Summary
Questo manoscritto descrive i protocolli per la prostata micro-dissezione e la castrazione chirurgica nel topo di laboratorio. Noi raffiguriamo anche risultati rappresentativi prodotti da questi protocolli. Infine, si discute i vantaggi e l'utilizzo di questi protocolli.
Introduction
La prostata è il sito più comune di cancro negli uomini negli Stati Uniti. Quasi 220.000 uomini ogni anno saranno con diagnosi di cancro alla prostata, e circa 27.000 uomini soccombere alla loro malattia 1. Gli uomini hanno un rischio 1 a 7 vita di una diagnosi di cancro alla prostata negli Stati Uniti 1. Iperplasia prostatica benigna (BPH), un noncancerous ingrandimento legata all'età della prostata, è anche una condizione molto diffusa, che colpisce oltre l'80% degli uomini oltre 80 2. In quanto tale, la prostata è al centro di molte ricerche.
Modelli di topo sono stati utilizzati ampiamente per studiare le malattie della prostata 3. Nel complesso, la prostata mouse è un ottimo rappresentante della ghiandola umana 4, ma ci sono somiglianze e le differenze tra il mouse e anatomia della prostata umana e fisiologia 5. In entrambe le specie, la prostata si trova alla base della vescica, che circonda l'uretra. La prostata di essere una sola loessere, diviso in quattro zone: centrale, di transizione, periferiche, e stroma fibromuscolare anteriore. Al contrario, la prostata mouse è suddiviso in tre lobi accoppiati a diverse posizioni intorno all'uretra: anteriore, ventrale e dorsolateral. A livello cellulare, la differenza principale è che la cellula basale rapporto cellulare luminale nell'uomo è di circa 1: 1, ma è 1: 4 in topi 6. Lo stroma murino è inoltre differente nei topi relativi agli esseri umani - esseri umani hanno più estesa muscolatura liscia, mentre lo strato muscolare è molto più sottile nella prostata murino. La corretta identificazione, la dissezione, e la manipolazione della prostata del mouse sono essenziali per la ricerca del mouse prostata.
i livelli ormonali influenzano drasticamente lo sviluppo e l'omeostasi della ghiandola prostatica in entrambi gli uomini e topi. Mentre gli estrogeni sembra giocare un ruolo nello sviluppo della prostata 7, l'ormone più importante nella prostata è testosterone. Il testosterone è essenziale per uno sviluppo ghiandolared manutenzione. Dopo castrazione fisica o chimica, circa il 90% delle cellule luminali del Apoptose adulti prostata, e la ghiandola restringe. Se il testosterone viene reintrodotto ad un individuo in condizioni di castrazione, la prostata è in grado di rigenerarsi a piena capacità. Il testosterone sembra anche a guidare il cancro alla prostata, che è il motivo per cui la terapia di deprivazione androgenica è una strategia terapeutica di uso comune. Tuttavia, molti tumori della prostata diventano resistenti alla deprivazione androgenica. Inoltre, gli uomini sottoposti a terapia di deprivazione androgenica per il trattamento del cancro alla prostata sottoposti a cicli di condizioni castrati e rigenerati. Nel topo, la castrazione chirurgica, insieme con la rigenerazione ormonale della prostata reintroducendo il testosterone, è un importante strumento con cui studiare la resistenza castrazione e gli effetti del testosterone in bicicletta sulla prostata.
In questo articolo, si discuterà e dimostrare le tecniche adeguate in base ai quali Locatee micro-sezionare una prostata mouse, nonché chirurgicamente castrare un mouse.
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Protocol
Questo protocollo incontra e segue le linee guida stabilite dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Johns Hopkins University.
1. Micro-dissezione una prostata mouse
- Eutanasia il mouse per asfissia anidride carbonica o un metodo approvato alternativo in conformità con le linee guida per la cura degli animali e uso istituzionale.
- Pin il mouse nella posizione supina ad una tavola di dissezione mettendo un perno attraverso ciascuno dei quattro zampe.
- Spruzzare la addome con etanolo al 70%.
- Tenere la pelle del basso addome con una pinza, e usare le forbici per tagliare attraverso la pelle e peritoneo circa 1 cm anteriormente all'apertura del pene, attenzione a non tagliare tutti gli organi.
- Tagliare la pelle e del peritoneo dal basso addome, fino entrambi i lati dell'addome alla gabbia toracica, esponendo la cavità peritoneale.
- Identificare la vescica e del tratto urogenitale, ed esporli delicatamente spostando grassi e altri organi di lato.
- Usiforcipe Ng, presa vasi deferenti alla base vicino l'uretra, e strappare via.
- Ripetere con il dotto deferente opposte.
- Utilizzando pinze, accuratamente afferrare la vescica e tirarlo, mentre simultaneamente con le forbici per tagliare attraverso l'uretra sotto la vescica e la prostata ventrale (circa 1 cm sotto la base della vescica).
Nota: Poiché la vescica è tirato su, il (vescica contenente una sezione dell'uretra, tutti i lobi della prostata e le vescicole seminali) intero tratto urogenitale verrà con esso. Ci può essere una certa resistenza. - Posizionare il tratto urogenitale (UGT) in un 60-100 mm piastra di Petri contenente circa 5-10 ml tampone fosfato salino (PBS).
- Eseguire la parte restante del protocollo sotto un microscopio di dissezione. Utilizzare due pinza sottile, uno in ogni mano. Tenere le pinze "come una matita" e riposare gli avambracci sul banco in modo da stabilizzare loro.
- Utilizzare una pinza sottile per posizionare la UGT in modo tale che la vescica èsopra, l'uretra è puntato verso il basso, e le vescicole seminali sono posizionate su entrambi i lati della vescica.
- Grip l'uretra con una pinza ed estrarre delicatamente il grasso con gli altri pinze senza strappare via qualsiasi tessuto prostatico. Nota: Fat apparirà relativo "lucido" al tessuto circostante.
- Una volta che il grasso viene rimosso, utilizzare pinze per strappare il tessuto connettivo tra i due lobi ventrali della prostata e separarli.
- Per rimuovere uno dei lobi ventrali, usare una pinza per afferrare un unico lobo ventrale, vicino alla punta, e utilizzare le altre pinze per afferrare che lobo alla base il più vicino al uretra più possibile. Mentre ancora presa alla base del lobo, utilizzare le altre pinze per afferrare la uretra. Estrarre il lobo di distanza dall'uretra con una ditta, movimento regolare. Assicurarsi che nessun tessuto prostatico rimane attaccato al uretra. Posizionare il lobo nel mezzo appropriata, a seconda del passo successivo sperimentale.
- Per risolvere il problema e di paraffina-incorporare le sampio per l'analisi istologica, posizionare il lobo in formalina neutra tamponata al 10% (NBF) 8.
- Posizionare il lobo di congelamento di media, come ad esempio Office, per la crioconservazione e sezionamento 8.
- Posizionare il lobo in PBS freddo per l'isolamento delle cellule unico per la cultura o citometria a flusso 9.
- Ripetere il passaggio 1.15 con l'altro lobo ventrale.
- Per rimuovere uno dei lobi frontali, usare il forcipe per tirare delicatamente il lobo di distanza dal vescicole seminali, facendo attenzione a non forare la vescicole seminali. Una volta che il lobo è indipendente della vescicola seminale, rimuoverlo nello stesso modo come il lobo ventrale passo 1.15.
- Ripetere il passaggio 1.17 con l'altro lobo anteriore.
- Vibrazione tratto urogenitale restante sopra tale che la prostata dorsale è visibile.
- Per rimuovere uno dei lobi dorsolaterali, utilizzare pinze per strappare il tessuto connettivo tra i due lobi dorsolaterali e anche il tessuto connettivo tra i lobi e tegli posteriormente regione delle vescicole seminali. Rimuovere il lobo in modo simile come il lobo ventrale passo 1.15.
- Ripetere il passaggio 1.20 con l'altro lobo dorsolaterale.
2. castrazione chirurgica
Nota: Si tratta di un intervento chirurgico di sopravvivenza, così asepsi, anestesia, e la gestione del dolore sono importanti per il completamento etica e di successo di questo protocollo. Seguire tutte le linee guida per la cura degli animali e uso istituzionale. Utilizzare una fonte di calore esterna, ad esempio una coperta di acqua ricircolo, durante la procedura chirurgica per prevenire l'ipotermia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'uso in chirurgia.
- Su una superficie pulita e sterile anestetizzare il mouse utilizzando misure appropriate (ad esempio 2% isoflurano per via inalatoria) e posizionare il mOuse in posizione supina. Nota: Metodi anestesia alternativi, come la chetamina, possono anche essere utilizzati, a seconda del protocollo animali approvato.
- Controllare i riflessi del topo pizzicando le dita dei piedi. Se il mouse non reagisce, passare alla fase successiva. Se non reagisce, aspettare 1-3 minuti e prova di nuovo. Radere l'area chirurgica con un rasoio elettrico.
- Asetticamente preparare l'addome del mouse utilizzando alternati scrub di etanolo al 70% e iodio o procedure raccomandate dal personale veterinario istituzionale o IACUC.
- Usando un bisturi sterile, praticare un'incisione verticale 1 centimetro attraverso la pelle sulla linea mediana del basso addome, circa 1,5 cm anteriormente al pene.
- Fai una piccola incisione (<1 cm) attraverso il peritoneo, attenzione a non tagliare tutti gli organi.
- Utilizzando pinze sterili, afferrare il bordo tagliato del peritoneo e sollevarlo leggermente in modo da poter vedere la cavità peritoneale sotto.
- Utilizzando un altro pinza sterile, raggiungere in the cavità peritoneale e il grip sia il cuscinetto di grasso testicolare a sinistra oa destra, laterale alla vescica. Estrarre il cuscinetto adiposo attraverso l'apertura nel peritoneo e pelle fino testicolo esce pure. Fare attenzione a non danneggiare altri tessuti o organi durante questa fase.
- Usando una penna cauterizzazione, tagliare il cuscinetto adiposo che sta tenendo il testicolo. Tagliare lentamente attraverso l'arteria testicolare con la penna cauterizzazione Nota: Se l'arteria testicolare è tagliato troppo veloce, ci può essere troppo sanguinamento e il mouse possono avere per essere eutanasia.
- Una volta che il cuscinetto di grasso e l'arteria sono tagliati, rimuovere il pad testicoli e grassi.
- Ripetere i passaggi 2,6-2,9 con l'altro testicolo. Nota: Un metodo alternativo per la rimozione dei testicoli è quello di legare chirurgicamente l'arteria testicolare, quindi tagliato nave con le forbici.
- Sutura del peritoneo chiusa con suture assorbibili.
- Staple la pelle chiusa con clip ferita chirurgica.
- Somministrare un analgesico per gestire il dolore, e il luogoil mouse in una gabbia pulita su una gabbia caldo per 5-10 min. Monitorare il mouse per i segni di dolore o sanguinamento.
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Representative Results
Tutti i sei lobi della prostata sono stati rimossi da un mouse via prostata micro-dissezione (Figura 1). Il tratto urogenitale completa (UGT) è composta da tutti i lobi della prostata, della vescica, vescicole seminali, e l'uretra (Figura 1A). I vasi deferenti attribuisce al uretra, ma non è necessaria per la prostata micro-dissezione, e possono quindi essere staccati prima della rimozione della UGT tagliando l'uretra (Figura 1b-1c). Il tratto urogenitale rimarrà insieme una volta rimosso dall'addome (Figura 1d). A questo punto, l'UGT rimane coperto in tessuto adiposo, che deve essere rimosso per accedere ai lobi della prostata (Figura 1E). Tutti i sei lobi (ventrale, anteriori e accoppiamenti dorsolaterali) può essere visto circonda l'uretra alla base della vescica. Tessuto prostatico puro può quindi essere rimosso seguendo il protocollo di cui sopra (Figura 1f). Questi lobi possonoessere collocato nel mezzo appropriato per ulteriori analisi.
Castrazione è la rimozione dei testicoli, che sono i produttori primari di testosterone. Il testosterone è presente nel topo finché non si verifica la castrazione, a questo punto la prostata regredisce (Figura 2a). Rigenerazione ormonale attraverso la reintroduzione di testosterone può seguire la castrazione (Figura 2b). Abbiamo eseguito la castrazione, seguita da due cicli di rigenerazione ormonale, e livelli di testosterone sono stati monitorati nel siero di topo mediante ELISA (Figura 3). In condizioni di castrazione, i livelli di testosterone praticamente scomparire. In alternativa, tamoxifene (un selettivo del recettore dell'estrogeno modulatore) non mostra alcuna differenza significativa per la condizione normale ormonale. Dopo la castrazione, il testosterone è stato reintrodotto al mouse, provocando livelli di testosterone a picco drammaticamente (Figura 3). Abbiamo poi micro-sezionato prostata lOBE dei topi e li ripreso come singoli lobi anteriore (figura 4a). Abbiamo inoltre fissati in formalina, inclusi in paraffina, e sezionato il tessuto. Figura 4b mostra ematossilina eosina di tessuto prostatico anteriore tinto in condizioni normali, castrato e condizioni rigenerati. lobi della prostata castrati ridursi per approssimare un decimo delle dimensioni di una prostata normale, e che la rigenerazione ormonale ripristina la prostata alla sua dimensione originale.
Figura 1: Gross Istologia del Micro-dissezione protocollo prostata. (A) Il tratto urogenitale (UGT) nel suo stato naturale, esposto nell'addome murino. Le linee tratteggiate comprendono le varie parti della UGT, comprese le vescicole seminali (SV), lobi della prostata (prostata anteriore (AP) e della prostata ventrale (VP) sono visibili qui), vescica (B), e dell'uretra (situata essereSotto i vescica). Il dotto deferente (VD) è anche visibile. (B) Il dotto deferente sono stati rimossi. La freccia indica la regione da cui è stato rimosso il dotto deferente. (C) La UGT è stato rimosso dall'addome tagliando l'uretra sotto dei lobi della prostata ventrale. (D) La UGT è stata posta in PBS ed è visto sotto un microscopio di dissezione. (E) grasso è stato rimosso dalla UGT, consentendo la visibilità di tutte e sei lobi della prostata. Le frecce indicano i due lobi frontali, i lobi ventrali, ed i lobi dorsolaterale. (F) i singoli Tutti e sei i lobi della prostata sono stati rimossi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: TimEline per castrazione e ormonale rigenerazione. (a) è presente a livelli fisiologici, fino castrazione testosterone, quando il testosterone scompare e la regressione della prostata inizia. (B) Castrazione rimuove il testosterone, fino a quando il testosterone viene reintrodotto, causando la rigenerazione ormonale della prostata. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Livelli di testosterone in diverse condizioni ormonali Testosterone ELISA sotto tamoxifene trattata, ormonalmente normale, castrato, e ormonalmente condizioni rigenerato. Rigenerata x 2 si riferisce a impianto e la rimozione di testosterone sintetico, seguita da impianto di un secondo round di testosterone sintetico. Le barre di errore rappresentano stanDeviazione Dard. Questo dato è stato modificato da 5. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Aspetto prostata sotto la castrazione e rigenerazione condizioni (a) comparsa lordo di lobi anteriore della prostata in condizioni castrati, ormonalmente normali, e ormonalmente rigenerati.. Rigenerata x 2 si riferisce a impianto e la rimozione di testosterone sintetico, seguita da impianto di un secondo round di testosterone sintetico. (B) in formalina-fisso, anteriore lobi della prostata inclusi in paraffina sezionati e colorati con ematossilina eosina. Cliccate qui per vedere una grander Versione di questa figura.
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Discussion
Prostate micro-dissezione consente di sperimentazione specifici lobi e analisi della prostata mouse (Figura 1). Nei modelli di topo geneticamente, fenotipi possono essere visti in un lobo che non si vede in altri. Inoltre, per l'analisi istologica, questo protocollo assicura che la massima quantità di tessuto prostatico puro può essere sezionato e macchiato, senza altri tessuti del tratto urogenitale presenti nella sezione. Infine, per gli esperimenti a cella singola, questo protocollo permette per l'isolamento delle cellule della prostata quasi puro. kit di arricchimento delle cellule epiteliali possono ulteriormente purificare cellule della prostata da cellule stromali. Limitazioni micro-dissezione includono l'uso di un microscopio dissezione, e la curva di apprendimento necessario utilizzare una pinza sottile guardando attraverso il microscopio di dissezione. In alternativa, il tessuto prostatico può essere sezionato per l'istologia come parte della UGT, rendendo micro-dissezione inutili. Tuttavia, l'aspetto negativo di sezionamento l'intero UGT è chealtri tessuti saranno presenti nella sezione, rendendolo non pulite. Inoltre, per generare popolazioni singole cellule della prostata, i lobi devono essere separati dalla UGT per evitare la contaminazione.
castrazione chirurgica è un intervento fondamentale per molti laboratori di ricerca prostata ed è essenziale per lo studio degli effetti del testosterone sullo sviluppo della prostata e la malattia. Questo protocollo è rapido (tempo tipico di un intervento chirurgico per un utente esperto è di circa 5 min) e rimuove quasi il 100% di testosterone dalla circolazione (Figura 3). Di nota, i livelli di testosterone in topi differiscono in modo significativo, e possono variare da tanto quanto 30 volte da mouse per il mouse 10. La castrazione rimuove questa variazione. Dopo la castrazione, i ricercatori possono decidere di aggiungere il testosterone nel rigenerare prostata (figure 3 - 4). Questo può essere fatto sottocutanea impiantare una fonte di testosterone, ad esempio una pompa osmotica, un testosteronepellet, o un tubo silastic semipermeabile contenente testosterone in polvere 8. A seconda della quantità di testosterone aggiunta, questa procedura può fornire fisiologica superphysiological livelli di testosterone nella circolazione (Figura 3). Questo protocollo può anche essere usato per studiare linea cellulare prostatica e biologia delle cellule staminali 11. Un'altra opzione è la castrazione chimica, o terapia di deprivazione androgenica, tramite il trattamento dei topi con composti che inibiscono la produzione di testosterone, come dutasteride 12. Questo imita anche un trattamento comune dei pazienti affetti da cancro alla prostata, che sono raramente chirurgicamente castrati. Tuttavia, castrazione chirurgica fornisce un metodo permanente affidabile per la rimozione della quasi totalità testosterone. È importante considerare che le ghiandole surrenali sintetizzano anche specie androgeni, come androstenedione e deidroepiandrosterone, che può essere convertita in testosterone, anche se importi molto più piccoli, relativi ai testicoli13. In alcuni casi, le ghiandole surrenali possono anche essere rimosse chirurgicamente, se questa procedura è più difficile.
Nel complesso, questi due protocolli sono utili per una miriade di ricerca sulle malattie della prostata, nonché studi ormonali. Questi protocolli sono un modo affidabile e coerente per analizzare la biologia della prostata in condizioni normali ormonalmente, castrato, o ormonale rigenerati.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Alcune delle figure in questo manoscritto sono stati generosamente fornito dal laboratorio di Bart O. Williams. Gli autori sono supportati dal National Cancer Institute concede U54CA143803, CA163124, CA093900, CA143055 E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
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