Summary
콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.
Protocol
1. 중화, 희석 및 3D 조사 및 세포 수축 분석 실험을위한 콜라겐 솔루션의 중합
- 무균 조직 배양 후드에서 얼음에, 콜라겐 (1 : 1) 중화 2 배 PBS에서 살균, 얼음처럼 차가운 100 mM의 HEPES, 15 ML 원뿔 튜브의 pH 7.4,와. 용액이 균질하지 않고 혼합 소용돌이가 더 이상 볼 수 있습니다 때까지 플라스틱 피펫 충분히 섞는다. 혼합 과정에서 공기 방울을 소개 않도록주의하십시오. 얼음에 잠시 저장합니다.
- 세포 미디어와 적절한 농도 (등 RPMI, DMEM, 등)에 중화 된 콜라겐을 희석.
- N은 = (D은 V *), V는 / (S / 2), N이 필요 중화 콜라겐 양이고는 D 원하는 콜라겐 농도는 인 등식을 사용하여 목적하는 콜라겐의 농도를 확인하는 데 필요한 중화 콜라겐의 양을 계산하는데 바람직한 콜라겐 농도의 최종 부피 및 S는 t이며그는 재고 콜라겐 농도를 시작.
- 세포 및 세포 배지 용액을 첨가하여 부피로 중화 콜라겐의 양을 준비한다. 철저하게 혼합하고 주조 할 준비가 될 때까지 얼음에 저장합니다.
- 예 : (6 웰 플레이트 또는 50mm 유리 바닥 접시 겔 캐스팅을위한 일반적인 양), 2 ㎎ / ㎖의 1 ㎖의 겔 부피 젤 먼저 원하는 최종 부피 원하는 농도 (2 ㎎ / ㎖)을 곱 (1 mL)을 첨가 하였다. 이 번호 (2 mg)을 가지고 병에 상장 주식 농도 (9.49 ㎎ / ㎖)의 절반을 나눕니다. 이 경우, 중화 된 콜라겐 0.42 mL의 미디어 / 세포 혼합액 0.58 ㎖로 희석한다.
- 피펫이 아닌 조직 배양 중 하나에 얼음처럼 차가운 콜라겐 / 셀 / 미디어 혼합물을 6 웰 플레이트 또는 50mm의 유리 바닥 접시를 처리 하였다. 균등하게 솔루션을 확산 피펫 팁을 사용합니다.
주 : collag 외부 세포의 부착 또는 성장을 최소화하기 위해 처리 된 플레이트가 아닌 조직 배양을 사용하는 것이 중요젤 갖추고 있습니다. - 15 분 - 약 10 상온에서 중합 할 수 있습니다. 겔 중합에 불투명 설정해야합니다.
- 중합을 완료 60 분 -이 불투명 설정 한 후, 추가로 45 37 ˚C에 플레이트 접시를 이동합니다.
- 45 후 - 잘 또는 접시의 경계 주위 P200 피펫 팁을 실행하여 잘의 측면에서 젤 미디어의 3 ㎖ 및 해제 - 60 분, 2를 추가합니다. 소용돌이 요리 부드럽게 젤을 분리합니다. 콜라겐 젤은 미디어에 떠되어야한다.
2. 웨스턴 블로 팅, 세포 형태 형성 및 젤 Gontractility 분석은
- 십일 분석 - 7에 대한 세포와 시드, 1.6 - 강성을 ECM 관련하여 단백질 수준, 형태 또는 휴대 수축력을 평가하기 위해, 1.1에 따라, 콜라겐 젤을 부어 시작합니다. 성장률 및 포화 상태에 따라 경험적으로 각 세포주 시드 레이트를 결정한다. 100,000 세포 / 겔 - 10 일 시험의 경우, 파종 밀도에서 20000의 범위 일 수있다.
- 측정세포 수축은 룰러 또는 카메라 매 24 시간을 사용하거나, 적당한 시간 간격으로 겔 직경을 측정한다.
주 : 또한 현미경 수집 대응하는 이미지는 꽈리 형 구조, 세뇨관 상피 세포 돌기 및 lameliapodia 같이 겔 시드 세포주의 형태 적 특징의 특성을 검사 할 수있다. - , 단백질 수준을 평가 워즈니악 등. (17)와 갤러거 등. (18)의 설명에 따라 관심의 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 위해 RIPA에서 젤은 버퍼 용균 및 방법에 관한 것이다.
- 중요 : 세포 라인 사이의 수축의 비교에서, 루이에 의해 설명 된대로 젤에서 추출 할 수있는 전체 DNA에 수축력을 정상화, 등 (19), 또는 서양에 의해 변하지 않는, 가사 단백질 (히스톤, GAPDH, 등). 블롯 분석, 워즈니악 등. (17)와 갤러거 등의 설명에 따라. (18). 겔 내에서 계산 세포는 혈구를 사용하는 경우, 세포를 집중 계약 젤 등 총 젤 지역에 휴대폰 번호를 정상화해야합니다.
- 매체 1 ㎖를 제거하고 신선한 미디어 1 ㎖로 교체하여 4 일 - 피드 겔 매 3. 측정이 수축에 스파이크가 발생할 신선한 미디어 / 혈청의 첨가로 촬영 한 후 젤을 공급해야합니다.
콜라겐 섬유 정렬을위한 PDMS 마이크로 채널 3 세대
참고 : 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하려면, PDMS 마이크로 채널 (그림 2A)을위한 금형은 소프트 리소그래피 (15)를 통해 만들어진 SU-8 실리콘 마스터가 필요합니다.
- PDMS 채널을 만들기 위해, 공예 막대기로 일회용 컵에 철저하게 PDMS를 섞는다. 6 인치 실리콘 마스터를 들어, 경화제 2 g의 엘라스토머베이스 20g을 혼합한다.
- 탈 가스를 진공 압력으로 진공 챔버의 일회용 컵을 배치하여 PDMS 혼합물550mm 수은. 드 가스 1 - 1.5 시간.
- PDMS의를 드 가스 배출하지만, 쏟아져의 실리콘 마스터를 준비합니다. 실리콘 마스터이어서, 핫 플레이트 상에 투명 필름의 깨끗한 시트를 배치하여 준비한다. 마이크로 몰드가 직면하고 있는지 확인합니다.
주 : PDMS 주조 및 경화 동안 실리콘 마스터 투명 필름 두 장 사이에 개재된다. - 한 후 - 1.5 시간, 진공 챔버에서 탈기 PDMS를 제거하고 천천히 실리콘 마스터 위에 붓는다.
중요 : 공기 방울을 피하십시오. 마스터의 중심에 부어, 그리고 중력이 균등하게 확산 할 수 있도록 계속합니다.
주 : PDMS 드롭 마스터 가장자리 끝까지 연장 할 필요는 없다. - PDMS 마스터에 부은 후 실리콘 마스터와 PDMS 위에 투명 필름의 제 2 시트를 적용한다. 조심 기포 않도록 아래 PDMS / 실리콘 마스터 위에 제 투명성 시트 롤. 서두르지 마. PDMS는 지금 균등 O를 확산해야버전 마스터.
- 부드럽게 1/8 "아크릴 시트 뒤에 투명성의 상단에 고무 시트를 배치합니다.
- 아크릴 시트의 상단에 세 10 파운드 무게를 추가합니다. 초기에, 가중치는 "부유"한다. 그들이 더 진행하기 전에 정착 및 안정화 할 수 있습니다.
- 4 시간 동안 70 ℃ 및 치료 PDMS에 열판의 온도를 설정합니다. 방해하기 전에 1 추가 시간의 최소 냉각시킵니다.
- 조심스럽게 웨이퍼에서 투명 필름 위에 시트를 벗겨, 그리고 집게로 채널을 제거합니다.
- 준비가 될 때까지 먼지가없는 접시에 스토어 사용할 수 있습니다.
사용 4. 준비하고 PDMS 마이크로 채널
- 거꾸로 새로운, 깨끗한 투명 필름에 배치 채널. 날카로운 집게로 원 운동을 사용하여 청소 모든 포트 (그림 2b). PDMS의 조각을 제거합니다.
- 압정으로 천 테이프 포장의 일부를 이용하여 채널 면도. 벤치의 표면 (최대 접착면)에 테이프를 적용하고 채널 O를 설정n 개의 최고. 좋은 접촉을 보장하기 위해 집게의 둥근 끝 채널 아래로 누릅니다. 분리 보이는 이물질이 제거 될 때까지 양쪽 반복한다.
- 전사 세정은, 70 % EtOH로 50 ml의 원추형으로 PDMS 채널 수험 공부. 30 초 동안 최대 속도로 소용돌이. EtOH를 폐기하고 신선한 70 % EtOH로 교체합니다. 준비가 될 때까지 70 %의 EtOH에 보관 사용하기.
- 조직 문화 후드 및 무균 기술을 사용하여, 깨끗하고 무균 커버 유리 또는 유리 바닥 요리에 PDMS 채널을 전송할 수 있습니다. EtOH로 증발 할 때까지 채널면이 위로와 UV 치료를 넣습니다.
- 채널은 커브 글라스를 향해 아래로 향하게되도록 일단 건조의 PDMS를 뒤집습니다. 좋은 도장을 확인하기 위해 유리에 PDMS 채널을 누르십시오. 커버하는 멸균 PDMS의 패치를 추가 / 중앙 포트습니다 (포트 B를 그림 2B). 진행하기 전에에 철저하게 건조 할 수 있습니다.
- 프리 코트 멸균 10 μg의 / ㎖의 콜라겐으로 채널 내부. 코팅하는 chann의 상부에 100 μL 방울을 배치엘, 그리고 진공을 통해 그립니다. 37 ℃에서 1 시간 후, 냉장고 콜라겐 코팅 용액으로 채워져 전송 채널. 30 분 - 약 15 침착 해.
- 흡입기 또는 피펫으로 콜라겐 코팅 용액을 제거하고, 콜라겐의 제조를 시작한다.
마이크로 채널 사용 5. 콜라겐 준비
- 배 PBS, pH를 7.4에서 얼음처럼 차가운 100 mM의 HEPES와 : 얼음에, 콜라겐 (1 일)을 중화. 균질 할 때까지 철저하게 믹스 (자세한 내용은 섹션 1.1 참조).
- 세포 미디어와 적절한 농도 중화 콜라겐을 희석 (자세한 내용은 1.2 절 참조). 얼음에 15 분 동안 품어.
- 동시에, 냉각 얼음에 채널을 탑재.
참고 : 목표 아래 4 C 또는에서 채널 프로세스의 모든 구성 요소를 가지고있다. 콜라겐 핵 생성 온도 및 시간은 중합 공정에 중요한 파라미터이고, 필요한 경우, 추가의 최적화를위한 시작점이 될 수있다. - COUN이때 적절한 접종 밀도에서 hemacytometer와 함께 재현 탁 t 세포. 3,000,000 세포 / ml - 계산의 편의를 위해, (1)에 재현 탁. (자세한 내용은 또한 2.1 절 참조).
- 세포가 계산되었고, 15 분 경과하면, 쏟아지는 콜라겐을 진행합니다.
6. 정렬 및 임의의 콜라겐 마이크로 채널 붓는
- 채널을 통해 콜라겐을 그리기 전에, 조정 및 인라인 진공 레귤레이터 진공 압력을 설정합니다. 진공 압력은 유도 및 정렬의 정도를 결정 콜라겐 유량을 제어 할 수있는 힘을 제공한다.
- 랜덤 또는 정렬되지 않은 매트릭스를 들어 10 mmHg의 이하의 진공 압력으로 다양한 채널 (3mm x 세로 200 ㎛의 높이)를 사용한다.
- 정렬 행렬를 들어, 60mm 수은 이상의 진공 압력 좁은 채널 (1mm x 세로 200 μm의 높이)를 사용합니다.
- 얼음에서 장착 채널을 제거하고 층류 시간의 청소, 소독 표면에 배치짐 우드.
- (그림 2B) 포트 A에 중화 콜라겐 150 μl를 - 빠르게 작업하고 (120)를 넣습니다.
- 포트 C (도 2b)를 통해 진공 라인에 연결된 25 ㎖ 피펫을 배치하여 채널을 통해 콜라겐을 그린다. 하나의 균일 한 모션을 통해 콜라겐을 그립니다. 중요 : 랜덤 또는 정렬되지 않은 행렬를 들어, 채널을 통해 서서히 콜라겐을 그립니다 (약 0.5-1 초당 mm), 그것은 끝에 도달하면 중지합니다. 정렬 행렬를 들어, 더 빠르게에서 콜라겐을 그릴하지만 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오.
- 조심스럽게 P200의 pipetman 또는 흡입기와 포트 지역에서 초과 콜라겐을 제거합니다.
- A와 C. 모든 포트가 지금 적용해야 두 포트를 통해 멸균 PDMS 패치를 놓습니다.
- 이 후 - 3 분, 센터 PDMS 패치 (포트 B)를 제거하고 2 추가 - 중앙 포트 - (10,000 세포 5) 세포의 3 μl를. 15 분 - 부분적으로 또 다른 10 실온에서 (불투명 설정) 중합 할 수 있습니다.
- 10 후- 15 분, 추가로 15 37 ˚C로 전송 - 중합을 완료하는 데 30 분. PDMS 커버를 제거하고 필요에 따라 완전히 채널 및 문화 세포를 충당하기 위해 미디어를 추가 할 수 있습니다. 세포는 이전 미디어 mL를 제거하고, 새로운 미디어 ㎖로 교체하여 공급 될 수있다.
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Representative Results
3D 분석법 콜라겐 겔 강성 동일한 범위 내에서 실시 할 수 있지만, 겔 강도를 변화하는 세포들은 세포 미세 환경에서의 기계적 변화에 응답하는 방법을 결정하는데 사용될 수있다. 뻣 뻣 한 콜라겐 하이드로 겔이 포함 된 세포가 로컬 주변의 콜라겐을 수축에없는 젤로 정의된다. 상이한 세포 유형의 고유 수축 독특하고, 따라서 그것은 호환 단단한로 감지 될 콜라겐 농도를 설정하는 간단한 수축 곡선 시작할 최상이다.
셀 번호를 일정하게 유지하고 콜라겐 젤의 농도를 증가시킴으로써 시작합니다. 이전 10,20 바와 같이 겔 강도는 농도가 기하 급수적으로 확장 할 것이다. 수축성 분석의 대표적인 예는도 1에 도시된다. 여기서, 50,000 4T1 세포에 포함 된 eithe라 2 ㎎ / ㎖ 또는 5 일 동안 3.5 ㎎ / ㎖ 콜라겐 젤. 4T1 세포주 높은 수축 전이성 암 라인이지만, 단지 약 10 %의 고밀도 겔을 수축 할 수있다 (도 1a, c). 수축이 낮은 수준은 딱딱한 젤 분류 일반적입니다. 필적 저밀도 겔 (2 ㎎ / ㎖,도 1b는, c)는 동일한 기간 동안 (N = 4)를 57 % 축소된다. 콜라겐 농도를 일정하게 유지하고 하단에 부착 방치에 의해 구속되는 겔 (강성)을 비교하는 콜라겐 리간드의 양을 증가 시키면 강성을 변화시키는 것이 제 수단 세포 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있다는 것이 중요하다 접시 또는이 셀 매체에 자유롭게 떠 출시 되었기 때문에 수축 (준수). 이것은 셀룰러 신호의 변화가 증가 된 콜라겐 리간드 또는 매트릭스의 강성에 기인하는지 여부를 결정하는 것이 제어부로서 기능 할 수있다.
3 차원 매트릭스에서 세포를 매립 숙달이 달성되면, 분석은 콜라겐 섬유의 조직 및 배향을 변경하도록 변경 될 수있다. 이는 PDMS 미세 유체 채널 (도 2)의 사용에 의해 달성된다. 이 원고의 목적을 위해, 두 개의 유사한 입체는 3 개구 또는 포트 (도 2b)과, 좁고 넓은 채널을 사용 하였다. 정렬 된 매트릭스와 비교하여 임의의 세포 반응을 결정하기 위해 통상적 인 실험에서, 미 중합 콜라겐 세포가 콜라겐의 비율에 의해 조절되는 포트 B. 콜라겐 배향의 정도를 추가되면서 포트 C에 포트 A에서 미세 유체 채널을 통해 그려진 높은 콜라겐 유량이 더 정렬을 얻을 수 있도록 흐른다. 높은 결합 좁은 채널의 사용저 진공 압력과 함께 사용 넓은 채널이 임의의 행렬을 생성하는 동안, 진공 압력, 콜라겐 네트워크의 정렬을 향상시킨다. 대표 화상 (도 2C, d)에 나타낸 바와 같이 섬유의 네트워크의 구성은 제 고조파 발생에 의해 시각화 될 수있다. 이러한 이미지에서, 콜라겐 섬유 (화살촉 의해 표시 자주색 모조 착색)은 좁은 채널 (도 2D) 콜라겐 흐름의 축과 정렬보다 일관. 다양한 채널의 콜라겐 섬유는 다양한 방향을 가지며, 더욱 임의의 분포 (도 2C)을 갖는다.
폭이 좁은 채널 사이의 차이는 육안으로 식별 할 수 있지만 또한 섬유 분석을 위해 특별히 개발 된 소프트웨어를 통해 분석 할 수있다. CT-FIRE, 오픈 소스 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어는 다음 사전 처리를위한 curvelet 기반 알고리즘을 사용섬유 추출 알고리즘 섬유 각도, 두께, 길이, 직선 (21)을 계량한다. 각 조건의 경우, 500 개 이상의 이미지가 임의로 채널 내의 다른 위치에서 샘플링하고, 이상 125,000 섬유는 CT-FIRE 추출 및 분석 하였다. 좁은 채널 (도 2F)에 대해 생성 된 연속 섬유 각 히스토그램은 흐름의 방향에 평행하게 배향 된 섬유의 명확한 농축을 나타낸다. 대조적으로, 채널 폭보다 랜덤 행렬과 일치보다 동등한 광 각도 분포 (도 2E)을 갖는다.
중요한 것은, 미세 유동 장치의 사용은, 조직 및 콜라겐 섬유의 배향을 제어하기위한 기술로서, 변경된 매트릭스 조건에 대한 다양한 세포 반응의 평가를 허용한다. 예를 들어,은, 주석 등. 인간의 유방 fibrobasts의 생존 능력은 콜라겐 섬유에 의존하는 것으로 판단.(15) 또한, 본 연구실에서의 최근 연구는 유방암 세포 랜덤 콜라겐 매트릭스에 비해 정렬 콜라겐 섬유에 대한 지속적 마이그레이션 것을 설명한다. (3)이 결과는 더 유방 생물학 및 유방암의 컨텍스트 내 미세 환경의 역할을 정의하는 것을 돕는다. 정확하게 다양한 질환 상태의 컨텍스트 내에서 중요한 세포 반응의 계속 조사 있도록 3 차원 미세 셀을 제어하는 기능, 나아가.
3D 콜라겐 젤 ECM 강성에 세포 수축성과 세포 응답을 측정 그림 1.. 4T1 세포 모두에서 도금했다 (a) 3.5 ㎎ / ㎖ 및 (b) 2 ㎎ / ㎖의 콜라겐 겔을 5 일간 성장시켰다. 시간이 지남에, 콜라겐 겔 (회색 영역점선 내) 계약을 체결하고 직경을 측정하고 정량화한다 (C, 학생의 t-test를, 오차 막대 +/- SD). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PDMS 마이크로 채널을 사용하여도 2 생성 무작위 정렬 콜라겐 매트릭스. 여섯 인치 실리콘 웨이퍼 (a)는 폭이 좁은 두 PDMS 마이크로 채널 (b)을위한 주형으로 사용 하였다. 동일한 콜라겐 농도는 채널의 두 가지 유형으로 인출하고, 개개의 섬유 하였다 (화살촉, C, D)에서 폭이 좁은 미세 채널 (화살표)의 흐름 방향과 정렬 (d). 와이드 마이크로는 더 랜덤 행렬을 얻었다. 섬유 Ang1을이미지의 하단에 대해 ES는 카운트 (e) 및 (f)에 도시 하였다. 스케일 바 = 26 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
3D 콜라겐 젤은 세포가 해석하는 방법을 이해하고 지역의 미세 환경에 대응하는 우리의 도구 상자에 추가되었다. 이 원고는 3D 콜라겐 매트릭스 내에서 세포를 포함하기위한 아주 기본적인 프로토콜을 제공하고, 재현성 랜덤 또는 정렬 된 콜라겐 섬유와 매트릭스를 생성 할 수 있습니다. 두 프로토콜은 다른 콜라겐 이성체, 가교제, 기타 매트릭스 단백질 잠재적 중합시에 첨가 할 수 있으므로 적응력 플랫폼 작동한다. 또한, 유전자 발현 및 단백질 생산을위한 다른 시간대 및 엔드 포인트를 평가하기 위해 플랫폼을 쉽게 수정할 수있다. 이미지 평가, 단백질 및 RNA 수준, 판독 대사 프로파일은 모든 3D 기법 매우 호환 가능하다.
모든 기술에 중요하기 때문에, 이는 젤 분석의 품질을 평가하는 것이 중요하다. 좋은 품질의 콜라겐 젤의 기호는 수동 조작을 처리 할 수있는 것입니다. 예를 들어, 1 ml의 [1 ㎎ / ㎖여섯 웰 플레이트가 쉽게 집게로 집어 조작해야합니다으로] 콜라겐 겔을 쏟아 냈다. 겔 눈물 단편 경우, 겔의 품질이 최적이며, 단계 콜라겐 중합을 향상시키기 위해 수행 될 필요가있다. 온도와 pH는 양호한 섬유 형성 및 겔화에 요구되는 가장 중요한 매개 변수이다. 겔화가 발생하는 모든 구성 요소가 준비 될 때까지 얼음에 보관되어 있는지 확인함으로써 문제 해결 과정을 시작합니다. 중화 버퍼와 콜라겐 원액이 철저하게 혼합되어 있는지 확인하는 것도 매우 중요하다. 다음에, 중화 완충액의 pH가 7.4 인 것을 확인. HEPES, 그것은 조직 배양과 매우 호환 때문에 PBS 추천 버퍼링 넓은 완충 영역을 갖고, 스톡 용액은 오랫동안 4 ℃에서 매우 안정되는 경향이있다. 또한 생리적 상태 (15)에 더 유사하다 이상, 더욱 만곡 섬유를 제조하는 추가적인 장점을 갖는다. NaOH를 다른 commo입니다할수 있답니다 용액을 중화하지만, 더 밀접하게 역가 할 필요가 사용됩니다. 또한 짧고 두꺼운 섬유 (15)를 제조하는 효과가 나타난다. 그럼에도 불구하고, 중화 콜라겐의 pH는 7.4의 pH에 있어야한다. 모든 조건을 만족하고, 겔의 완전성이 여전히 만족스럽지되는 경우, 문제는 스톡 콜라겐 용액있다. 재고 콜라겐 용액을 4 ℃에서 6 개월 나열된 수명이 있지만, 우리는 3 차원 겔에 사용되는 경우 항 상업적인 소스보다 일반적으로 더 짧은 것을 알 수있다. 새 많이에서 이전 병, 및 순서를 폐기하십시오. 제조 업체에서 콜라겐의 품질이 많이로부터 많은 크게 변화하는 것은 드문 일이 아니다.
품질 콜라겐 겔을 식별하는 것 외에도, 상기 PDMS 마이크로 채널 내에서 잘 정렬의 생성에 중요한 단계를 식별하는 데 중요하다. 이 기술의 기본 원리는 그 콜의 속도마이크로 채널을 통해 흐름 카발라이어서 섬유 배향을 유도한다. 따라서, 섬유 배향의 정도를 제어하는 가장 중요한 공정은 진공 압력의 적절한 조절이다. 마이크로 랜덤 콜라겐 정렬에 진공 압력이 낮아야하고, 콜라겐은 채널 아래로 느리게 유동한다. 콜라겐이 너무 빨리 흐르는 경우, 섬유 정렬을 시작합니다. 더 넓은 채널이 제안 쉬워집니다. 반대로, 좋은 콜라겐 정렬 높은 진공 압력이 사용되어야하며, 콜라겐 용액을 통해보다 빨리 인출되어야한다. 정렬 된 매트릭스의 생성에 초 임계 공정 온도이다. 이 모든 구성 요소와 솔루션을 사용하기 전에 얼음에 냉각되어 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 채널 사용 전에 냉각되지 않은 경우, 채널에서의 콜라겐은 너무 빨리 중합되며, 얇고 작은 섬유를 초래한다. 중화 콜라겐이 4 ℃로 냉각되고 아닌 경우 얼음의 enhancED 핵 흐름으로 정렬하기가 더 어렵다 큰 섬유 직경을 야기 할 것이다. 마이크로 자체를 진정하는 것도 중요합니다. 사전 냉각없이, 콜라겐의 작은 볼륨이 빈약 한 결과를 산출 매우 빠르게 따뜻하게합니다.
콜라겐 마이크로은 매우 유용한 기술이지만, 특정 제한이 있습니다. 하나, 유동 유도 마이크로 채널의 정렬은 결코 완벽하고 스트레인 유발 배향 기술과 동일하지 않을 것이다. 항상 유동 방향에 수직으로 배향 된 섬유의 일부 일 수 있지만, 사용의 재현성 적응성 및 용이성 채널 내에 정렬 작은 변동을 능가 할 것이다. 보다 중요한 세포는 효율적으로 배향의 작은 변화를 감지하고, 이러한 채널 3,15 개 영구 이주 반응하는 것으로 나타났다. 그 수는 증가하고 마이그레이션을 시작으로하는 세포는 또한 상기 채널의 정렬을 향상시킬 것이다. 큰 정렬 난 경우필요한 s는 상기 PDMS 마이크로 채널 용이 좁게 치수로 변경 될 수있다 또는 정렬을 향상시키는 작은 긴축을 가지고. 모두 효과적이지만, 다른 관련된 트레이드 오프 (16)를 갖도록 도시되어있다. 마이크로 기술의 또 다른 제한은 PDMS 채널이 약물이나 형광 염료에 약간의 투과성을 가지고 있다는 것입니다. 이것은, 이들 화합물은 놀랍게도 느린 포트로부터 채널을 확산해야하고, 치료를 세척하는 데 어려움을 야기 할 수 있다는 것을 의미한다.
이 마이크로 플랫폼 특정 제약이 있지만, 기존 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공 않는다. 이 부피가 큰 상품 3,13 또는 정렬을 생성하는 세포의 작은 인구를 필요로하지 않기 때문에 그것은 더 실험적으로 액세스 할 수 있습니다. 또한 autofluorescent 경향 인위적 콜라겐 네트워크를 가교 할 수 외인성 자성 비드 (13, 14)를 필요로하지 않는다. 콜라겐은 마이크로단순히 비용 효율적이고 경제적. 현재의 이점에 더하여, 또한 미래의 애플리케이션에서 활용 될 수있는 다수의 이점을 갖는다. 일례로, 콜라겐 마이크로 설계 될 수 있거나 또는 거의 모든 구성 또는 실험 변형. 고급 설계 채널 간략화 종양 또는 기관 (22)의 구조를 모방하는 콜라겐 중공 튜브 또는 3D 구조를 생성 할 수있다. 또한, PDMS 채널 이외의 재료로 만들어 질 수있다. 이로 인해 매립 콜라겐 매트릭스 네트워크 또는 서로 다른 기계적 성질을 전달할 수있다. 마지막으로,이 분석에 사용되는 시약의 소량 또한 작은 높은 처리량 스크린의이 매력적이고 경제적 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어
Acknowledgments
저자는이 작품을 자금에 대한 허가 번호 UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 및 T32-GM008692-18을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 CT-화재 분석의 개발 및 지원 궤적의 제레미 Bredfelt 및 Yuming 리우를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
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