikro dissektion (Figur 1). Den fullständiga urogenitalsystemet (UGT) är sammansatt av alla prostata lober, urinblåsan, sädesblåsorna och urinröret (Figur 1A). Sädesledaren fäster till urinröret, men är onödigt för prostata mikro-dissektion, och kan därmed lösgöras före avlägsnande av UGT genom att skära urinröret (figur 1b-1c). Den urogenitalsystemet förblir tillsammans en gång avlägsnas från buken (figur 1d). Vid denna tidpunkt förblir UGT täckt av fettvävnad, som måste tas bort för att få tillgång till prostata lober (Figur 1e). Alla sex lober (ventrala, främre och dorsolaterala par) kan ses som omger urinröret vid basen av urinblåsan. Ren prostatavävnad kan sedan tas bort efter protokollet ovan (figur 1F). Dessa lober kanplaceras i lämpligt medium för vidare analys.
Kastrering är avlägsnandet av testiklarna, som är de främsta producenterna av testosteron. Testosteron är närvarande i musen tills kastrering inträffar, vid vilken punkt prostatan regresses (figur 2a). Hormonella förnyelse via återinförande av testosteron kan följa kastrering (Figur 2b). Vi utförde kastrering, följt av två cykler av hormonell regenerering, och testosteronnivåer övervakades i musserum genom ELISA (Figur 3). Under kastreringsförhållanden, testosteronnivåer försvinner nästan. Alternativt, tamoxifen (en selektiv östrogenreceptor modulator) visar ingen signifikant skillnad för hormonellt normalt tillstånd. Efter kastrering, testosteron återinfördes på musen, vilket testosteronnivåer att spika dramatiskt (Figur 3). Vi sedan mikro dissekeras prostata lObes hos mössen och avbildas dessa som individuella främre loberna (Figur 4A). Vi också formalinfixerade, paraffininbäddade, och sektione vävnaden. Figur 4b visar hematoxylin och eosin färgade främre prostatavävnad under normala, kastrerade, och regenereras betingelser. Kastrerade prostata lober krympa för att approximera en tiondel så stor som en normal prostata, och att hormonella regenereåter prostatan till sin ursprungliga storlek.
Figur 1: Brutto histologi av prostata Micro-dissektion protokoll. (A) urogenitalsystemet (UGT) i sitt naturliga tillstånd, exponeras i murina buken. De streckade linjerna omfattar olika delar av UGT, inklusive sädesblåsorna (SV), prostata lober (främre prostata (AP) och ventrala prostata (VP) syns här), urinblåsa (B), och urinröret (belägen varaneath blåsan). Sädesledaren (VD) är också synlig. (B) De sädesledaren har avlägsnats. Pilen pekar på regionen där sädesledaren har avlägsnats. (C) Den UGT har avlägsnats från buken genom att skära urinröret under de ventrala prostata lober. (D) Den UGT har placerats i PBS och ses under ett dissektionsmikroskop. (E) Fett har tagits bort från UGT, vilket möjliggör synlighet alla sex lober av prostata. Pilarna pekar på de två främre loberna, de ventrala lober, och de dorsolaterala lober. (F) Alla sex individuella prostata lober har tagits bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: TimEline för Kastrering och hormonella Regeneration. (a) Testosteron är närvarande vid fysiologiska nivåer fram kastrering, när testosteron försvinner och regression av prostatan börjar. (B) Kastrering bort testosteron, tills testosteron återinförs, orsakar hormon förnyelse av prostatan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Testosteronnivåer hos olika hormonella förhållanden Testosteron ELISA enligt tamoxifen behandlade, hormonellt normal, kastrerad, och hormonellt regener villkor. Regenererad x 2 avser implantering och avlägsnande av syntetiskt testosteron, följt av implantation av en andra omgång av syntetiskt testosteron. Felstaplar representerar standard avvikelse. Denna siffra har ändrats från 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Prostata Utseende enligt kastrering och Regeneration förhållanden (a) Brutto utseende främre prostata lober enligt kastrerade, hormonellt normala, och hormonellt regenere förhållanden.. Regenererad x 2 avser implantering och avlägsnande av syntetiskt testosteron, följt av implantation av en andra omgång av syntetiskt testosteron. (B) formalinfixerade, paraffininbäddade främre prostata lober snittades och färgades med hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en storr version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prostata mikro-dissektion möjliggör lob specifika experiment och analys av mus prostata (Figur 1). I genetiskt modifierade musmodeller kan fenotyper ses i en lob som inte syns i andra. Även för histologisk analys, försäkrar detta protokoll att den maximala mängden ren prostatavävnad kan sektioneras och färgas, utan andra urogenitalsystemet vävnader som finns i avsnittet. Slutligen, för encelliga experiment, ger detta protokoll för isolering av nästan rena prostataceller. Epitelceller anriknings kit kan ytterligare rena prostataceller från stromaceller. Begränsningar till mikro dissektion inkluderar användning av en dissektion mikroskop, och inlärningskurvan nödvändigt att använda fin pincett medan du tittar genom dissektion mikroskop. Alternativt kan prostatavävnad sektion för histologi som en del av UGT, gör mikro dissektion onödig. Dock är nackdelen med att sektione hela UGT attandra vävnader kommer att vara närvarande i sektionen, vilket gör det inte så rena. Dessutom, för att generera enstaka prostata cellpopulationer, loberna måste separeras från UGT att undvika kontaminering.
Kirurgisk kastrering är en grundläggande operation för många prostataforskningslaboratorier och är nödvändig för att studera effekterna av testosteron på prostata utveckling och sjukdom. Detta protokoll är snabb (typiskt tid för operation för en van användare är ca 5 min) och tar bort nästan 100% av testosteron ur omlopp (Figur 3). Notera testosteronnivåer hos möss skiljer sig avsevärt, och kan variera med så mycket som 30-faldigt från mus till mus 10. Kastrering avlägsnar denna variation. Efter kastrering kan forskare väljer att lägga testosteron tillbaka till regenerera prostata (figurerna 3 - 4). Detta kan göras genom att subkutant implantera en källa av testosteron, såsom en osmotisk pump, en testosteronpellet eller ett semipermeabelt silastic-rör innehållande testosteron pulver 8. Beroende på mängden testosteron tillsätts, kan detta förfarande ge fysiologiska att superphysiological testosteronnivåer i cirkulationen (Figur 3). Detta protokoll kan också användas för att studera prostatacellhärstamning och stamcellsbiologi 11. Ett annat alternativ är kemisk kastrering eller androgendeprivationterapi, via behandling av möss med föreningar som hämmar produktionen av testosteron, såsom dutasterid 12. Detta efterliknar också en vanlig behandling av cancerpatienter prostata, som sällan kirurgiskt kastrerade. Men ger kirurgisk kastrering en tillförlitlig, permanent metod för att avlägsna praktiskt taget alla testosteron. Det är viktigt att beakta att binjurarna syntetisera även androgen arter, såsom androstendion och dehydroepiandrosteron, som kan omvandlas till testosteron, men i mycket mindre mängder i förhållande till testiklarna13. I vissa fall, binjurarna kan också tas bort kirurgiskt, även om detta förfarande är svårare.
Sammantaget dessa två protokoll är användbara för en myriad av forskning om prostatasjukdomar, såväl som hormonella studier. Dessa protokoll är ett tillförlitligt och konsekvent sätt för att analysera prostata biologi i hormon normala, kastrerade eller hormonellt regenere förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Några av siffrorna i detta manuskript var generöst tillhandahålls av laboratoriet av Bart O. Williams. Författarna stöds av National Cancer Institute ger U54CA143803, CA163124, CA093900 OCH CA143055.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Roehrborn, C. G.
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Drug discovery in prostate cancer mouse models. Expert Opin Drug Discov. , 1-14 (2015).
- El-Alfy, M., Pelletier, G., Hermo, L. S., Labrie, F. Unique features of the basal cells of human prostate epithelium. Microsc Res Tech. 51 (5), 436-446 (2000).
- Prins, G. S., Huang, L., Birch, L., Pu, Y. The role of estrogens in normal and abnormal development of the prostate gland. Ann N Y Acad Sci. 1089, 1-13 (2006).
- Valkenburg, K. C., et al. Activation of Wnt/beta-catenin signaling in a subpopulation of murine prostate luminal epithelial cells induces high grade prostate intraepithelial neoplasia. Prostate. 74 (15), 1506-1520 (2014).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5 (4), 702-713 (2010).
- Michiel Sedelaar, J. P., Dalrymple, S. S., Isaacs, J. T. Of mice and men--warning: intact versus castrated adult male mice as xenograft hosts are equivalent to hypogonadal versus abiraterone treated aging human males, respectively. Prostate. 73 (12), 1316-1325 (2013).
- Wang, X., et al. A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer. Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).
- Pascal, L. E., et al. 5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy. J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
