Summary
Kolajen ECM temel bir bileşenidir ve göç farklılaşma ve çoğalması kadar çeşitli hücresel süreçler için gerekli ipuçları sağlar. 3D kolajen hidrojellerin içinde hücreleri gömmek için bir protokol ve PDMS mikrokanallar kullanılarak randomize veya hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için daha gelişmiş bir teknik burada sağlanmıştır.
Protocol
1. Nötralizasyon, seyreltme ve 3D Soruşturma ve Hücresel Daralma Tahliller için Kollajen Çözümleri Polimerizasyonu
- steril doku kültürü kaputu buz üzerinde, kolajen (1: 1) ile nötralize 2x PBS içinde steril, buz gibi soğuk 100 mM HEPES, 15 ml konik bir tüp içinde pH 7.4 ile. çözüm homojen ve karıştırma girdaplar artık görünür olana kadar plastik pipet ile iyice karıştırın. karıştırma işlemi sırasında hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun. Buz üzerinde kısaca saklayın.
- Hücre ortamı ile uygun bir konsantrasyona (vb RPMI, DMEM, gibi), nötrleştirilmiş kollajen seyreltilir.
- N = (D V *), V / (S / 2), N gerekli nötralize kollajen miktarı burada, İstenen kollajen konsantrasyonu olduğu denklem kullanarak, arzu edilen kollajen konsantrasyonunu yapmak için gerekli olan nötralize kolajen miktarını hesaplamak için istenilen kollajen konsantrasyonu son hacim ve S to hisse senedi kollajen konsantrasyonu başlangıç.
- Hücre ve Hücre ortamı çözeltisi eklenerek hacim nötralize kolajen miktarını getirin. İyice karıştırın ve döküm için hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
- Örnek: (6 plaka veya 50 mm cam alt çanak jel döküm için tipik hacim), 2 mg / ml 1 ml jel hacminde jel, ilk istenilen son hacme göre, istenen konsantrasyonda (2 mg / ml) çarpma (1 mi). Bu numarayı (2 mg) alın ve şişe üzerinde listelenen stok konsantrasyonu (9.49 mg / ml) yarı yarıya bölün. Bu durumda, nötralize kollajen 0.42 ml ortam / hücre karışımı 0.58 ml ile sulandırılır.
- Pipetleyin olmayan bir doku kültürü içine ya buz gibi soğuk kollajen / hücre / medya karışım 6-plaka veya 50 mm cam alt çanak tedavi. eşit çözüm yaymak için pipet ucu kullanın.
NOT: collag dışındaki hücre eki veya büyümesini en aza indirmek için tedavi plaka olmayan bir doku kültürü kullanmak önemlidirjel En. - 15 dakika - yaklaşık 10, oda sıcaklığında polimerize olmaya bırakın. jeller polimerizasyon üzerine opak dönmelidir.
- polimerizasyonu bitirmek için 60 dakika - opak döndü sonra, ek 45 37 ˚C için plaka veya çanağı hareket.
- 45 Sonra - kuyu veya yemeğin çevresinde P200 pipet ucu çalıştırarak iyi yanlarından jeller medya 3 ml ve bırakın - 60 dakika, 2 ekleyin. Girdap çanak yavaşça jel serbest bırakmak için. kolajen jel ortam yüzen olmalıdır.
2. Western Blot, Celi Morfogenez ve Jel Gontractility Deneyi
- 10 gün deneyi - 7 için hücreleri ile seribaşı, 1.6 - sertliği ECM ile ilgili olarak protein düzeylerinin, morfolojisi veya hücresel kontraktilite değerlendirmek için, 1.1 göre kollajen jeller dökerek başlar. büyüme hızı ve confluency bağlı ampirik her hücre hattı ekim oranını belirlemek. 100.000 hücre / jel - 10 günlük bir deney için, tohum yoğunluğu 20,000 arasında olabilir.
- ÖlçmekHücre kasılması, bir cetvel ya da bir kamera her 24 saat kullanarak veya uygun bir zaman aralığında jel çapını ölçün.
Not: Buna ek olarak, mikroskop toplanan karşılık gelen görüntüler gibi acininin benzeri yapılar, epitelyal tübüller, cep çıkıntılar ve lameliapodia olarak, jel tohumlandı hücre çizgisinin morfolojik özellikleri karakteristikleri için incelenebilir. - Protein düzeylerini değerlendirmek Wozniak ve ark., 17 ve Gallagher et al. 18 de tarif edildiği gibi ilgi duyulan proteinlerin Western blot analizi için RIPA jeller tampon lize edildi ve prosesi ile ilgilidir.
- ÖNEMLİ: hücre hatları arasında kontraktilite karşılaştırmalarda, Lui tarafından belirtildiği gibi jeller elde edilebilir toplam DNA, için kasılma normalleştirmek, vd 19 veya Batı tarafından değişmeyen, temizlik proteini (histon, GAPDH, vb). blot analizi, Wozniak ve ark., 17 ve Gallagher et al de tarif edildiği gibi. 18. jel içinde sayma hücreler hemasitometre kullanarak ise, hücreleri konsantre olacak müteahhitlik jel gibi toplam jel alanına hücre sayısını normalleştirmek için emin olun.
- ortam 1 ml çıkarılması ve taze ortam 1 ml ile değiştirilmesi yoluyla 4 gün - Besleme jeller her 3. Ölçüm kontraktilitesinde ani bir artış neden olur taze medya / serum ilave olarak alındıktan sonra jeller beslemek için emin olun.
Kollajen Fiber Uyum PDMS Mikrokanallarda 3. Nesil
Not: hizalanmış kollajen matrisleri oluşturmak için, PDMS mikro kanallarda (Şekil 2A) için bir kalıp yumuşak litografi 15 aracılığıyla yapılan bir SU-8 silikon ustası gerektirir.
- PDMS kanalları yapmak için, bir zanaat sopayla tek kullanımlık fincan iyice PDMS karıştırın. 6 inç silikon ana için, sertleştirme maddesi 2 g elastomer tabanı 20 g karıştırılır.
- Gazlardan bir vakum basıncı altında bir vakum odasındaki tek fincan yerleştirerek PDMS karışımı550 mm Hg. Gazlardan 1 - 1.5 saat.
- PDMS de-gazla birlikte, dökme için silikon ustası hazırlamak. Silikon usta tarafından izlenen bir ocak üzerine asetat film temiz bir levha koyarak hazırlayın. Mikrokanal kalıp yukarı baktığından emin olun.
NOT: PDMS döküm ve kür sırasında, silikon ana asetat film iki levha arasına sıkışmış olacak. - 1 Sonra - 1.5 saat, vakum odasından de-gaz verilerek PDMS kaldırmak ve yavaş yavaş silikon usta üzerine dökün.
ÖNEMLİ: hava kabarcıkları kaçının. master merkezinde dökün ve yerçekimi eşit bir şekilde yaymak için izin devam edin.
NOT: PDMS açılan ana kenarına kadar tüm yol genişletmek gerek yoktur. - PDMS ustanın üzerine döküldükten sonra, silikon master ve PDMS üstüne asetat film bir ikinci tabaka uygulayın. Dikkatle, hava kabarcıklarını önlemek için aşağı PDMS / silikon ustanın üstüne ikinci şeffaflık sayfasını döndürün. Acele etme. PDMS artık eşit o yayılmalıdırver usta.
- Yavaşça 1/8 "akrilik levha takip şeffaflık üstüne bir lastik levha, yerleştirin.
- akrilik levha üstünde üç 10 lb ağırlıkları ekleyin. Başlangıçta, ağırlıklar "yüzer" olacaktır. Onları daha fazla devam etmeden yerleşmek ve stabilize etmek için izin verin.
- 4 saat 70 ˚C ve tedavi PDMS ocak gözü sıcaklığı ayarlayın. rahatsız önce 1 ek hr az soğumasını bekleyin.
- Dikkatle gofret asetat film üst tabakayı soyun ve bir forseps ile kanalları kaldırmak.
- hazır olana kadar tozsuz çanak saklayın kullanın.
Kullanım 4. Hazırlayıcı PDMS mikro kanallar
- baş aşağı yeni, temiz asetat film üzerine yerleştirin kanalları. Keskin bir forseps ile dairesel hareketler kullanarak temizleyin tüm bağlantı noktaları (Şekil 2b). PDMS herhangi parçaları kaldırın.
- Bir çakmak bez olarak bant ambalaj bir parça kullanarak temiz kanalları. tezgah yüzeyinin (yukarı yapışkan tarafı) bant yapıştırıp, sonra kanal o setn üst. iyi temas sağlamak için forseps yuvarlak ucuyla kanallarda bastırın. Çıkarın ve görünür artıklar kadar her iki tarafta da tekrarlayın.
- Aktarım temizlenmiş,% 70 EtOH ile 50 ml'lik bir konik içine PDMS kanalları prepped. 30 saniye boyunca en yüksek hızda vorteksleyin. EtOH atın ve taze% 70 EtOH ile değiştirin. kadar hazır% 70 EtOH mağaza kullanmak için.
- doku kültürü kaputu ve aseptik teknikler kullanılarak yılında temiz ve steril cam kapak veya cam alt yemekler PDMS kanalları aktarın. EtOH çekinceye kadar kanal tarafı yukarı ve UV tedavi koyun.
- kanallar coverglass aşağı doğru bakacak böylece bir kez kuru, PDMS çevirin. iyi bir sızdırmazlık yapmak için camın üzerine PDMS kanalı aşağı doğru bastırın. Kapsayacak şekilde steril PDMS bir yama ekleme / merkez noktasını kapatın (port B Şekil 2b). Devam etmeden önce iyice kurumasını bekleyin.
- Ön kaplama, steril su içinde 10 ug / ml kolajen kanalın içinde. kaplamak için, bir chann üstüne bir 100 ul damlacık yerEl ve vakum ile doğru çizin. 37 ° C'de 1 saat sonra, bir buzdolabı kollajen kaplama solüsyonu ile doldurulmuş aktarım kanalları. 30 dakika - yaklaşık 15 soğutun.
- Aspiratör veya pipet ile kollajen kaplama çözümü çıkartın ve kollajen hazırlık başlar.
Mikrokanallarda Kullanım 5. Kollajen Hazırlık
- 2x PBS, pH 7.4 içinde, buzla soğutulmuş 100 mM HEPES: Buz üzerinde, kolajen (1: 1) etkisiz hale getirir. homojen hale gelinceye kadar iyice karıştırın (Daha fazla bilgi için, bölüm 1.1).
- hücre medya ile uygun konsantrasyonlarda için nötralize kollajen seyreltin (Daha fazla bilgi için, bölüm 1.2). Buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin.
- Aynı zamanda, soğutma, buz üzerinde kanal monte edilebilir.
NOT: amaç altında 4 ˚C veya kanal işlemi için tüm bileşenleri sahip olmaktır. Kollajen çekirdeklenme sıcaklığı ve süresi polimerizasyon işlemi için anahtar parametreler ve gerekirse daha fazla optimizasyon için başlangıç noktası olabilir. - CounBu zamanda uygun tohumlama yoğunluğunda bir hemasitometre ve tekrar süspansiyon T hücreleri. 3.000.000 hücre / ml - hesaplamalar kolaylığı için, 1 ila yeniden süspanse edin. (Daha fazla bilgi için, aynı zamanda bölüm 2.1).
- Hücreler sayılmış ve 15 dk geçtikten sonra, dökme kolajen geçin.
6. Bağlantısızlar ve Random Kollajen mikro kanallar dökme
- kanallardan kollajen çizmeden önce, ayarlamak ve bir satır içi vakum regülatörü ile vakum basıncını ayarlayın. Vakum basıncı neden ve hizalama derecesini belirler kolajen akış hızını kontrol etmek için bir kuvvet sağlar.
- rastgele veya hizalanmamış matrisler için, 10 mm Hg veya daha düşük bir vakum basıncı ile geniş bir kanal (3 mm genişlik x 200 mm boyunda) kullanın.
- hizalanmış matrisler için, 60 mm Hg ya da daha yüksek bir vakum basıncı ile dar bir kanal (1 mm genişlik x 200 mm boyunda) kullanın.
- buz monte kanalı çıkarın ve laminer akış h temiz, sterilize bir yüzeye yerleştirinood.
- (Şekil 2b) port A içine nötralize kollajen 150 ul - hızlı çalışır ve 120 yükleyin.
- C çıkışı (Şekil 2b) üzerindeki vakum hattına bağlı bir 25 ml'lik pipet yerleştirerek kanal boyunca kollajen çizin. Tek, tek biçimli bir hareketle aracılığıyla kollajen çizin. ÖNEMLİ: rastgele veya hizalanmamış matrisler için, kanal genelinde yavaşça kolajen çizin (yaklaşık 0,5-1 saniyede mm) ve sonuna ulaştığında durur. hizalanmış matrisler için, daha hızlı karşısında kollajen çizmek, ama hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterin.
- Dikkatle P200 Pipetman veya aspiratör ile liman bölgesinden aşırı kollajen çıkarın.
- A ve C. Tüm bağlantı noktaları şimdi ele alınmalıdır hem bağlantı noktaları üzerinden steril PDMS yamaları yerleştirin.
- 2 Sonra - 3 dakika, merkez PDMS yama (port B) çıkarın ve 2 eklemek - merkez portuna - (10 bin hücre 5) hücrelerin 3 ul. 15 dakika - kısmen bir 10 Oda sıcaklığında (opak dönüş) polimerize olmaya bırakın.
- 10 sonrası- 15 dakika, ek 15 37 ˚C transfer - polimerizasyon bitirmek için 30 dakika. PDMS kapaklarını çıkarın ve gerektiği gibi tamamen kanal ve kültür hücreleri kapsayacak şekilde medyayı ekleyin. Hücreler, eski medya ml çıkarılması ve yeni medya ml değiştirerek beslenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D deneyler kollajen jel ile aynı sertlik içinde yapılabilir ise, jel sertliği farklı hücreler, hücresel mikro-mekanik değişikliklere cevap verecek belirlemek için kullanılabilir. Bir sert kollajen hidrojel gömülü hücreler lokal çevredeki kolajeni sözleşme edemiyoruz bir jel olarak tanımlanır. Farklı hücre tipleri iç kontraktilite benzersizdir ve bu nedenle uyumlu bir şekilde ve sert algılanan olan kollajen konsantrasyonunu belirlemek için basit bir kontraktilite eğrisi ile başlamak en iyisidir.
hücre sayıları sabit tutarak ve kollajen jel konsantrasyonunun arttırılması başlayın. Daha önce 10,20 gösterildiği gibi jel sertlik, konsantrasyon katlanarak dönüşebilecek. Bir kontraktilite tahlilinde temsili bir örneği, Şekil 1 'de gösterilmektedir. Burada, 50.000 4T1 hücreleri eithe gömülürRA 2 mg / ml ya da 5 gün boyunca 3.5 mg / ml kolajen jeli. 4T1 hücre çizgisi yüksek kasılma, metastatik kanser hattı, ama sadece yaklaşık% 10 oranında yüksek yoğunluklu jel sözleşme yapabiliyor (Şekil 1a, c). daralma Bu düşük seviye sert bir jel sınıflandırma için tipiktir. Karşılaştırılabilir düşük yoğunluklu jelleri (2 mg / ml, Şekil 1b, c) Aynı zaman diliminde (n = 4)% 57 sözleşmeli. Kollajen konsantrasyonu sabit tutun ve dibine bağlı bırakılmak tarafından bastırılmış olan jeller (sert) karşılaştırmak için kollajen ligand miktarını artırarak, sertliği değişir bu nedenle ikinci bir aracı hücre içi sinyal yollar etkileyebilir yani dikkat etmek önemlidir çanak ya da hücre ortamında serbestçe yüzer serbest bırakıldı çünkü kasılma (uyumlu). Bu hücresel sinyal değişiklikler artmış kollajen ligand veya matrisin sertliği sonucu olup olmadığını belirlemek için iyi bir kontrol olarak hizmet edebilir.
3D matrisler içinde hücreleri gömme ustalık elde edilir, deneyler, kolajen liflerinin organizasyonu ve yönünü değiştirmek için modifiye edilebilir. Bu PDMS mikroakışkan kanal (Şekil 2) kullanılması ile elde edilir. Bu yazının amacı için, iki benzer biçimler, 3 açıklıklar veya limanlarda (Şekil 2b) ile, dar ve geniş kanalı kullanılmıştır. hizalanmış matrisler göre rasgele hücresel yanıtı belirlemek için tipik bir deneyde, polimerleşmemiş kollajen hücreleri kolajen oranı ile modüle edilir noktası B'ye kolajen hizalama derecesini eklenen port C noktası A mikroakışkan kanal çekilir yüksek kolajen akış oranları daha iyi uyum verim böyle akar. yüksek ile birleştiğinde dar kanallar kullanımıdüşük vakum basıncı ile bağlantılı olarak kullanılan daha geniş bir kanal rastgele matrisler üretir ise vakum basınçları, kolajen ağının hizalama artırır. Temsili görüntüleri (Şekil 2c, d) 'de gösterildiği gibi fibriler ağının organizasyon, ikinci harmonik nesil tarafından görülebilir. Bu görüntülerde, kolajen lifleri (ok uçları ile gösterilir ve mor yalancı) dar kanallar (Şekil 2d) kolajen akışının ekseni ile daha tutarlı hizalayın. Geniş kanallar kollajen lifleri yönlendirmeler çeşitliliğine sahip ve daha rastgele dağılımı (Şekil 2c) bulunur.
Geniş ve dar kanallar arasındaki fark insan gözüne ayırt değil, aynı zamanda fiber analizi için özel olarak geliştirilen bir yazılım ile analiz edilebilir. CT-YANGIN, bir açık kaynak ve serbestçe kullanılabilir yazılım, ardından ön işleme için bir curvelet tabanlı algoritma kullanırBir lif çıkarma algoritması lif açısı, kalınlığı, uzunluğu ve doğruluk 21 ölçmek için. her bir durum için, 500'den fazla resim rastgele kanalları içinde farklı yerlerden numuneler alınmış ve daha fazla 125.000 lifler CT-YANGIN tarafından çıkarılan ve analiz edildi. Dar kanal (Şekil 2f) için oluşturulan bir sonraki lif açısı histogram akış yönüne paralel yönlendirilmiş elyafların açık bir zenginleştirme gösterir. Bunun aksine, çok kanal daha rastgele bir matris ile uyumlu bir daha fazla denk elyaf açısı dağılımını (Şekil 2e) sahiptir.
Önemli bir şekilde, mikro-akışkan cihazların kullanımı, organizasyon ve kolajen liflerin yönünü kontrol etmek için bir teknik olarak, değiştirilmiş matris koşulları, çeşitli hücresel yanıtların değerlendirmesi için olanak sağlar. Örneğin, Sung ve diğ. insan meme fibrobasts yaşayabilirliği kollajen lif bağlı olduğu tespit edilmiştir.15 Ayrıca, bizim laboratuvarda son çalışma meme kanseri hücreleri rastgele kollajen matrislerinin göre hizalanmış kollajen lifleri üzerinde daha ısrarla göç olduğunu göstermektedir. 3. Bu sonuçlar daha iyi meme biyoloji ve meme kanseri kapsamında mikroçevresinin rolünü tanımlamak için yardımcı olur. tam birçok farklı hastalık durumlarının kapsamında önemli hücresel yanıtların devam soruşturma için izin verecektir 3D hücresel mikro kontrol edebilme, ileriye doğru hareket.
3D Kollajen Jeller ECM Rijitliği Hücre kontraktilite ve Hücresel Yanıtları Ölçüm Şekil 1.. 4T1 hücreleri hem ekildi (A) 3,5 mg / ml (B) 2 mg / ml kolajen jel ve 5 gün süreyle büyümeye bırakıldı. Zamanla, kollajen jel (Gri alannoktalı çizgi içinde) daralacak ve çap ölçülür ve ölçülür (c, Student t-testi, hata çubukları +/- SD). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PDMS Mikrokanallardaki kullanarak Şekil 2. Yaratma Rastgele ve Bağlantısızlar Kollajen Matrisler. Altı inç silikon gofret (a) geniş ve dar hem PDMS mikro kanallarda (b) için bir şablon olarak kullanılmıştır. Aynı kollajen konsantrasyonları kanallarının her iki tip çekilir edildi ve tek tek liflerin (ok başları, C, D), dar Mikrokanallarda (oklar) akış yönünde hizaya (D). Geniş mikrokanalların daha rasgele matrisler vermiştir. fiber anglResmin alt göre ES sayılır ve (e) ve (f) 'de gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 26 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D kollajen jeller hücreleri yorumlamak anlamak ve kendi yerel mikroçevresinin yanıt vermek alet değerli bir katkı vardır. Bu el yazması bir 3D kollajen matriks içinde hücreleri gömmek için çok temel bir protokol sağlamıştır ve tekrarlanabilir rastgele veya hizalanmış kollajen lifleri ile matrisler oluşturmak için. Her iki protokol, farklı kollagen izoformlar, çapraz bağlayıcılar, ve diğer matris proteinleri, potansiyel olarak polimerizasyon sırasında ilave edilebilir şekilde adapte platformlar çalışır. Ayrıca, gen ifadesi ve protein üretimi için farklı süreler ve uç noktaları değerlendirmek için platformlar değiştirmek için kolaydır. Görüntüleme, değerlendirme proteini ve RNA seviyeleri, ve okuma metabolik profil bu 3D teknikleri ile çok uyumludur.
Tüm teknikler ile önemli olduğu için, jel ve deneyin kalitesini değerlendirmek için önemlidir. kaliteli kollajen jel bir işareti manuel manipülasyon işleyebilir biridir. Örneğin, bir 1 mi [1 mg / mlAltı kuyu plaka kolayca forseps ile aldı ve manipüle edilmelidir içine] kollajen jel döktü. Jel yırtılma veya fragmanları ise, jel kalitesi optimal ve adımlar kollajen polimerizasyonu artırmak için alınması gerekmektedir. Sıcaklık ve pH, iyi lif oluşumu ve katılaşma işlemi için gerekli olan en önemli parametredir. jelleşme gerçekleşmesi için tüm bileşenleri hazır olana kadar buz üzerinde tutulur emin yaparak giderme işlemine başlayın. Nötralizasyon tamponu ve kolajen stok solüsyonu iyice karıştırıldı sağlandığından emin olmak için de çok önemlidir. Daha sonra, nötrleştirme tamponu pH, pH 7.4'te olduğundan emin olun. HEPES, bu doku kültürü çok uyumlu olduğu için PBS önerilir tamponlu geniş bir tampon alanı vardır ve hazır çözeltiler uzun süreler için 4 ° C'de çok kararlı olma eğilimindedir. Aynı zamanda fizyolojik durumu 15 daha benzer daha uzun, daha kavisli lifler üretmeye yararı vardır. NaOH başka commo olduğununly edici çözelti, ama daha çok titre edilmesi gerekmektedir kullanılır. Aynı zamanda kısa, kalın lifler 15 üretme etkiye sahip olduğu görülmektedir. Ne olursa olsun, nötralize kollajen pH 7.4 arasında bir pH değerinde olmalıdır. Bütün bu koşullar yerine ve jellerin bütünlüğü hala tatmin edici değildir yapılıyorsa, o zaman sorun stok kollajen çözümü ile yatıyor. Hazır kolajen çözeltisi 4 ° C'da 6 aylık bir listelenen bir raf ömrüne sahip olmasına rağmen, bunun 3D jeller için kullanıldığında ticari kaynaklardan İstem daha kısadır olduğunu bulmuşlardır. Yeni bir sürü eski şişe ve sipariş atın. üreticiden kollajen kalite sürü sürü önemli farklılıklar için anormal değildir.
Kaliteli kolajen jelleri belirlemenin yanı sıra, PDMS mikrokanalda içinde iyi uyum nesil için kritik adımları belirlemek için de önemlidir. Bu tekniğin altında yatan ilke olduğunu coll oranımikrokanal ile Agen akışı daha sonra filament hizalama indükler. Bu nedenle, lif hizalama derecesini kontrol en önemli nokta, vakum basıncı uygun modülasyonudur. Bir mikrokanalda rastgele kollajen uyum için, vakum basıncı düşük olmalı ve kollajen kanal aşağı yavaş yavaş akması gerekir. kolajen çok hızlı bir şekilde akar ise, lifleri hizalamak için başlar. Daha geniş bir kanal bu önerme kolaylaştırır. Bunun aksine, iyi bir kolajen uyum için, daha yüksek vakum basınçları kullanılmalıdır ve kolajen çözeltisi daha hızlı bir şekilde çekilmesi gerekir. hizalanmış matris nesil ikinci kritik bir adım sıcaklığıdır. Bütün parça ve çözeltiler kullanımdan önce buz üzerinde soğutulmuş emin olmak için önemlidir. Kanallar, kullanımdan önce soğutulmuş değilse, kanal kollajen çok hızlı bir şekilde polimerize olur, ve daha ince, daha küçük bir elyaf ile sonuçlanacaktır. nötralize kollajen 4 ° C'de soğutulmuş ve değilse buz üzerinde, donanýmlrned çekirdeklenme akışı ile uyum sağlamak daha zor olan büyük lif çapları yol açacaktır. Microchannel kendini soğuk da önemlidir. önce soğutma olmadan, kollajen küçük hacimli kötü sonuçlar veren çok hızlı ısıtacaktır.
kollajen mikrokanallar çok yararlı bir tekniktir, ancak bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, bir akış kaynaklı mikrokanalda uyum mükemmel asla ve gerinme-uyarılı hizalama tekniği eşit asla. Her zaman akış yönüne dik yönelik bazı lifler olabilir, ama kullanım tekrarlanabilirliği, uyum ve kullanım kolaylığı kanalı içinde uyum küçük varyasyonları daha ağır olacaktır. Daha da önemlisi, hücreler etkili bir hizada küçük değişiklikler duyu ve bu kanallar 3,15 daha kararlı göç yanıt gösterilmiştir. sayıları artırmak ve göç başlar gibi hücreleri de kanalın uyum artıracaktır. daha hizalama i iseGerekli s, PDMS mikrokanallar kolayca dar boyutlara değiştirilebilir veya hizalama geliştirmek için küçük bir daralması için. Her ikisi de etkili olabilir, ancak diğer ilişkili dengeler 16 sahip olduğu gösterilmiştir. Mikrokanal tekniğine başka bir sınırlama PDMS kanalı ilaç ya da floresan boyalar az geçirgenliğe sahip olmasıdır. Bu bu bileşikler şaşırtıcı yavaş limanlarından gelen kanal aşağı yaygın gerekir ve tedavileri dışarı yıkama zorluk teşkil anlamına gelir.
Bu mikro platforma belirli sınırlamalar vardır rağmen, mevcut tekniklere göre birçok avantaj teklif yok. O hantal aletler 3,13 veya hizalama üreten hücrelerin küçük popülasyonlarını gerektirmez gibi daha deneysel erişilebilir. Ayrıca otofloresan olma eğilimindedir ve yapay olarak kollojen ağ, çapraz olabilir dışsal manyetik boncuklar 13,14 gerektirmez. kolajen Mikrokanallı olduğunuAyrıca, sadece daha düşük maliyetli ve ekonomik. Geçerli avantajlarının yanı sıra, aynı zamanda gelecekteki uygulamalarda kaldıraçlı olabilir sayısız yararları vardır. İlk olarak, kolajen mikro tasarlanabilir ya da hemen hemen herhangi bir konfigürasyonda veya deney değiştirilemez. Gelişmiş tasarımlar kanallar basitleştirilmiş organ veya tümörlerin 22 mimarisi taklit etmek içi boş kollajen tüpleri veya 3D yapılar oluşturmak için izin verir. Ayrıca, kanal PDMS dışındaki malzemelerden imal edilebilir. Bu potansiyel gömülü kollajen ağları veya matrisler farklı mekanik özellikler iletmek olabilir. Son olarak, bu deney için kullanılan reaktiflerin az miktarda daha küçük, yüksek verimli taramalar için çekici ve ekonomik bir hale getirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok
Acknowledgments
Yazarlar bu çalışmayı finanse edilmesi için hibe numaraları UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 ve T32-GM008692-18 kabul etmek istiyorum. Biz de BT-YANGIN analizi ile geliştirilmesi ve yardım için loci Jeremy Bredfelt ve Yuming Liu kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M.
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
- Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
- Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
- Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
- Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
- Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).
